3. PARTE SPERIMENTALE
3.3.2 Preparazione del 2-ammino-3,4,6-tri-O-acetil-2-deossi-1-O-2-N-(etan-1-il-1-ilidene)-α D
ilidene)-α-D-glucopiranosio (28)
In un pallone a due colli da 500 ml, fiammeggiato in atmosfera di Argon, si solubilizzano 22.7 g (58.2 mmoli) di 27 in 273 ml di 1,2-dicloroetano (DCE) anidro e la soluzione è lasciata in agitazione a 50°C. Dopo 10 minuti sono aggiunti 12.4 ml (66.6 mmoli, 1.14 equiv) di TMSOTf e la soluzione rosa è lasciata in agitazione a 50°C. Dopo
56
24 ore l’analisi TLC (CHCl3-MeOH 95:5) evidenzia la completa scomparsa del prodotto di
partenza (Rf 0.43) e la formazione di un unico prodotto a Rf 0.54. La miscela di reazione è
neutralizzata con Et3N (6 ml), trasferita in un pallone ad un collo (500 ml) e concentrata a
pressione ridotta. La purificazione flash cromatografica utilizzando il sistema IsoleraFour equipaggiato con colonne di gel di silice (esano-AcOEt 1:9 + 0.1% di Et3N) del grezzo di
reazione (40 g) fornisce l’-ossazolidina 28 (18.8 g, resa 96%) chimicamente pura all’analisi NMR (1H, 13C).
L’-ossazolidina 28 è uno sciroppo giallo avente Rf 0.54 (CHCl3-MeOH
95:5) e caratteristiche chimico fisiche analoghe a quelle riportate in letteratura:40 []D +50 (c 1.4; CHCl3); 1H NMR (CDCl3): δ 5.99 (d, 1H,
J1,2 7.4 Hz, H-1), 5.23 (t,1H, J2,3=J3,4 2.6 Hz, H-3), 4.91 (bd, 1H, J4,5 9.1
Hz, H-4), 4.12 (m, 3H, H-2, H-6a, H-6b), 3.61 (m, 1H, H-5), 2.11, 2.09, 2.08 (3s, each 3H,
MeCOO, 1.98 (s, 3H, CH3); 13C NMR (CDCl3): δ 169.7, 168.7, 168.4 (3xCO), 165.8
(C=N) 98.6 (C-1), 69.5 (C-3), 67.7 (C-4), 66.7 (C-5), 64.2 (C-2), 62.6 (C-6), 20.1-19.9 (3 ×
MeCO), 13.1 (Me). I parametri NMR (1H, 13C) sono in accordo con quanto riportato in letteratura.40
3.3.3 - Sintesi del 6-bromoesil 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetil-2-desossi--D-
glucopiranoside (30)
Metodo A (a partire da 28 con CSA) - In un pallone da 10 ml, munito di
refrigerante a bolle, si solubilizzano 95.5 mg (0.29 mmoli) di 28 in 2.29 ml di DCE anidro in ambiente inerte (Argon) e la soluzione è portata alla temperatura di 80°C. Si addizionano, in successione, 27 mg (0.12 mmoli, 0.4 equiv) di CSA e 47.95 μl (0.40 mmoli, 1.4 equiv) di 6-bromo-1-esanolo 29a e la soluzione è lascia in agitazione a 80°C. Dopo 6 ore l’analisi TLC (Esano-AcOEt 0.5:9.5) evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza (Rf 0.33) e la comparsa di un prodotto a Rf 0.41. Dopo neutralizzazione della
miscela di reazione con Et3N (1 ml) ed eliminazione dei solventi a pressione ridotta si
ottiene un grezzo (234.5 mg) che viene purificato mediante flash cromatografia su colonna di silice eluendo con Esano-AcOEt 2:8. Si isola il glicoside 30 (56.3 mg, resa 38%) chimicamente puro all’analisi 1H e 13C NMR.
