Procedure del saggio

Prima della separazione elettroforetica dei campioni in SDS-PAGE (SDS- poliacrilammide gel elettroforesi) deve essere preparato il gel di poliacrilammide. Esso è costituito dalle seguenti sostanze:

• H2OdeionizzatamilliQ

• Tris/HCl per stacking gel (concentrazione finale 0,125 M, pH 6.8) • Tris/HCl per running gel (concentrazione finale 0,375 M, pH 8.8) • Acrilammide al 30 %

50 • SDS al 10%

• APS (ammonio persolfato) (0.1g/ml) • TEMED (tetrametiletilendiammina)

Il gel si compone di due parti: il running gel e lo stacking gel. Il primo è la porzione di gel dove avviene la vera e propria separazione elettroforetica; il secondo invece, posto nella parte superiore, rappresenta la porzione di gel dove vengono creati i pozzetti di caricamento e consente di “impaccare” i campioni caricati in modo che arrivino uniformemente sul fronte della corsa. Due lastre di vetro vengono posizionate negli appositi supporti e distanziati da opportuni spaziatori. Si formano così delle camere che sono posizionate verticalmente, in modo da contenere il gel al loro interno. Una volta preparata la soluzione di running gel (con 12% di acrilammide), questa è velocemente colata nell’intercapedine e ricoperta da circa 200 µl di butanolo, la cui funzione è quella di uniformare la superficie della soluzione ed evitare il contatto del gel con l’aria. Quando il running gel è polimerizzato, si procede con la rimozione del butanolo e si cola la soluzione di stacking gel (acrilammide al 5%). A questo punto, si sistema sul lato superiore del gel un “pettine” di plastica che a gelificazione ultimata viene tolto, lasciando nel gel i pozzetti di alloggio per il caricamento dei campioni (figura 10).

51 Quando il gel è pronto, viene assemblato nell’apparecchio per l’elettroforesi, rappresentato dalla cella elettroforetica costituita da due vasche a contatto con le due estremità del gel. Tali vasche, contenenti ciascuna un elettrodo, vengono riempite di un tampone Tris-glicina, pH 8.3, contenente SDS (tampone di corsa o running buffer). Una volta caricati i campioni, si collega il tutto all’alimentatore, in modo da creare una differenza di potenziale tra i due elettrodi e la corsa elettroforetica è ora pronta per essere eseguita (figura

11).

Figura 11. Camera elettroforetica

Quando i campioni hanno raggiunto il fondo del gel, si smontano le camere e si prelevano i gel che sono pronti per il western blot.

Le proteine presenti sul gel di poliacrilammide vengono trasferite, grazie all’applicazione di un campo elettrico perpendicolare alla lunghezza del gel, su una membrana di nitrocellulosa (figura 12). Ciò permette una più facile analisi e individuazione delle proteine, in quanto queste ultime risultano essere depositate solo sulla superficie della membrana e non nell’intero spessore del gel.

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Figura 12. Trasferimento su membrana di nitrocellulosa

Si utilizzano membrane di nitrocellulosa della ditta Bio-Rad. Una volta assemblato il sistema, costituito dal gel, dalla nitrocellulosa e da carta da filtro sia dal lato del gel che da quello della nitrocellulosa (figura 12), questo viene posizionato nel Trans-Blot Turbo transfer system della Bio-Rad (figura 13). Completata questa fase le membrane di nitrocellulosa sono pronte per la colorazione al rutenio.

Figura 13. TRANS-BLOT TURBO, transfer system

Al fine di individuare le proteine contenute nella membrana di nitrocellulosa, si utilizza un colorante fluorescente (rutenio), contenente fluoroforo, in grado

53 di assorbire la radiazione elettromagnetica ed emettere radiazione elettromagnetica a lunghezza d’onda superiore. La procedura prevede questi passaggi:

• le membrane sono trasferite in una soluzione di fissaggio, costituita da acido acetico al 7% e metanolo al 10%, in cui vengono lasciate sotto agitazione continua per circa 15 minuti;

• per rimuovere la soluzione di fissaggio, si effettuano 4 lavaggi con acqua deionizzata per 5 minuti ciascuno;

• le membrane vengono, quindi, colorate con una soluzione 1 µM di RuBP (rutenio) in acido fosforico all’1% ed etanolo assoluto al 30%; si lasciano in leggera agitazione per circa 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce;

• si toglie la soluzione e si effettuano 7 lavaggi da 1 minuto con acqua deionizzata;

• si acquisisce l’immagine con il programma ImageQuant LAS4010 (GE- Healthcare)

Si passa quindi alla fase del blocking, molto importante in quanto permette di saturare le parti della membrana di nitrocellulosa che non contengono proteine; in questo modo si evita che l’anticorpo si leghi in maniera specifica alla membrana. Il blocco dei legami non specifici viene effettuato immergendo le membrane di nitrocellulosa in una soluzione di PBS/milk/Tween 20, composta da PBS pH 7.5 (10 mM NaH2PO4, 0.9% NaCl), low fat dried milk al 3%, Tween 20 allo 0.2%. Durante questa fase le membrane sono mantenute sotto agitazione continua per 1 ora a temperatura ambiente.

Si procede, quindi, con l’incubazione overnight delle membrane di nitrocellulosa con l’anticorpo primario specifico per le proteine da analizzare. L’anticorpo policlonale anti-ANXA2 od anti-ANXA5 (Cell Signaling) viene

54 sciolto nella soluzione PBS/milk/Tween 20 ad una diluizione 1: 1000. Le membrane sono poste in agitazione continua ed incubate overnight a 4°C. Terminata l’incubazione, vengono effettuati 4 lavaggi da 10 minuti con la soluzione PBS/milk/ Tween 20, in modo da rimuovere l’anticorpo primario non legato specificatamente. Si aggiunge, quindi, l’anticorpo secondario anti- IgG di coniglio (diluizione 1:10000) (Strassgene) coniugato con HRP, che va a legare l’anticorpo primario dove presente, e l’antibiotina (diluizione 1:5000) coniugata con HRP, che va a legare la biotina presente nello standard. Si lascia in incubazione per 1 ora a temperatura ambiente, in agitazione continua. Anche in questo caso, per eliminare l’eccesso di anticorpo secondario, si effettuano 4 lavaggi con PBS/milk/Tween 20 da 10 minuti ciascuno, seguiti da 2 lavaggi con PBS da 5 minuti ciascuno per eliminare tutte le proteine del latte rimaste sulla membrana. Infine, si effettua il lavaggio con acqua deionizzata per 1 minuto e la membrana è pronta per essere sviluppata.

Per lo sviluppo si utilizza una soluzione (Perkin Elmer) costituita da H2O2 ed una soluzione di Luminolo. Questo passaggio permette di rilevare la proteina riconosciuta dall’anticorpo e le proteine standard, in quanto, in presenza dell’HRP, l’H2O2 si riduce provocando l’ossidazione del Luminolo con sviluppo di N2 e radiazione elettromagnetica nel visibile. La membrana viene

incubata in questa soluzione per 1 minuto al buio e subito dopo si acquisisce in chemioluminescenza con lo strumento ImageQuant LAS4010 (Ge- Healthcare).

55 ANALISI STATISTICA

Le differenze di espressione dei potenziali biomarcatori tra i gruppi a confronto (sano vs MPM; tumore tiroideo benigno vs maligno), per ogni fluido biologico analizzato, sono state determinate utilizzando il t-test di Student tramite il programma di analisi statistica incluso nel software GraphPad Prism. I dati sono stati considerati statisticamente significativi con valori di p-value inferiori a 0,05.

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CAPITOLO 6