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Bassa statura da mutazione del gene SHOX: aspetti genetici, clinici e risposta al trattamento con ormone della crescita

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Academic year: 2021

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Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia

CORSO DI LAUREA IN MEDICINA E CHIRURGIA

BASSA STATURA DA MUTAZIONE DEL GENE

SHOX: ASPETTI GENETICI, CLINICI E RISPOSTA

AL TRATTAMENTO CON ORMONE DELLA

CRESCITA

RELATORE:

Chiar.mo Prof. Peroni Diego

CANDIDATA:

CORRELATORE: Pinelli Karen

Dott. Bertelloni Silvano

(2)

A mio papà,

alla sua forza e al suo coraggio

A mia mamma,

(3)

INDICE

Riassunto………...1

1 LA VALUTAZIONE AUXOLOGICA IN ETÀ EVOLUTIVA……...4

1.1 L’accrescimento statutale………...5

1.2 La visita auxologica………….………...6

1.3 Principali fattori regolanti la crescita………...17

2 L’IPOSTATURALITÀ 2.1 Definizioni………..……19

2.2 Approccio clinico al bambino con bassa statura……….20

2.3 Principali cause di ipostaturalità ……….…...23

2.4 Trattamento con ormone della crescita ricombinante (rGH)………..25

3 IPOSTATURALITÀ DA MUTAZIONE DEL GENE SHOX 3.1 Il gene SHOX……….27

3.2 La proteina SHOX………..………....33

3.3 Varianti genetiche di SHOX………..……….41

3.4 Aspetti clinici delle patologie correlate al deficit di SHOX……….…..42

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3.6 Terapia………...49

4 OBIETTIVI DELLA TESI...50

5 PAZIENTI E METODI………...51

6 RISULTATI 6.1 Aspetti genetici………...…….53

6.2 Caratteristiche cliniche………...56

6.3 Risposta alla terapia con ormone della crescita (0-24 mesi)………...60

7 DISCUSSIONE………...64

8 CONCLUSIONI………...72

BIBLIOGRAFIA……….74

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1

RIASSUNTO

Premessa. La valutazione della crescita staturale e delle proporzioni

corporee rappresenta una componente fondamentale della valutazione auxologica in età evolutiva, poiché il riscontro di ipostaturalità (altezza inferiore al 3° centile o a -2 SDS) può sottendere una condizione patologica e richiedere un trattamento specifico. L’ipostaturalità da mutazione del gene SHOX, localizzato nella regione PAR1 del braccio corto dei cromosomi sessuali X e Y, rappresenta la causa monogenica più frequente di bassa statura (frequenza  1:300-1000). Dal momento che SHOX sfugge al meccanismo di Lyon, l’aploinsufficienza di tale gene, dovuta alla presenza di delezioni, mutazioni o duplicazioni, è in grado di causare bassa statura con un’elevata variabilità fenotipica. Le tre condizioni cliniche, ad oggi identificate, correlate al deficit di SHOX sono: la discondrosteosi di Léri-Weill (LWD), la displasia mesomelica di Langer (LD) e la bassa statura idiopatica (ISS). Dal punto di vista clinico, i bambini con diagnosi di aploinsufficienza del gene SHOX presentano parametri auxologici alla nascita (peso, lunghezza) nella norma o di poco ridotti per età e per sesso e un successivo rallentamento della crescita, già evidente dai primi anni di vita. Tuttavia, il fenotipo tipico della bassa statura disarmonica mesomelica si rende evidente con il passare degli anni, principalmente alla pubertà e nel sesso femminile. La statura adulta è variabilmente compromessa tra -4/-1 SDS, in assenza di terapia. La terapia, oggi approvata dalle agenzie regolatorie, si basa sull’ormone della crescita ricombinante (rGH) (nota AIFA 39).