57
Metodo B (a partire da 28 con TMSOTf) - In un pallone schlenk a due colli da 25
ml si solubilizzano 676 mg (2.05 mmoli) di 28 in 4.8 ml di DCE anidro in ambiente inerte (Argon), si aggiungono 500 mg di setacci molecolari 4Å e si lascia la sospensione in agitazione a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti si aggiungono 409 mg (2.26 mmoli, 1.1 equiv) di 6-bromo-1-esanolo (29a) commerciale e si lascia in agitazione a temperatura ambiente e dopo 30 minuti si addizionano 186 μl (1.03 mmoli, 0.5 equiv) di TMSOTf. Dopo 24 ore l’analisi TLC (Esano-AcOEt 2:8) evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza (Rf 0.31) e la formazione di un prodotto prevalente a Rf 0.20. Si neutralizza la
miscela di reazione con Et3N (0.5 ml), si diluisce con CH2Cl2 (4 ml), si filtra su strato di
celite e il filtrato, concentrato a pressione ridotta, fornisce un grezzo sciropposo (882 mg) che viene purificato mediante flash cromatografia su colonna di silice eluendo con Esano- AcOEt 1:9. Si isola il glicoside 30 (474.5 mg, resa 45%) chimicamente puro all’analisi 1H e 13C NMR.
Il glicoside 30 è un solido bianco avente Rf 0.27 (Esano-
AcOEt 2:8); p.f. 130-132 °C; 1H NMR (CD3CN): δ 6.52 (d,
1H, J2,NH 9.3 Hz, NH), 5.14 (dd, 1H, J2,3 10.6 Hz, J3,4 9.4 Hz,
H-3), 4.92 (dd, 1H, J4,5 9.9 Hz, H-4), 4.60 (d, 1H, J1,2 8.5 Hz, H-1), 4.21 (dd, 1H, J5,6b 5.0
Hz, J6a,6b 12.3 Hz, H-6b), 4.03 (dd, 1H, J5,6a 2.5 Hz, H-6a), 3.83-3.70 (m, 3H, H-2, H-5,
CH2O), 3.48 (dt, 1H, Jgem=10.0 Hz, Jvic=6.4 Hz, CH2O), 3.46 (t, 2H, Jvic =6.8 Hz, CH2Br), 2.00, 1.96, 1.93 (3s, each 3H, MeCOO), 1.85-1.85 (m, 2H, CH2CH2Br), 1.81 (s, 3H,
MeCON), 1.60-1.50 (m, 2H, CH2CH2O), 1.40-1.25 [m, 4H, (CH2)2]; 13C NMR (CD3CN): δ
171.2, 171.0, 170.7, 170.5 (4 × C=O), 101.2 (C-1), 73.5 (C-3), 72.3 (C-5), 70.7 (CH2O),
69.8 (C-4), 62.9 (C-6), 54.7 (C-2), 35.2 (CH2Br), 33.4 (CH2CH2Br), 29.8 (CH2CH2O),
28.4, 25.7 (CH2), 23.1 (MeCON), 20.8 (3 × MeCOO).
3.3.4 - Tentativi di preparazione del derivato glicosidico 31
In un pallone a due colli si solubilizzano 200 mg (0.626 mmoli) di -ossazolidina 28 in 1.5 ml di DCE anidro, si aggiungono 200 mg di setacci molecolari 4Å e si lascia in agitazione a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti si addizionano 130 mg (0.672 mmoli, 1.1 equiv) dell’alcol 29b, già disponibile in laboratorio, e si lascia in agitazione in ambiente inerte. Dopo 30 minuti si trattata la sospensione con 55 μl (0.329 mmoli,
58
0.5equiv) di TMSOTf e si lascia in agitazione a temperatura ambiente. Dopo 48 ore l’analisi TLC (Esano-AcOEt 5:95) evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza (Rf
0.35) e la comparsa di un prodotto a Rf 0.23. Si neutralizza la miscela di reazione con Et3N
(0.5 ml), si diluisce con CH2Cl2 (4 ml), si filtra su strato di celite e il filtrato, concentrato a
pressione ridotta, fornisce un grezzo sciropposo (453 mg) che viene purificato mediante flash cromatografia su colonna di silice eluendo con Esano-AcOEt 5:95. Si isola l’emiacetale 32 (186 mg, resa 80%), chimicamente puro all’analisi 1H e 13C NMR,
formatesi per idrolisi dell’-ossazolidina 28.
