PMN E INFIAMMAZIONE NELL’ATH

I PMN rappresentano un componente importante della risposta immunitaria innata. Queste cellule fagocitarie sono coinvolte principalmente nell’infiammazione acuta inglobando il tessuto danneggiato e i batteri, secernendo enzimi proteolitici come elastasi e metalloproteinasi della matrice. Per quanto riguarda le alterazioni funzionali che si verificano a livello cellulare nell’ATH, un primo intervento dei PMN, associato ad un aumento dello stress ossidativo e al rilascio di citochine pro-infiammatorie, è stata descritto sia nel modello animale che in quello umano con alto rischio cardiovascolare, ipercolesterolemia, ipertensione, diabete e insufficienza renale (1;2). L’ipercolesterolemia causa un incremento della conta dei monociti ed ei neutrofili circolanti e rende queste cellule più soggette alla migrazione all’interno della placca aterosclerotica (3). L’ipercolesterolemia è una patologia multifattoriale e i PMN infiltrano le arterie precocemente durante le fasi iniziali dell’ATH. Questi dati suggeriscono l’importanza del ruolo di queste cellule nell’inizio dell’ATH (4). L’implicazione delle cellule infiammatorie, come macrofagi e cellule T, nell’aterogenesi è ben documentata (5). Il primo evento nell’ATH è la ritenzione delle lipoproteine ossidate ad alta densità (LDLox) nello spazio subendoteliale innescando una risposta immunitaria che porta alla disfunzione delle cellule endoteliali (CE) e ad un incremento dell’interazione cellule immunitarie-EC, portando all’amplificazione della cascata infiammatoria (6). E’ ben noto che durante le fasi iniziali dell’ATH, i leucociti sono richiamati all’interno del vaso tutto intorno all’endotelio integro che esprime molecole di adesione (7) e la transmigrazione delle cellule è guidata da fattori chemotattici prodotti nello strato subendoteliale e/o dalle cellule infiammatorie. In questo contesto, l’interleuchina (IL)-8 prodotta da monociti e leucociti polimorfonucleati (PMN) gioca un ruolo chiave agendo in modo autocrino/paricrino, potenziando la risposta infiammatoria sistemica e locale reclutando le cellule infiammatorie. L’IL-8 presumibilmente stimola l’ATH attraverso l’incremento dell’adesione monociti-endotelio (8), attraverso la propria azione mitogena e chemoattrattante sulle cellule muscolari lisce (9), e mediando l’angiogenesi nella placca aterosclerotica (10).

I PMN sono effettori ubiquitari in condizioni diverse e sono i principali produttori di mediatori proinfiammmatori come l’IL-8, le metalloproteinasi, e le specie reattive dell’ossigeno (ROS) (11). In alcuni nostri lavori abbiamo dimostrato che le cellule immunitarie subiscono cambiamenti funzionali in soggetti sani ad alto rischio cardiovascolare (12;13;14;15) e che queste risposte funzionali sono modulate dal trattamento farmacologico.

52 I PMN, come i monociti, sono cellule fagocitarie implicate nell’immunità innata (16). Rispetto al riconoscimento e alla distruzione del patogeno, i neutrofili contribuiscono al danno tissutale liberando enzimi, come mieloperossidasi, elastasi, esterasi, e la metalloproteinasi della matrice (MMP)-9 (17). Recentemente, sono stati pubblicati molti dati circa la pentrassina 3 (PTX3), un componente essenziale del sistema umorale dell’immunità innata. Le pentrassine sono una superfamiglia di proteine della fase acuta altamente conservate durante l’evoluzione e che possono essere classificate come pentrassine corte, come la proteina C-reattiva e pentrassine lunghe come PTX3. PTX3 come la PCR, sono marcatori dell’ATH e correlano con i fattori di rischio per lo svilupparsi di eventi vascolari (18). PTX3 è sintetizzata localmente nel sito dell’infiammazione da diverse tipi cellulari dopo esposizione a stimoli diversi e componenti microbici, inclusi il lipopolisaccaride (LPS) (19;20). Stimoli infiammatori, quali l’IL-1β, l’LPS, inducono l’espressione di PTX3 in un gran numero di tipi cellulari diversi come per esempio nelle CE vascolari, nelle cellule muscolari lisce (SMC), nelle cellule dendritiche (DCs), negli adipociti, e i sinoviociti (21). I PMNs non esprimono l’mRNA di PTX3 nelle cellule in condizioni basali o dopo stimolazione (22), tuttavia, un accumulo intracellulare della proteina funzionale è presente in specifici granuli lattoferrina-positivi dei neutrofili umani (23). Dopo il riconoscimento microbico, PTX3 viene liberato dai granuli dei PMN e si localizza in granuli extracellulari che protrudono dai PMN attivati (24;25).