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Obiettivi della tesi. Gli obiettivi di questa tesi sono stati quelli di:

 valutare, all’interno di una popolazione con bassa statura idiopatica, la frequenza e il tipo di varianti genetiche di SHOX;

 analizzare le principali caratteristiche cliniche al momento della diagnosi quali statura, velocità di crescita (VC), indice di massa corporea (BMI), età ossea;

 valutare in un sottogruppo di pazienti trattati con rGH, attraverso un follow-up a 12 e a 24 mesi, le variazioni dell’altezza, della VC e del BMI rispetto ai valori basali.

Risultati. Sono state individuate mutazioni di SHOX nel 12,1% (n=56) dei

bambini esaminati (n=463). Le mutazioni più frequentemente riscontrate sono mutazioni puntiformi introniche o esoniche, 8 delle quali de novo. In 16 casi è stata documentata una trasmissione ereditaria della mutazione. Le caratteristiche cliniche alla diagnosi sono in accordo con quanto riportato in letteratura. Il deficit staturale basale nei pazienti sottoposti al follow up è risultato pari a -1,9 SDS +0,48. Durante il trattamento, sia l’altezza che la VC hanno mostrato un significativo incremento, con un guadagno medio in altezza pari a 1 DS in assenza di effetti collaterali.

Conclusioni. L’aploinsufficienza di SHOX rappresenta un’importante causa

di bassa statura. Il background genetico nei bambini italiani sembra parzialmente differente da quello descritto in altri paesi. L’importanza di una precoce diagnosi di ipostaturalità da alterazioni del gene SHOX deriva dalla possibilità di predisporre un trattamento efficace, da confermare con un follow up a lungo termine. Una mancata diagnosi (e conseguente mancato

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3

trattamento) può avere conseguenze, oltre che sullo stato di salute della persona affetta, anche per il professionista, in quanto può determinare un contenzioso di tipo medico-legale per “malpractice”.

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1 – LA VALUTAZIONE AUXOLOGICA IN ETÀ

EVOLUTIVA

“La pediatria si differenzia dalla medicina dell’adulto per molteplici e complesse ragioni”: ci sono malattie precipue dell’età evolutiva e malattie di tutte le età che nell’età evolutiva assumono aspetti eziologici, patogenetici, clinici e terapeutici peculiari1. Tuttavia, un argomento cardine della pediatria è, da sempre, quello relativo alla crescita e allo sviluppo: la pediatria si occupa di un individuo che deve completare, negli anni, la sua crescita psico-fisica fino a raggiungere lo status di adulto.

La crescita, l’elemento caratterizzante l’età evolutiva, è dunque, secondo l’OMS, un importante indicatore di salute sia per il singolo individuo che per le popolazioni. Essa va intesa come evoluzione somatica, biologica, psicologica e sociale ed è il risultato dell’interazione tra fattori genetici, condizioni di salute, status psico-sociale e alimentazione del bambino (Fig. 1) per cui, se alterata, può essere il primo segno di un disturbo medico e/o neuropsichiatrico2. Compito fondamentale del pediatra è, dunque, valutare

accuratamente una crescita, uno sviluppo e un comportamento conformi alla norma, anche mediante periodici controlli clinici (bilanci di salute)3.

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1.1 – L’ACCRESCIMENTO STATURALE

“La crescita umana presenta due caratteristiche che la rendono sostanzialmente diversa da quella degli altri mammiferi”4, di cui la prima è rappresentata dal lungo periodo in cui la stessa si realizza e che viene a occupare buona parte delle prime due decadi di vita. La seconda è determinata dalla presenza di variazioni della velocità di crescita che è elevata e decrescente fino a 2-3 anni, lenta in una seconda fase e di nuovo marcatamente accelerata alla pubertà4 (Fig. 2). L’accrescimento staturale è dunque continuo durante tutta l’età evolutiva, ma non è lineare e costante nel tempo. Segue tempi e ritmi diversi nelle diverse età (Fig. 2)