Il derivato 13 è una schiuma bianca avente Rf 0.23 (Esano-AcOEt 5:95)
e caratteristiche chimico-fisiche in accordo con quanto riportato in letteratura.41,44 1H NMR (CDCl3): δ 6.28 (d, 1H, J2,NH = 9.8 Hz, NH),
5.21 (dd, 1H, J2,3 = 10.1 Hz, J3,4 = 9.8 Hz, H-3), 5.14 (d, 1H, J1,2 = 2.8 Hz, H-1), 4.98 (dd,
1H, J4,5 = 9.6 Hz, H-4), 4.24-3.98 (m, 4H, H-6a, H-6b, H-2, H-5), 2.04, 1.98, 1.97 (3s, each 3H, 3×MeCOO);1.89 (s, 3H, MeCON); 13C NMR (CDCl3): δ 171.9, 171.7, 170.6, 170.2
(4×C=O), 91.9 (C-1), 71.6 (C-3), 69.0 (C-5), 67.8 (C-4), 62.8 (C-6), 52.9 (C-2), 23.5 (MeCON), 21.3, 21.2, 21.1 (3 × MeCOO). I parametri NMR (1H, 13C) sono in accordo con quanto riportato in letteratura.41,44
3.3.5 - Sintesi del 6-bromoesil 2-acetamido-2-desossi--D-glucopiranoside (33)
In un pallone si solubilizzano 104 mg (0.204 mmoli) di 30 in 2.0 ml di una soluzione costituita da una NH3•MeOH (7N) e MeOH in rapporto 1:1 e la miscela ottenuta è lasciata
in agitazione a temperatura ambiente. Dopo 7 ore l’analisi TLC (CHCl3-MeOH 8:2)
evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza 33 (Rf 0.80) e la formazione di un unico
prodotto meno mobile su silice (Rf 0.46). Dopo eliminazione dei reagenti per
coevaporazione con toluene a pressione ridotta (4 × 8 ml) si ottiene un residuo (82 mg) viene purificato attraverso triturazione con Et2O anidro (3 × 4 ml). Si isola il triolo 33 (75.7
59
Il triolo 33 è un solido bianco avente Rf 0.46 (CH3Cl-MeOH
8:2). 1H NMR (CD
3OD-CDCl3): δ 7.75 (bd, 1H, NH), 4.42
(d, 1H, J1,2 8.2 Hz, H-1), 4.20-3.10 (m, 10H, H-2, H-3, H-4,
H-5, H-6a, H-6b, CH2O, CH2Br), 2.20-1.80 (m, 5H, MeCON, CH2CH2O), 1.75-1.21 [m,
6H, CH2CH2Br, CH2(CH2)2O, CH2(CH2)2Br]; 13C NMR (CD3OD-CDCl3): δ 174.4 (C=O),
103.1 (C-1), 78.0, 76.6, 72.8 (C-3, C-5, C-4), 71.3 (CH2O), 63.5 (C-6), 58.0 (C-2), 35.3
(CH2Br), 34.5 (CH2CH2O), 31.1 (CH2CH2Br), 29.6 [CH2(CH2)2O], 26.9 [CH2(CH2)2Br],
24.3 (MeCON).
3.3.6 - Sintesi del 6-bromoesil 2-acetamido-6-O-t-butildifenilsilil-2-desossi--D-
glucopiranoside (17)
In un pallone si solubilizzano 75.7 mg (0.20 mmoli) di triolo 33 in 770 μl di piridina anidra e la soluzione, trattata con 70.4 mg (0.26 mmoli, 1.3 equiv) di TBDPSCl, è lasciata in agitazione a temperatura ambiente. Dopo 6 ore, l’analisi TLC (CHCl3-MEOH 8:2)
evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza (Rf 0.25) e la formazione di un prodotto
prevalente a Rf 0.47. La miscela di reazione è diluita con CH2Cl2 (50 ml), lavata prima con
una soluzione acquosa di HCl al 5% (50 ml) per eliminare la piridina, successivamente con una soluzione acquosa satura di NaHCO3 (50 ml) e poi con una soluzione acquosa satura di
NaCl (50 ml). Si separano le fasi e quella acquosa è ulteriormente estratta con CH2Cl2 (3 ×
30 ml). Le fasi organiche riunite, anidrificate con MgSO4, filtrate ed evaporate a pressione
ridotta forniscono un grezzo sciropposo (201 mg) che, purificato mediante flash cromatografia su gel di silice (esano-AcOEt 95:5 + 0.1% Et3N) permette di isolare il
derivato 17 (73.7 mg, resa 60%) chimicamente puro all’analisi 1H e 13C NMR.
