3 IPOSTATURALITÀ DA MUTAZIONE DEL GENE SHO
3.2 La proteina SHOX
Le caratteristiche della proteina SHOX ripercorrono le caratteristiche geniche. La proteina SHOXb è identica alla proteina SHOXa nei primi 211 amminoacidi e perde la porzione C-terminale22. Si tratta di un fattore di trascrizione che contiene al suo interno importanti domini funzionali, le cui mutazioni rappresentano la base molecolare di diverse condizioni cliniche; quest’ultime, infatti, vanno a ridurre l’attività biologica di SHOX, influenzando il suo legame al DNA, la dimerizzazione o la traslocazione nucleare della proteina40. I principali domini funzionali di SHOX (Figura 20)
sono: l’homeodomain (HD), il segnale di localizzazione nucleare (NLS), il dominio di transattivazione (OAR), il dominio di dimerizzazione e il sito di fosforilazione di SHOX.
Figura 2022. La proteina SHOX e i suoi principali domini funzionali.
Il segnale di localizzazione nucleare risiede all’interno dell’elica di riconoscimento del DNA (homeodomain) definito da cinque amminoacidi
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AKCRK 41. Poiché SHOX deve prima traslocare nel nucleo per esercitare la
sua funzione di fattore di trascrizione, diversi studi hanno stabilito l’alterazione della localizzazione nucleare come uno dei meccanismi alla base delle patologie SHOX-correlate41.
Mutazioni a carico dell’homeodomain riducono la capacità di dimerizzazione della proteina, compromettendone l’attività trascrizionale40;
l’homeodomain è, cioè, compreso nel dominio di dimerizzazione (Figura 20).
La porzione C-terminale della proteina ospita il dominio di transattivazione, necessario per l’attività trascrizionale di SHOX; l’isoforma SHOXb, che ha perso tale regione, è inattiva come fattore di trascrizione. Dall’altro lato, condividendo il solito homeodomain, può legare le stesse sequenze di DNA di SHOXa e formare eterodimeri con SHOXa modulandone l’attività42.
La proteina SHOX viene fosforilata in vivo su residui multipli di serina:
Ser106 rappresenta il principale sito di fosforilazione di SHOX43. Ser106, insieme ai residui adiacenti Glu107-Asp108-Glu109, rappresenta un sito di fosforilazione da parte della casein-kinasi II (CKII) che, preferenzialmente, fosforila la serina in regioni ricche di residui acidi 43. Specifici inibitori di
CKII riducono fortemente la fosforilazione di SHOX in vivo nelle cellule che la esprimono, modulandone l’attività trascrizionale (senza intaccarne la localizzazione nucleare e la capacità di legame al DNA) e inducendo l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi43.
SHOX è espresso nella cartilagine di accrescimento o di coniugazione, ovvero il sottile strato di cartilagine compreso tra l’epifisi e la metafisi delle ossa lunghe44, che durante la crescita staturale continua ad allungarsi per accrescimento interstiziale dal lato rivolto verso l’epifisi e ad essere
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contemporaneamente sostituita da tessuto osseo dal lato rivolto verso il centro diafisario. I due processi, di accrescimento e di ossificazione, procedono con uguale velocità, esitando in un aumento in lunghezza della diafisi. La cartilagine di accrescimento è una struttura complessa45 nella quale, procedendo dall’epifisi alla diafisi, si può riconoscere (Figura 21):
- Zona della cartilagine in riposo o di riserva, che contiene condrociti indifferenziati a riposo derivati dalle cellule
staminali mesenchimali, con morfologia tipicamente
rotondeggiante, distribuite isolatamente o in gruppi e prive di attività proliferativa. Queste cellule confinano con i condrociti della zona proliferativa di cui ne rappresentano i precursori; - Zona di proliferazione, che assicura il continuo accrescimento
in lunghezza del segmento scheletrico. I condrociti proliferano attivamente disponendosi in lunghe colonne longitudinali; questa disposizione è resa possibile dal fatto che i solchi di segmentazione delle successive divisioni cellulari sono disposti su piani tra loro paralleli. Le lacune cartilaginee in tale zona, detta zona della cartilagine seriata, sono appiattite con il loro diametro maggiore perpendicolare all’asse longitudinale dell’abbozzo cartilagineo. Questa precisa modalità di proliferazione delle cellule cartilaginee ha un preciso significato morfologico in quanto fa sì che la diafisi si accresca in lunghezza assai più rapidamente che in larghezza. I condrociti proliferanti producono grosse quantità di matrice extracellulare -collagene tipo II, IX e XI, proteoglicano aggrecano-;
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- Zona di ipertrofia o di maturazione delle cellule e di ingrandimento delle lacune, in cui la proliferazione cellulare si arresta, le cellule si ipertrofizzano, diventano vacuolizzate. Questi condrociti secernono grosse quantità di matrice extracellulare ricca in collagene tipo X. Si mantiene ancora la disposizione in colonne longitudinali ma le lacune si ingrandiscono notevolmente a spese della matrice interposta; - Zona della cartilagine calcificata o in regressione, in cui la
matrice extracellulare si calcifica e va incontro a regressione riducendosi a sottili setti interposti tra le lacune allargate, inducendo così la degenerazione delle cellule;
- Zona di invasione vascolare e di deposizione di osso, in cui le cavità longitudinali, derivanti dalla confluenza delle lacune cartilaginee, sono invase da anse capillari e da tessuto connettivo provenienti dagli spazi midollari della diafisi e vi si differenziano cellule ematopoietiche e osteoblasti, i quali depositano uno strato di tessuto osteoide che calcifica mano a mano che viene depositato. Questo processo è mediato dal rilascio, da parte dei condrociti differenziati, di fattori di
crescita endoteliali vascolari, che stimolano la
vascolarizzazione, e metalloproteinasi 13 che degrada la matrice extracellulare, favorendo l’invasione vascolare46.