I PMNs sono presenti nella lesione aterosclerotica anche se sembra in numero molto ridotto. Queste cellule insieme ai mediatori derivati da essi sono stati recentemente descritti nella lesione aterosclerotica di campioni umani e nei modelli animali di aterosclerosi (26;27). I PMN sono stati trovati infiltrati a livello del cappuccio della placca, e nelle aree attorno alla media (28). Il numero dei PMN è fortemente associato alle caratteristiche istopatologiche di rottura della lesione aterosclerotica e suggerisce un ruolo dei PMN nella destabilizzazione della placca (28). In uno dei primi studi di cui mi sono occupata durante il mio corso di dottorato, abbiamo visto che i PMN circolanti di pazienti sottoposti a endoarterectomia (TEA) femorale mostrano una funzionalità alterata rispetto a soggetti sani (allegato 4; 29). Questo dato è apparentemente in contrasto con i dati che dimostrano uno stato infiammatorio elevato in questa categoria di pazienti e ci ha portato ad ipotizzare che il ruolo dei PMN in una fase avanzata della malattia come la placca conclamata possa essere differente da quello che queste cellule hanno nella fase iniziale della risposta infiammatoria, aprendo quindi un nuovo scenario di ricerca sul ruolo di queste cellule nelle diverse fasi del processo aterosclerotico.

53 3.1.2 PMN E STRESS NELL’ATH

Numerose evidenze indicano che l’ATH rappresenta una patologia immuno-infiammatoria dove diversi fattori potrebbero giocare un ruolo chiave. Tra gli altri fattori che potrebbero contribuire alla generazione e alla progressione della patologia, il ruolo dello stress non è molto conosciuto, in particolare quando per stress si intendono i fattori ambientali che agiscono nelle prime fasi della patologia. Lo stress attiva l’asse ipotalamo-ipofisario e il sistema nervoso simpatico (SNS), portando al rilascio di diversi neurotrasmettitori e ormoni come i glucocorticoidi e le catecolamine (CAs) che possono influenzare negativamente il sistema cardiovascolare e come conseguenza accelerare la cronicità dell’ATH. La fine organizzazione nella comunicazione tra il sistema nervoso e quello immunitario si realizza principalmente attraverso le fibre simpatiche che costituiscono anche un legame tra la regolazione del sistema cardiovascolare e l’omeostasi cellulare. Le terminazioni nervose raggiungono le cellule immunitarie nei tessuti linfoidi così come le pareti dei vasi e liberano CA come noradrenalina (NA), dopamina (DA) e adrenalina (A). La farmacologia molecolare delle CA è infatti molto complessa, e offre un ampio spettro di possibili punti di modulazione delle risposte funzionali: NA e A legano una particolare categoria di recettori accoppiate a proteine-G, i recettori adrenergici (AR), inclusi gli α-1 e -2, e i β-1, -2 e -3, funzionalmente legati a secondi messaggeri intracellulari come l’cAMP, il Ca⁺⁺ (30). Circa l’80% della NA liberata dalle terminazioni nervose è riciclata mentre la rimanente rimane in circolo (31). Diversi tra questi recettori sono stati identificati sia sulle cellule immunitarie. La consapevolezza dell’importante ruolo dello stress nello svilupparsi dell’ATH solleva anche alcune questioni piuttosto critiche circa la ben nota, ma poco conosciuta associazione tra lo stress della vita quotidiana e la patologia cardiovascolare. Infatti, gli eventi infiammatori causati dallo stress contano circa il 40% dei pazienti aterosclerotici, con nessun altro rischio cardiovascolare associato (32;33). Numerose evidenze suggeriscono che lo stress prolungato e l’aumentata produzione di trasmettitori adrenergici potrebbero indurre infiammazione vascolare e probabilmente anche lo sviluppo dell’ATH (34). Tra le cellule implicate nell’ATH, i sottotipi recettoriali per le CA sono stati identificati sia sulle cellule immunitarie che su quelle endoteliali. Per esempio, l’attivazione del sistema simpatico porta ad un aumento della liberazione di IL-6 da parte delle CE. Rilevanze cliniche di questi fenomeni è indicata dalla capacità degli agenti bloccanti gli β-ADR di ridurre la produzione di IL-6 e dei livelli di proteina C-reattiva in pazienti con patologia cardiovascolare, suggerendo l’implicazione del rilascio di NA e dell’attivazione dei β-AR (35). Un ulteriore complicazione al sistema neuro-immunitario deriva da recenti osservazioni che i linfociti umani possiedono un sistema endogeno dopaminergico/adrenergico e meccanismi molecolari completi per la loro sintesi, accumulazione e rilascio (36;37). Non solo i linfociti, ma anche i neutrofili sono