Il diolo 17 è uno sciroppo avente Rf 0.47 (CHCl3-MEOH
8:2); 1H NMR (CD 3OD): δ 7.75 e 7.35 (2m, 11H, Ar-H, NH), 4.39 (d, 1H, J1,2 8.3 Hz, H-1), 4.00 (dd, 1H, J6a,6b 11.5 Hz, J5,6b 2.3 Hz, H-6b), 3.92 (dd, 1H, J5,61 3.9 Hz, H-6a), 3.82 (m, 1H, H-2), 3.55-3.31 (m, 7H, H-3, H-4, H-5, CH2O, CH2Br), 2.25 (m, 2H, CH2CH2O), 1.89 (s, 3H, MeCON), 1.70-1.20 [m, 6H, CH2CH2Br, CH2(CH2)2O, CH2(CH2)2Br], 1.02 (s, 9H, Me3C]; 13C NMR (CD3OD): δ 173.4 (C=O), 136.1, 130.2, 128.5 (Ar-CH); 134.8, 134.5 (2 × Ar-C), 103.2
60
(C-1), 78.2, 76.4, 71.8 (C-3, C-5, C-4), 71.0 (CH2O), 65.7 (C-6), 57.8 (C-2), 35.1 (CH2Br),
34.3 (CH2CH2O), 31.7 (CH2CH2Br), 29.4 [CH2(CH2)2O], 27.3 (Me3C); 26.2
61
4. Bibliografia
1. Rudd, P.M.; Elliot, T.; Cresswell, P; Wilson, I.A.; Dwek, R.A. Science 2001, 291, 2370.
2. McLoughlin, R.M. and Kasper, D.L.; ꞌꞌImmunomodulation by zwitterionic
polysaccharidesꞌꞌ in Microbial Glycobiology: Structures, relevance and Applications, Ed, Mooran, A.P.; Holst, O.; Brennan, P.J. Elsevier Inc.2009, 957-
979.
3. Morelli, L.; Poletti, L.; Lay, L.; Eur. J. Org. Chem. 2011, 5723-5777 e riferimenti citati.
4. Vliegenthart, J.F.G. FEBS Letter, 2006, 580, 2945-2950.
5. Pier, G.B., Lyczak, J.B., Wetzler, L.M., ꞌꞌImmunologia, Infezione, Immunitàꞌꞌ Ed. Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova, 2006.
6. Avci, F.Y.; Kasper, D.L., Annu. Rev. Immunol. 2010, 28, 107-130. 7. Weintraub, A. Carbohydr. Res. 2003, 338, 2539.
8. Wong, C.H. ꞌꞌCarbohydrate-Based Drug Discoveryꞌꞌ, Ed. Wiley-VCH: Weinheim,
2003.
9. Abbas, A.K.; Lichtman A.H. ꞌꞌFondamenti di Immunologia, Funzioni ed Alterazioni
del Sistema Immunitarioꞌꞌ Ed. Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova, 2003, cap. 1-
2.
10. Stephen, T.L.; Groneck, L.; Kalka-Moll, W.M., Intern.J. Microb., 2010, 1-12 e riferimenti citati.
11. Jenning, H.J. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 1983, 17, 305 e riferimenti citati. 12. (a) Paton, J.C.; Lock, R.A.; Hansman, D.J.; Infect. Immun. 1983, 40, 548-552, (b)
Ferrante, A.; Rowan-Kelly, B.; Paton, J.C.; Infect. Immun, 1984, 46, 585-589. 13. Andersson B, Porras O, Hanson LA, Lagergård T, Svanborg-Edén C, J. Infect. Dis.
