Valutazione della presenza dei PMN nella placca carotidea

La figura 10 mostra un’immagine di una placca carotidea, ottenuta da un paziente sottoposto a TEA, nella quale è possibile identificare i PMN mediante la marcatura del tessuto con anticorpo anti-CD66b (rosso), che è un marker specifico e distintivo dei PMN. E’ possibile inoltre notare come i PMN sia preferenzialmente localizzati nella zona vicina alla placca a differenza dell’infiltrato infiammatorio (identificato dai nuclei blu marcati con ematossilina) che invece presenta una distribuzione ben più omogenea su tutto il tessuto (figura 10).

66 3.5CONCLUSIONI

I PMN, come i monociti, sono cellule implicate nella risposta immunitaria di tipo innato. Numerose evidenze indicano che l’ATH è causata da un processo immuno-infiammatorio cronico e che i PMN giocano un ruolo chiave nelle prime fasi della patologia prima delle tipiche manifestazioni cliniche e durante la destabilizzazione della patologia associate alla rottura della placca (4). I PMN sono effettori ubiquitari in condizioni diverse e sono i principali produttori di mediatori pro-infiammatori come l’IL-8, le metalloproteinasi e i ROS (11). In alcuni nostri lavori abbiamo dimostrato che le cellule immunitarie subiscono cambiamenti funzionali in soggetti sani ad alto rischio cardiovascolare (12;13;14;15) e che queste risposte funzionali sono modulate dal trattamento farmacologico.

Diversi sono i fattori che contribuiscono allo sviluppo della patologia cardiovascolare. Tra gli altri fattori, il ruolo dello stress non è molto conosciuto, soprattutto quando per stress si intendono i fattori ambientali che agiscono nelle prime fasi della patologia. Lo stress, infatti, attiva sia l’asse ipotalamo-ipofisiario che il SNS, causando il rilascio di CA che posso agire direttamente sul sistema cardiovascolare, agendo direttamente sulle cellule immunitarie e influenzare negativamente il sistema causando, come conseguenza, un’esacerbazione della patologia aterosclerotica. Il ruolo del sistema neuro-immunitario e di quello stressogeno non è ben conosciuto, in particolare è poco noto il ruolo esercitato dalla componente simpato-adrenergica nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH.

In questa fase iniziale di questo progetto che continuerà nel mio post-doc, abbiamo innanzitutto evidenziato che i PMN esprimono, a livello di mRNA, la tirosina idrossilassi (TH), enzima limitante la sintesi delle CA, che seppur espresso a dei livelli molto bassi, è presente ma tuttavia la sua espressione genica non risulta essere modificata dallo stimolo tipico dei PMN, rappresentato dall’fMLP. Mentre i trasportatori delle catecolammine, VMAT1 e -2, sembrerebbero non essere espressi o comunque a dei livelli che non sono rilevabili con la strumentazione da noi utilizzata. Questa prima osservazione verrà ulteriormente approfondita nei prossimi mesi andando ad indagare se anche la stimolazione dei PMN con stimoli più propriamente fisiologici, e di notevole interesse nell’aterosclerosi per il ruolo importante che hanno nella progressione della malattia, quali IL-8, TNF-α e IL-1β non modificano l’espressione di TH e dei trasportatori. Dati precedenti del nostro laboratorio hanno già evidenziato che i PMN contengono catecolamine (CA) (44), pertanto parte ancora da valutare è se questo contenuto può differire nelle diverse fasi della patologia.

Pochi studi sono stati condotti sulla valutazione dell’espressione dei recettori per le CA nei PMN. In questa fase di inizio dello studio, ci siamo occupati di andare a misurare l’espressione del mRNA per i diversi recettori adrenergici nei PMN e se quest’espressione è modulabile. Ci sono lavori in