Figura 2. Curve di accrescimento staturale. A) Statura. B) Velocità di crescita. La mediana per la

lunghezza di un neonato di sesso maschile è di 50 cm con variabilità tra 46 e 54 cm, mentre per un neonato di sesso femminile è di 49 cm con variabilità tra 45 e 53 cm5. La velocità di crescita è molto elevata dai

primi mesi di gestazione fino al secondo anno di vita, raggiungendo un picco massimo tra il 4° e il 5° mese. Successivamente si ha una decelerazione con plateau fino all’inizio della pubertà, accelerazione della crescita alla pubertà per circa tre anni e, infine, rapida caduta fino all’età adulta (15-16 anni per le femmine, 17-18 per i maschi)

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Pertanto, la valutazione della crescita staturale deve prendere in considerazione due aspetti principali: la distanza, cioè la registrazione diretta della variabile statura espressa in valore assoluto (cm) durante gli anni (linea A, Fig.2), e la velocità, cioè la determinazione delle modificazioni che tale variabile presenta in un determinato periodo di tempo, generalmente un anno (cm/anno) (linea B, Fig. 2).

L’incremento staturale nel bambino normale è sintetizzato in Figura 3. La valutazione isolata della statura di un bambino non è sufficiente per

valutare accuratamente la sua crescita; solo le valutazioni seriate indicano il tipo di accrescimento, rilevabile con misurazioni longitudinali5.

Figura 3. Altezza (o lunghezza) e velocità di crescita a differenti età. Partendo da una lunghezza alla

nascita pari a 50 cm, al 4° anno essa raddoppia, al 12° anno triplica e a 2 anni è circa la metà della statura definitiva.

1.1 – LA VISITA AUXOLOGICA

La visita auxologica, che valuta la crescita del bambino, prevede un’anamnesi accurata sotto l’aspetto della familiarità ed ereditarietà di eventi auxo-patologici, un’attenta rilevazione delle proporzioni corporee e una precisa misurazione dei parametri antropometrici4.

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L’anamnesi auxologica comprende:

- anamnesi familiare: statura e peso dei genitori, età di inizio della pubertà del padre, età del menarca della madre e regolarità dei cicli mestruali, numero di gravidanze materne precedenti, malattie su base ereditaria e/o della crescita staturale o della pubertà;

- anamnesi prenatale e perinatale: andamento della gravidanza, informazioni sulla crescita fetale, modalità del parto, età gestazionale; - anamnesi neonatale: peso, lunghezza, circonferenza cranica e stato di

salute perinatali;

- anamnesi fisiologica infantile e adolescenziale: curva di crescita staturale dalla nascita al momento della visita, curva del peso e eventuale inizio dello sviluppo puberale;

- anamnesi patologica remota: diagnosi auxopatologica precedentemente formulata (se presente), malattie infettive, interventi chirurgici, segni di malassorbimento etc.;

- anamnesi patologica prossima: sintomi e segni riscontrati per i quali si è richiesta la visita4.

La valutazione clinica deve, ovviamente, rilevare l’aspetto fisico che, alle volte, può essere tale da risultare patognomonico (diagnosi gestaltica; es. acondroplasia, sindrome di Down, Williams, Prader-Willi, etc.)

La rilevazione delle misure antropometriche deve essere molto accurata in quanto rappresenta l’aspetto qualificante della visita. Per tale motivo, tali misurazioni devono essere ottenute con apparecchi specifici la cui taratura va controllata periodicamente.

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Figura 4. Stadiometro di Harpenden per la misurazione della statura eretta.

Il rilievo della statura nei bambini al di sopra dei 3 anni di età si esegue con il soggetto in piedi con i talloni ravvicinati e con i calcagni, le natiche e le spalle appoggiati al piano dello statimetro (Fig. 4), i piedi leggermente divaricati in modo da creare un angolo di circa 45° e la testa in posizione tale che il bordo inferiore dell’orbita e il meato uditivo si trovino sullo stesso piano, detto piano di Francoforte (Fig. 5)6. Il bambino guarda avanti orizzontalmente senza abbassare né alzare la testa.