1986, 153(2), 232-7.
14. (a) Winkelstein, J.A.; Tomasz, A. J. Immunol. 1977, 118, 451-454 (b)
62
15. Andersson, B.; Gray, B.; Dillon, H.; Bahrmand, A.; Eden, C. J. Pediatr. Infect. Dis.
1988, 7, 476-480.
16. Truck, J.; Lazarus, R.; Clutterbuck, E.A.; Bowman, J.; Kibana, E.; Bateman, E.A.L.; Pollard, A.J. Immunology, 2013, 218, 368-372.
17. Mehr, S., Wood, N., Pediatric Respiratory Review. 2012, 13, 258-64.
18. (a) European Centre for Disease Prevention and Control. Annual epidemiological report 2014; (b)Vaccine-preventable diseases – invasive bacterial diseases. Stockholm: ECDC; 2015.
19. Clutterbuck, E.A.; Lazarus, R.; Yu, L.M.; Bowman, J.; Bateman, E.A.L.; Diggle, L.; Angus, B.; Peto, T.E.; Beverly, P.C.; Mant, D.; Pollard, A.J.; J. Infect. Dis.,
2012, 1-9.
20. Pletz, M. W.; Maus, U.; Krug, N.; Welte, T.; Lode, H. Inter.J. Antimicrob. Agents
2008, 32, 199.
21. Pilishvili, T.; Lexau, C.; Farley, M.M.; Hadler, J.; Harrison, L.H.; Bennett, N.M.; Reingold, A.; Thomas, A.; Schaffner, W.; Craig, A.S.; Smith, P.J.; Beall, B.W.; Whitney, C.G.; Moore, M.R. J. Infect. Dis. 2010, 201, 32-41.
22. Durando, P.; Faust, S.N.; Fletcher, M.; Krizova, P.; Torres, A.; Welte, T.; Clin.
Microbiol. Infect., 2013, 19, 1-9.
23. Istituto Superiore della Sanità (ISS) “Dati di sorveglianza delle malattie batteriche invasive aggiornati al 4 aprile 2016”
24. Durando, P.; Crovari, P.; Ansaldi, F.; Sticchi, L.; Sticchi, C.; Turello, V.; Marensi, L.; Giacchino, R.; Timitilli, A.; Carloni, R.; Azzari, C.; Icardi, G. Vaccine. 2009,
27, 3459-62.
25. (a) Azzari, C.; Moriondo, M.; Cortimiglia, M.; Valleriani, C.; Canessa, C.; Indolfi, G.; Ricci, S.; Nieddu, F.; De Martino, M.; Resti, M. Vaccine, 2012, 30, 2701-2705; (b) Ansaldi, F.; De Florentiis, D.; Canepa, P.; Zancollim M.; Martini, M.; Orsi, A.; Durando, P.; Icardi, G. Vaccine 2012, 30, 2288-94.
26. Durando, P.; Rosselli, R.; Cremonesi, I.; Orsi, A.; Albanese, E.; Barberis, I.; Paganino, C.; Trucchi, C.; Martini, M.; Marensi, L.; Turello, V.; Study Group, T.L.; Bregante, A.; Cacciani, R.; Iudici, R.; La Marca, D.; Pedano, L.; Petrucci, A.
63
F.; Santolini, M.; Sbisa, V.; Zacconi, M. Human Vaccines & Immunotherapeutics
2015, 11, 172.
27. Bonaccorsi, F.; Catelani, G.; Oscarson, S. Carbohydr. Res., 2009, 344, 1442-1448. 28. (a) Chiara Esposto, Tesi di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche,
Dipartimento di Farmacia, a.a. 2009-2010; (b) Gragnani, T. PhD Thesis 2014, Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa.
29. Safari, D.; Dekker, H. A. T; Joosten, J. A. F.; Michalik, D.; Carvalho de Souza, A.; Adamo, R.; Lahmann, M.; Sundgren, A.; Oscarson, S.; Kamerling, J. P.; Snippe, H.; Infect. Immun., 2008, 76, 4615-4623.