67 vivo e in vitro che suggeriscono un ruolo dei recettori β-adrenergici sui PMN, in particolare molti di questi si riferiscono ad un ruolo dei recettori β2-AR come modulatori delle funzioni dei PMN; si tratta si di lavori condotti sia in modelli animali (45) che in modelli umani (46;47), ma la maggior parte di questi studi sono condotti in maniera indiretta, cioè indagando il ruolo dei diversi recettori utilizzando degli antagonisti non selettivi o selettivi. In alcuni casi sono anche stati analizzati i livelli di espressione di questi recettori dimostrando per esempio l’assenza del recettore β1-AR e un’espressione del β2-AR nonché una sua implicazione in alcune funzioni importanti dei neutrofili quali per esempio la migrazione cellulare con un diverso effetto su soggetti di sesso diverso (48). Noi, in questo lavoro siamo andati ad indagare l’espressione genica di tutti i recettori α (α1 e α2) e βAR e dei loro diversi sottotipi (α1A, α1B e α1D, α2A, α2B e α2C,. β1, β2 e β3) I dati ottenuti mostrano un’espressione di tutti i recettori adrenergici sui PMN in condizioni basali ad eccezione dei sottotipi α2B e α2C per i quali i livelli di espressione di mRNA sono al di sotto della soglia di rilevabilità dello strumento da noi utilizzato. In particolare, mentre i sottotipi recettoriali α1 e α2 (compresi i sottotipi) e il β1 sono espressi a dei livelli molto bassi, i recettori β2 e β3-AR presentano dei livelli di espressione di mRNA più elevati già in condizioni basali. Inoltre, questi recettori, ad eccezione di α1B e α1D, subiscono un incremento della loro espressione dopo trattamento delle cellule con fMLP, che rappresenta uno stimolo di attivazione tipico dei PMN. Quest’aumento dell’espressione risulta essere particolarmente importante per i recettori β2 e β3-AR, suggerendo un loro predominante ruolo e confermando, in parte per il β2-AR, i dati di letteratura. Un aspetto che sicuramente rimane da investigare è se stimoli più appropriati e fisiologici per i PMN quali ad es IL-8 e TNF-α (che sono i tipici stimoli che in vivo attivano queste cellule) siano in grado di up-regolare l’espressione di questi recettori. Un effetto di questo tipo sarebbe sicuramente di estremo interesse perché porterebbe ad ipotizzare che in specifiche condizioni quali l’infiammazione, la risposta adrenergica può essere attivata e quindi tale via può assumere una rilevanza funzionale differente.

Nella seconda parte di questo lavoro siamo andati ad investigare l’effetto dell’adrenalina su alcune funzioni importanti dei PMN. In particolare, siamo andati a valutare la capacità di queste cellule di produrre citochine pro-infiammatori, rappresentata principalmente dal’IL-8 che è uno dei principali mediatori dei PMN e la β2-integrina che è la molecola di adesione responsabile del richiamo dei PMN a livello di sede di infiammazione. I dati ottenuti mostrano come l’adrenalina sia in grado di incrementare da 3 a 7 volte l’espressione genica sia dell’IL-8 che della b2-integrina, dopo solo 1 h di trattamento dei PMN e a delle concentrazioni nell’ordine delle nM, che come noto corrispondono alle concentrazioni fisiologiche di adrenalina circolante. Questo dato a nostro parere, di notevole interesse perché porta ad ipotizzare che il tono adrenergico è funzionalmente importante in queste cellule e che pertanto alterazioni del sistema simpatico possano portare di conseguenza anche ad

68 alterazione della funzione di queste cellule. Inoltre è ben noto che i diversi sottotipi di recettori beta e alfa ad es svolgono ruoli differenti nella modulazione del tono vascolare e sulla funzione cellulare in generale.

Dati preliminari condotti su un’altra funzione importante dei PMN, rappresentata dalla loro capacità di produrre ROS, mostrano che l’adrenalina non è in grado in condizioni basali di modificare la loro produzione basale di specie reattive dell’ossigeno e rimane però da investigare se la produzione che viene esacerbata durante uno stimolo infiammatorio è da essa modulata.

La modulazione dell’espressione dei recettori α e β-adrenergici nei neutrofili attivati e gli effetti dell'adrenalina su alcune funzioni di queste cellule suggeriscono quindi, come detto, un ruolo cruciale per le vie adrenergiche. Naturalmente, queste osservazione meritano nel futuro studi mirati per l'indagine ulteriore dell’effetto dell’adrenalina sulla modulazione delle funzioni dei PMN. Inoltre, sarà necessario investigare quale sottotipo recettoriale specifico è coinvolto nella modulazioni di queste funzioni, soprattutto in considerazione dei dati relativi ad una diversa regolazione dell’espressione dei diversi recettori. A tal proposito, saranno necessari e indispensabili esperimenti con antagonisti specifici dei diversi recettori al fine di chiarire meglio la relazione tra sistema neuro-immunitario e quello stressogeno, in particolare è poco noto il ruolo esercitato dalla componente simpato-adrenergica nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH. Questo rappresenta un importante anello mancante nella conoscenza, che potrebbe suggerire un nuovo ed innovativo approccio di ricerca mirato a chiarire i meccanismi molecolari e cellulari implicati sia nella disfunzione cellulare precoce che nella formazione della placca oltre che nella destabilizzazione della placca associata con la presenza di sintomi clinici. La conclusione di questo studio a nostro parere, potrà dare informazioni più esaustive sul ruolo esercitato dai mediatori dello stress del sistema simpatico nell’influenzare la risposta funzionale dei PMN e quindi nel favorire o inibire la progressione della formazione della placca.