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Al momento della misurazione il soggetto viene invitato a compiere un’inspirazione profonda, mentre l’operatore lo tiene in distensione, stirando un po’ verso l’alto con le mani poste sotto i processi mastoidei (Fig. 6)4. La

statura da seduto misura il segmento superiore del corpo (tronco e testa).

Figura 6. Misurazione dell'altezza in piedi.

Al di sotto dei 3 anni, si rileva la lunghezza supina attraverso un antropometro longitudinale o paidometro (Fig. 7).

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10

Si procede, poi, alla rilevazione del peso e dello stadio di sviluppo puberale valutando nei maschi lo sviluppo della peluria sessuale, del pene e il volume testicolare7 mentre, nelle femmine, lo sviluppo pilifero del pube e quello mammario8, utilizzando la classificazione di Tanner (Fig. 8 e Fig. 9).

Dal punto di vista auxologico, è inoltre necessario effettuare una valutazione comparativa della curva di crescita staturale e di quella ponderale o dell’indice di massa corporea (BMI, kg/m2) in quanto una contemporanea

deflessione delle due curve può indirizzare verso cause riconducibili a deficit nutrizionali, come nelle malattie gastrointestinali croniche o nelle forme a insorgenza infantile o peri-puberale di anoressia nervosa.

Figura 9. Stadi di sviluppo puberale nei

maschi, secondo Tanner.

Figura 8. Stadi di sviluppo puberale nelle femmine,

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11

La valutazione dell’età ossea è un parametro strumentale importante, che esprime il grado di maturazione biologica del bambino in esame. Essa si desume attraverso un esame radiologico di un segmento scheletrico che, nella prima infanzia, è rappresentato dalle ossa del ginocchio e del tarso mentre, nelle età successive, dalle ossa del polso e della mano sinistra. Nella pratica clinica i due metodi più usati per valutare la maturazione scheletrica sono quelli di Greulich e Pyle9 (G-P) e di Tanner e Whitehouse10 (TW2). Il metodo G-P confronta Rx di mano e polso sinistro con standard forniti da un atlante di riferimento (Figura 10). Il metodo TW2, invece, assegna degli score a tutte le ossa della mano inclusi radio, ulna, carpo, metacarpo e falangi in rapporto al loro stadio di maturazione.

Per la determinazione dell’età ossea si devono prendere in considerazione: - il numero e le dimensioni dei centri epifisari;

- la dimensione, la forma, la densità e l’evidenza del contorno delle estremità delle ossa;

- la distanza che separa il nucleo epifisario e la zona di calcificazione metafisaria.

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Un’adeguata valutazione auxologica deve inoltre tenere conto dei cambiamenti nelle proporzioni corporee durante la crescita, come esemplificato in Figura 11. Infatti, ogni bambino che si presenta con disturbi della crescita dovrà essere valutato per un’alterazione delle proporzioni corporee, anche ai fini di una diagnosi differenziale atta a ricercare o a escludere la presenza di displasie scheletriche.

Figura 11. Modificazione delle proporzioni corporee durante la crescita

A tal proposito, un altro parametro auxometrico da valutare nel bambino è l’“arm span”, a volte indicato anche come apertura alare, che va misurato ponendo il paziente in piedi contro una superficie piatta, le braccia tese più lontane possibili in modo da creare un angolo di 90° con il busto, inserendo poi la distanza tra le estremità distali delle falangi medie (Fig. 12). Normalmente l’arm span è più corto dell’altezza nei maschi sotto i 10-11 anni e nelle femmine sotto gli 11-14 anni, dopo di che diventa più lungo dell’altezza. Il maschio adulto medio ha un arm span di circa 5,3 cm più lungo rispetto alla sua altezza, mentre una femmina adulta di circa 1,2 cm in più rispetto alla sua altezza11.