54 capaci di sintetizzare CA (38), ed è stato dimostrato che questo neurotrasmettitori sono in grado di influenzare la funzione di queste cellule (39). I PMN esposti a stimoli infiammatori/infettivi mostrano un aumentata produzione non solo di CA ma anche di altri enzimi tirosina idrossilasi (TH), dopamina-beta-idrossilasi (DBH) (39). La concentrazione plasmatica della proteina heat shock di 72kDa e la sua produzione cellulare aumentano sotto condizione di stress, incluso l’esercizio fisico intenso e le cellule che producono questa proteina sono i neutrofili (40). E’ stato anche dimostrato che la concentrazione fisiologica post-esercizio fisico di NA stimola i macrofagi (41) e la funzione dei neutrofili (42), suggerendo un ruolo fisiologico importante della NA come “mediatore dello stress” o “segnale di pericolo” nella stimolazione della risposta immunitaria innata durante lo stress indotto dall’esercizio.

55 3.2SCOPO

Numerose evidenze indicano che l’ATH è causata da un processo immuno-infiammatorio cronico e che i PMN giocano un ruolo chiave nelle prime fasi della patologia prima delle tipiche manifestazione cliniche e durante la clinica destabilizzazione della patologia associate alla rottura della placca. Tuttavia, il ruolo del sistema neuro-immunitario e del sistema stressogeno non è ben conosciuto, in particolare è poco noto il ruolo esercitato dalla componente simpato-adrenergica nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH. Questo rappresenta un importante anello mancante nella conoscenza, e potrebbe suggerire un nuovo e innovativo approccio di ricerca mirato a chiarire i meccanismi molecolari e cellulari implicati sia nella disfunzione cellulare precoce e nella formazione della placca aterosclerotica e nella destabilizzazione della placca associata con la presenza sintomi clinici.

Lo scopo del presente studio in conclusione del mio corso di dottorato e che sarà il programma del mio post-dottorato,è stato quello e di individuare un possibile marker predittivo di instabilità della placca analizzando da un punto di vista funzionale i PMN, cellule che sono coinvolte nella fase iniziale del processo aterosclerotico. In particolare, questo lavoro, in quest’anno ha avuto lo scopo di chiarire l’influenza esercitata dai mediatori della stress del sistema simpatico nell’influenzare la risposta funzionale dei PMN, cellule immunitarie principalmente implicate nell’ATH ma poco studiate. In questa fase preliminare dello studio mi sono occupata di iniziare a caratterizzare nei PMN di soggetti sani la presenza del sistema adrenergico e la possibilità di modulare questo sistema attraverso stimoli che classicamente sono utilizzati in vitro per attivare queste cellule. Sono quindi stati condotti esperimenti con la stimolazione dei PMN con il peptide fMLP.

Lo studio proseguirà poi nel mio post-dottorato, sulla valutazione in vivo ed ex vivo degli effetti dello stress nelle progressione della malattia aterosclerotica. In particolare, una prima parte dello studio sarà organizzata in due fasi ed avrà lo scopo di valutare in due gruppi di soggetti: soggetti sani e soggetti ipercolesterolemici: 1) gli effetti in vitro della stimolazione con agenti stressogeni (NA e A) sulla funzione dei PMN e 2) in un modello ex vivo per studiare gli effetti dello stress (in un modello ex vivo di stress mentale) sulla funzione dei PMN. La seconda parte si pone come obiettivo la caratterizzazione delle differenze tra la funzione dei PMN e la risposta della “stimolazione in vitro” con agenti stressogeni in cellule ottenute da sangue venoso periferico e dalla placca carotidea di pazienti che presentano o no anamnesi di sintomi neurologici legati alla placca e sottoposti a TEA carotidea.

In funzione di sviluppare poi nel mio post-dottorato la parte 2 di questo progetto, in quest’ultimo anno mi sono occupata della messa a punto di un metodo innovativo che permettesse di separare i PMN da tessuto e in particolare visto lo scopo del nostro progetto, da sezioni di placca carotidea.

56 Questa prima parte della messa a punto della metodica quindi ha riguardato appunto la scelta del metodo adatto ad ottenere delle cellule che poi potessero essere valutate anche dal punto di vista funzionale per avere la possibilità di studiare eventuali differenze non solo tra cellule ottenute da placche di pazienti con grado diverso di patologia, ma anche tra cellule residenti nella placca e cellule circolanti per eventualmente evidenziare differenze funzionali che possano permettere di chiarire meglio il ruolo di queste cellule in questo tessuto.

57 3.3MATERIALIEMETODI