Nel primo studio di cui mi sono occupata durante il mio dottorato, condotto su pazienti sottoposti ad intervento di rivascolarizzazione periferica per stenosi dell’arteria femorale (allegato 4, 29), abbiamo osservato una funzionalità alterata dei PMN circolanti rispetto alle cellule di soggetti sani. In particolare, i pazienti presentavano una ridotta produzione di IL-8 in basale e anche una ridotta responsività allo stimolo (fMLP) sia rispetto ai soggetti ad alto rischio cardiovascolare che rispetto ai soggetti sani. Sulla base di questi dati ci siamo chiesti cosa succedesse nei PMN di questi pazienti e se l’alterata funzionalità dei PMN potesse essere spiegata solo sulla base della politerapia alla quale tali pazienti sono sottoposti oppure che lo stato avanzato della patologia non sia anche la causa di una funzionalità differente di queste cellule da ricondursi a meccanismi di natura diversa, in cui sicuramente la terapia può avere un ruolo, ma non necessariamente debba essere l’unico. Che

69 i trattamenti farmacologici possano influenzare la risposta funzionale di queste cellule è ampiamente dimostrato sia dal nostro gruppo che da altri (come discusso in diverse sezioni di questo lavoro). Abbiamo quindi deciso che per dare una risposta esaustiva a questi quesiti fosse necessario poter indagare la funzione di queste cellule nel tessuto in cui possono svolgere il loro ruolo cioè nella placca dove di recente è stato dimostrata la loro presenza, sebbene ancora non siano presenti in letteratura dati sulla eventuale diversa funzione in questo tessuto. Abbiamo, quindi, messa a punto una metodica innovativa che permette di isolare i PMN da placca carotidea, che ci ha dato la possibilità di confermare l’esistenza di queste cellule nelle placche carotidee umane e per la prima volta è stato possibile eseguire valutazioni di saggi funzionali su queste cellule. I primi esperimenti condotti sulla placca carotidea ottenuta da pazienti sottoposti ad intervento di rivascolarizzazione periferica, mostrano ad una prima analisi, che questi pPMN risultano essere postivi per i marker tipici quali elastasi e IL-8 tipicamente misurati nei PMN circolanti. In questo caso la comparazione tra cellule circolanti e residenti mostra anche che i pPMN risultano avere un’espressione genica più bassa dell’IL-8 rispetto ai cPMN ottenuti dal sangue venoso periferico, dato ancora più interessante è che tale espressione è anche inferiore a quella misurata nei cPMN di controlli sani. Anche per quanto riguarda l’espressione dell’elastasi si osservano differenze tra controlli sani e pazienti ma non nei pazienti tra cPMN e pPMN. Questi primi dati, che andranno approfonditi con altre valutazioni funzionali e di fenotipo offrono nuove opportunità da un punto di vista di studio permettendo non solo di isolarle ma di mantenerle vitali al fine di valutazioni di risposta funzionale a sostanze di interesse terapeutico. Inoltre dati circa l’espressione dei PMN (CD66b) nella placca mostrano non solo la loro presenza ma soprattutto una loro diversa distribuzione rispetto alle restanti cellule dell’infiltrato infiammatorio. Infatti, mentre l’infiltrato infiammatorio presenta una distribuzione ben più omogenea, la marcatura con il CD66b risulta essere principalmente localizzata nella parte interna dell’intima verso la placca e con una localizzazione prossima a quelli che sembrerebbero essere dei neovasi. Quest’ultima osservazione ovviamente riveste un ruolo di estrema importanza in considerazione del fatto che ancora ben poco si sa sul fenomeno che porta alla neovascolarizzazione nella placca e quindi sulle possibili strategie terapeutiche per contrastarla al fine di ridurre gli accidenti cardiovascolari in soggetti con stenosi carotidea. Infatti ad oggi non ci sono ancora indicazioni sugli stimoli che potrebbero alla formazione di questi neovasi e quindi su quali potrebbero essere i possibili approcci atti a ridurla. Un aiuto e forse uno spunto può venire dai recenti dati di letteratura che almeno nei tumori mostrano un ruolo rilevante dei PMN nella neoangiogenesi.