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Figura 12. Misurazione dell'arm span6

La determinazione della rizomelia (cioè una sproporzione della lunghezza dell’arto prossimale) può essere fatta con misurazioni del segmento prossimale e distale degli arti. La sproporzione tra braccio e avambraccio può essere determinata dalla misurazione della lunghezza spalla-gomito (SE) e gomito-metacarpo (EMC): il loro rapporto è, di norma, intorno a 1, se <1 si parla di rizomelia11. La presenza di brevità di specifiche ossa può, allo stesso modo, portare alla diagnosi di specifiche sindromi: la brevità del quarto metacarpo è un reperto frequente, ad esempio, nella sindrome di Turner, nello pseudoipoparatiroidismo e nel deficit del gene SHOX11.

La normalità delle misure antropometriche, in particolar modo la statura e la velocità di crescita, viene giudicata in riferimento a tabelle o grafici di riferimento (standard di crescita o auxometrici)4, di cui sono disponibili

standard di normalità per le varie popolazioni che, dunque, tengono conto delle differenze etniche. Per la valutazione dei parametri auxologici vengono utilizzati i grafici di distribuzione dei centili, ottenuti allineando i valori riscontrati nella popolazione per età e per sesso, o la deviazione standard (DS) che misura la dispersione dei valori rilevati intorno al valore medio. In Figura 13 è riportata graficamente la corrispondenza tra centili e DS.

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Figura 13. Equivalenza tra SDS e percentili.

Quando la valutazione del bambino ricada aldilà di -2 DS e +2 DS o del 3° e 97° centile, il paziente può richiedere approfondimenti diagnostici.

L’OMS ha recentemente elaborato delle curve di crescita valide indipendentemente dalla nazionalità in quanto ottenute su un campione di 8440 bambini, appartenenti a 6 paesi e selezionati in base a parametri rigorosi (alimentazione al seno esclusivo o predominante per almeno 4 mesi, allattamento al seno continuato fino ad almeno 12 mesi, crescita in un ambiente a scarso rischio di infezione). Inoltre, le loro madri non dovevano fumare né durante né dopo la gravidanza. Per bambini di età inferiore ai 5 anni, l’OMS raccomanda l’utilizzo delle sue carte di crescita12. Per quelli più

grandi di tale età, dovrebbero essere impiegate carte di crescita specifiche per l’area geografica di origine (Figura 14 e 15).

Nella valutazione della crescita di un bambino, si deve poi tenere conto dell’altezza dei genitori. Si definisce statura bersaglio o “target height” la statura adulta attesa sulla base della statura dei genitori, calcolabile con le formule in Tabella 1.

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1.3 – PRINCIPALI FATTORI REGOLANTI LA CRESCITA

I fattori che influenzano la crescita possono essere suddivisi in intrinseci (etnia, sesso, fattori genetici, fattori ormonali es. ormone della crescita, insulina, ormoni tiroidei e ormoni gonadici) e estrinseci (alimentazione, livello socio-economico, classe sociale, salubrità del micro-macroclima, igiene, attività motoria, assistenza sanitaria e problematiche psicologiche quali relazione madre-bambino, relazioni familiari, istituzionalizzazione). I vari ormoni agiscono in parallelo gli uni con gli altri, in sinergia o bilanciando i rispettivi effetti. Una crescita corretta è garantita da un equilibrio nella produzione di tali ormoni nelle varie età come esemplificato in Figura 16.

Il GH, che gioca un ruolo chiave nel processo accrescitivo, è una proteina formata da 191 aminoacidi, prodotta da cellule specializzate dell’adenoipofisi (cellule somatotropiche) sulle quali esercitano la loro influenza due mediatori principali, il GHRH e il GHIF, secreti dall’ipotalamo. Il GHRH stimola e il GHIF inibisce la secrezione di GH, mediante un meccanismo a feedback: l’ipofisi secerne il GH che agisce sull’ipotalamo, regolando la liberazione di GHRH e GHIF che, a loro volta, condizionano la produzione di GH.

per i maschi: statura padre + statura madre + 13 +/- 8,5 cm

2

per le femmine: statura padre + statura madre – 13 +/- 8,5

2 Tabella 1. Target staturale genetico.

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Figura 16. Cronologia d'azione dei fattori di regolazione della crescita.