Diversi ormoni, fattori paracrini, molecole della matrice extracellulare e proteine intracellulari controllano in maniera coordinata l’attività dei condrociti della cartilagine di coniugazione con diversi meccanismi22. Lo
sviluppo della placca di crescita è, infatti, influenzato da molti fattori45,47
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nucleari che rispondono ai retinoidi, agli ormoni tiroidei, agli estrogeni e androgeni, vitamina D, glucocorticoidi48, etc).
Figura 21. Sezione longituidinale di disco epifisario colorata con Alcian blu e PAS (da G. Quintarelli).
In questo complesso meccanismo, il gene SHOX rientra tra i pathway intracellulari espressi all’interno della cartilagine di accrescimento. La proteina SHOX viene espressa dalla 12ᵃ settimana di gestazione fino alla tarda infanzia49. Nel processo di ossificazione endocondrale, tale proteina si
trova espressa principalmente nei condrociti maturi ipertrofici; più irregolare è l’espressione nei condrociti della regione di riserva e di proliferazione, mentre è assente nelle cellule osteoblastiche e osteoclastiche50. In tali cellule SHOX agisce come modulatore della proliferazione cellulare e dell’apoptosi e ha un ruolo diretto nella regolazione della differenziazione dei condrociti della placca di crescita, essendo espresso soprattutto nei condrociti ipertrofici/apoptotici. Il meccanismo con cui l’espressione di SHOX induce
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l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi fu dimostrato nell’induzione di uno stress ossidativo all’interno della cellula che, a sua volta, porta a rottura della membrana lisosomiale con il rilascio di catepsina B al citosol e successiva attivazione del percorso apoptotico caratterizzato dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale e attivazione delle caspasi (processo di condroptosi); viceversa le cellule che esprimono forme mutate o tronche di SHOX non mostrano nessuna di queste attività51.
Figura 2222. Interattoma di SHOX.
La scoperta dei segnali intracellulari attivati a valle dal fattore di trascrizione SHOX ha poi fornito ulteriori delucidazioni sul complesso processo di formazione dell’osso (Figura 22). In particolare, il BNP (brain natriuretic peptide) è stato identificato come target diretto di SHOX e come mediatore
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delle sue funzioni cellulari all’interno della cartilagine di accrescimento52
(Figura 23). L’identificazione di BNP come effettore a valle di SHOX può aprire nuove potenziali vie terapeutiche per la bassa statura: come dimostrato nel topo, livelli aumentati di BNP nel siero potenziano la crescita scheletrica, in maniera analoga all’ormone della crescita e ai fattori di crescita insulino- simili, per cui una sua applicazione sistemica in combinazione con rGH nei pazienti con aploinsufficienza di SHOX potrebbe rappresentare una nuova prospettiva terapeutica52. Studi di ingegneria genetica su topi hanno mostrato che anche CNP e il suo recettore Npr2 sono espressi nella cartilagine di accrescimento (Figura 23), implicati nella regolazione della crescita endocondrale53.
Successivi studi hanno dimostrato un effetto di SHOX sull’espressione del gene del recettore del fattore di crescita fibloblastico FGFR354 (Figura 23). Mutazioni “gain of function” di FGFR3 causano l’acondroplasia, l’ipocondroplasia, caratterizzate da un accorciamento rizomelico degli arti dovuto a un’alterata ossificazione endocondrale55. Mediante l’utilizzo di
RT-PCR e ibridazione in situ, Decker e altri54 hanno dimostrato un effetto repressivo di SHOX sull’espressione di FGFR3 suggerendo una potenziale correlazione tra la bassa statura rizomelica dei pazienti con acondroplasia da mutazione di FGFR3 e SHOX54. Inoltre, SHOX, attraverso l’inibizione della
trascrizione di FGFR3, può avere un impatto sulle vie di trasduzione a valle di quest’ultimo, JAK-STAT e MAPK56.
Oltre a BNP e FGFR3, SHOX interagisce con il trio dei fattori di trascrizione
SOX (SOX5, SOX6 e SOX9)57 formando un complesso che regola la
differenziazione dei condrociti (Figura 23). Dall’interazione con il trio SOX, SHOX modula l’espressione di ACAN, che codifica per il proteoglicano aggrecano; l’aggrecano è uno dei principali componenti della matrice
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extracellulare e svolge un ruolo fondamentale nella funzione della cartilagine di accrescimento. Per questo motivo, SHOX è co-espresso con SOX5, SOX6 e SOX957.
Un altro gene up-regolato da SHOX all’interno della cartilagine di accrescimento è Ctgf (connective tissue growth factor), che contiene al suo interno diversi siti di legame di SHOX; entrambi, SHOX e Ctgf vengono coespressi nella zona ipertrofica58.
Per ciò che concerne invece i regolatori dell’espressione di SHOX, il primo a essere identificato fu HOXA959 (della famiglia dei fattori di trascrizione
HOX che svolgono un ruolo nello sviluppo scheletrico degli arti e assiale), che regola negativamente l’espressione di SHOX.
Anche RUNX2 e RUNX3 agiscono in sinergia con SHOX nello stimolare la maturazione condrocitaria tramite Bmp460.
Figura 2322. Pattern di espressione dei principali fattori cellulari coinvolti, insieme alla proteina SHOX,
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Probabilmente le funzioni svolte da SHOX durante l’embriogenesi differiscono da quelle esercitate dalla proteina in epoca postnatale: questo si deduce dal fatto che molti degli effetti dell’aploinsufficienza del gene SHOX nell’uomo si manifestano solo nella medio-tarda infanzia22.