70 3.6PROSPETTIVEFUTURE

Sulla base di quanto già detto precedentemente, sono necessari ulteriori esperimenti e nuovi approcci sperimentali per chiarire il ruolo di PMN nella malattia aterosclerotica e il coinvolgimento del sistema simpato-adrenergico nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH

In questi due anni del mio post-dottorato, il mio primo scopo sarà quello di completare e confermare questi primi dati ottenuti al fine di chiarire l’influenza esercitata dai mediatori dello stress (prima l’adrenalina e successivamente la noradrenalina) del sistema simpatico nell’influenzare la risposta funzionale dei PMN in questa patologia in particolare.

A tal fine, il mio primo obiettivo sarà:

- confermare i dati relativi all’espressione e alla modulazione dei recettori adrenergici, utilizzando, oltre all’fMLP, anche degli stimoli fisiologici dei PMN implicati nella patologia aterosclerotica, quali per esempio l’IL-8, l’IL1β e il TNF-α (47);

- dosare i livelli di catecolamine nei PMN anche in risposta a stimoli specifici;

- chiarire gli effetti dell’adrenalina sulle funzioni dei PMN, cercando anche di capire quali sono i meccanismi molecolari alla base di questa modulazione;

- utilizzare antagonisti dei recettori per chiarire quali di questi recettori è responsabile della modulazione delle funzioni dei PMN;

- chiarire l’effetto dell’adrenalina sulla produzione di ROS; quindi per esempio investigare la capacità dell’adrenalina di modulare la produzione di ROS nei PMN attivati;

- valutare l’effetto dell’adrenalina sull’adesione dei PMN all’endotelio, utilizzando come modello le HUVEC (cellule endoteliali venose di cordone ombelicale umano) che rappresentano un valido modello in vitro per lo studio della funzione endoteliale.

Una volta chiariti tutti questi punti di primaria importanza, lo studio proseguirà, durante il mio post-dottorato, sulla valutazione in vitro ed in ex vivo degli effetti dello stress sulla progressione della patologia cardiovascolare. In particolare, una prima parte dello studio sarà organizzata in due fasi ed avrà lo scopo di valutare in due gruppi di soggetti: soggetti sani e soggetti ipercolesterolemici: 1) gli effetti in vitro della stimolazione con agenti stressogeni (noradrenalina-NA e A) sulla funzione dei PMN e 2) in un modello ex vivo per studiare gli effetti dello stress (in un modello ex vivo di stress mentale) sulla funzione dei PMN. La seconda parte si pone come obiettivo la caratterizzazione delle differenze tra la funzione dei PMN e la risposta della “stimolazione in vitro” con agenti stressogeni in cellule ottenute da sangue venoso periferico e dalla placca carotidea di pazienti che presentano o no anamnesi di sintomi neurologici legati alla placca e sottoposti ad intervento di rivascolarizzazione periferica.

71 In particolare, ci focalizzeremo sui seguenti punti:

- valutare i livelli di espressione dei recettori adrenergici (NA e A) nei PMN di pazienti ipercolesterolemici e soggetti sani e pazienti con manifestazione cliniche della patologia (sintomatici vs asintomatici);

- ottenere informazioni sulla modulazione da parte di stimoli stressogeni sulla risposta funzionale dei PMN nelle diverse condizioni cliniche;

- individuare se le diverse condizioni cliniche possono influenzare la capacità dei PMN di aderire all’endotelio e se tale processo può essere influenzato dagli agenti adrenergici;

La possibilità di studiare il ruolo funzionale degli stimoli stressogeni nelle diverse condizioni cliniche così come quella di utilizzare cellule di soggetti sani e pazienti, potrebbe contribuire alla comprensione di potenziali differenze nell’attivazione cellulare durante lo stress in relazione con le diverse fasi dell’ATH. L’approccio che combina il modello in vitro ed ex vivo, con i dati clinici (soggetti sani e soggetti ipercolesterolemici), con campioni di tessuto ottenuti da pazienti sottoposti a TEA carotidea, a nostro avviso, offre la possibilità di investigare i cambiamenti fisio-patologici indotti dalla stimolazione e di indagare a che livelli molecolari gli stimoli stressogeni giocano il loro ruolo.

Infine, questa seconda parte dello studio è stato oggetto di una richiesta di finanziamento al ministero della salute (RICERCA FINALIZZATA Bando Progetti di Ricerca Giovani Ricercatori – Ricerca Finalizzata 2010) per il quale siamo in attesa di una risposta.