30. Akhmatova, N.K.; Kurbatova, E.A.; Akhmatov, E.A.; Egorova, N.B.; Logunov, D.Y.; Gening, M.L.; Sukhova, E.V.; Yashunsky, D.V.; Tsvetkov, Y.E.; Nifantiev, N.E. Frontiers in Immunology 2016, 7, 248.
31. (a) Troy, E.B.; Kasper D.L. Front Biosci. 2011, 15, 25-34; (b) Stephen, T.L.; Groneck, L.; Kalka-Moll, W.M.; Int. J. Microb., 2010, doi:10.1155/2010/917075; (c) McLoughlin, R.M.; Kasper D.L. Microbial Glycobiology 2009, 49, 957-980. 32. (a) Gallorini, S.; Berti, F.; Parente, P.; Baronio, R.; Aprea, S.; D’oro, U.; Pizza, M.;
Telford, J.L.; Wack, A. J. Immunol. 2007, 179, 8208; (b) Gallorini, S.; Berti, F.; Mancuso, G.; Cozzi, R.; Tortoli, M.; Volpini, G.; Telforda, J.L.; Beninati, C.; Maione D.; Wacka, A. PNAS, 2009, 106, 17481-17486; (c) Wack, A.; Gallorini, S.
Immunopharmacology Immunotoxicology 2008, 30, 761.
33. (a) Gragnani, T.; Catelani, G.; D’andrea, F.; Esposto, C.; Giorgelli, F., XIII
Convegno-Scuola sulla Chimica dei Carboidrati, Pontignano (SI), 24-27 Giugno
2012, PC14; Gragnani, T.; Catelani, G.; D’andrea, F.; Esposto, C.; Griselli, A.;
Legnani, L.; Toma, L. 26° International Carbohydrate Symposium, Madrid (Spagna), 22-27 July 2012, P046.
34. Fügedi, P. in ꞌꞌThe Organic Chemistry of Sugarsꞌꞌ 1° Ed., Ed. Levi, D.E.; Fügedi, P.
2005, Taylor & Francis Group, p. 89.
35. Demchenko, A.V. Current organic chemistry 2003, 7, 35.
36. Levy, D.E.; Fügedi, P. The Organic Chemistry of Sugars; CRC Press, 2005.
37. Oscarson, S. in ꞌꞌCarbohydrate in Chemistry and Biologyꞌꞌ Ed. Ernst, B.; Hart, G.W.; Sinaӱ, P. 1° Ed., 2000, Wiley-VCH, p. 93.
64
38. Joosten, J.A.F.; Evers, B.; van Summeren, R.P.; Kamerling, J.P.; Vliegenthart, J.F.G., Eur. J. Org. Chem. 2003, 3569-3586.
39. Ferreira, S.B.; Sodero, A.C.; Cardoso, M.F.; Lima, E.S.; Kaiser, C.R.; Silva, F.P.; Ferreira, V.F. J. Med. Chem., 2010, 53, 2364.
40. Chambers, D.J. Tetrahedron, 2004, 60, 8411-8419. 41. Coxon, B. Carbohydr. Res. 2005, 340, 1714-1721.
42. Nakabayashi, S.; Warren, C.D.; Jeanloz, R.W. Carbohydr. Res. 1986, 150, C7-C10. 43. (a) Warren, C.D.; Shaban, M.A.E.; Jeanloz, R.W. Carbohydr. Res. 1977, 59, 427-
448; (b) Hesek, D.; Suvorov, M.; Morio, K-I.; Lee, M.; Brown, S.; Vakulenko, S.B.; Mobashery, S. J. Org. Chem. 2004, 69, 778-784.
44. Sudibya, H.G.; Jimei Ma, J.; Dong, X.; 1,3, Ng, S.; Li; L.-J.; Liu, X.-W.; Chen, P.
Angew. Chim. Int. Ed. 2009, 48, 2723-2726.
45. Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. in “Protective groups in organic synthesis” 4°Ed.,
2007, Wiley-Interscience.
46. Perrin, D.D.; Armarengo, W.L.F.; Perrin, D.R. Purification of Laboratory Chemicals, 2nd Ed., Pergamon, Oxford, 1980.