(Kalberg J, Acta Paediatr Scand 356: 26, 1989; mod.)

Alla modulazione di questo fine controllo contribuisce anche l’IGF-1 (Insulin Growth Factor-1), liberato dal fegato per effetto del GH, insieme a altri fattori che esercitano, sia pur in misura minore, un’influenza sulla secrezione di GH (Tabella 2).

Tabella 2. Fattori di che influenzano la secrezione di GH.

Fattori che stimolano la secrezione di GH Fattori che riducono la secrezione di GH

Febbre Ipotiroidismo

Stress acuto Stress cronico

Elevata assunzione di proteine Obesità

Elevata secrezione di estrogeni e androgeni Iperglicemia Attività fisica breve e intensa Attività fisica prolungata Carenza di fonti di energia nell’organismo

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2 - L’IPOSTATURALITÀ

2.1 – DEFINIZIONI

Si parla di ipostaturalità quando la crescita lineare di un bambino risulta inferiore a specifici parametri di riferimento per età e sesso. In pratica, si realizza una bassa statura quando la lunghezza, in bambini al di sotto dei 2 anni, o l’altezza, in bambini di età > 3 anni, risulta inferiore al 3° centile o a -2 deviazioni standard (DS)13 (per i bambini tra i 2 e i 3 anni sarebbe opportuno rilevare sia la lunghezza da sdraiato che l’altezza in piedi). Si deve inoltre prendere in considerazione anche la situazione familiare, per cui si parla di bassa statura anche in presenza di un’altezza del bambino in esame che risulti inferiore a più di –2DS rispetto all’altezza media corretta per i genitori (calcolata con le formule riportate in Tabella 1), anche se superiore al 3° centile. Un parametro indispensabile per una corretta valutazione del bambino con bassa statura è la velocità di crescita [espressa in cm/anno= (crescita in cm x intervallo tra le due misurazioni in sett.)/ 52]; una riduzione di tale parametro è considerata patologica per valori inferiori a -1 DS per sesso e età, poiché determina una decelerazione della crescita lineare con uno spostamento verso il basso della statura (>0,5 DS/anno) sul grafico dei centili, rappresentando un segno precoce e importante della presenza di una patologia associata a ipostaturalità14.

In base a queste definizioni, il 3% dei bambini può essere definito basso e nel 10-15% tale situazione è riconducibile a una condizione patologica.

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2.2- APPROCCIO CLINICO AL BAMBINO CON BASSA STATURA

Poiché la bassa statura è un sintomo di comune riscontro in varie condizioni patologiche e non, una corretta diagnosi differenziale è fondamentale per un corretto inquadramento clinico e, se necessario, per effettuare un trattamento specifico.

Nell’inquadramento della bassa statura si deve dunque:

1. Valutare la statura dei genitori, rapportando a questi la statura del bambino;

2. Effettuare un’anamnesi accurata su decorso della gravidanza, sua durata, peso alla nascita, eventuali patologie prenatali (embrio-fetopatie infettive, abuso di alcol, deficit nutrizionali interni, esposizione a tossici ambientali, etc.);

3. Individuare l’età di inizio del rallentamento (o dell’arresto) della crescita;

4. Ricercare eventuali malattie sistemiche (nefropatie, cardiopatie, pneumopatie croniche come la fibrosi cistica, anemie croniche, diabete o gravi turbe dello sviluppo psicomotorio etc.)15.

Un’ottimale diagnosi differenziale nell’ambito delle basse stature deve quindi iniziare con un’approfondita anamnesi personale e familiare, mirata all’acquisizione dei parametri indicati nella Tabella 3.

L’aspetto generale del bambino permette di orientarsi verso tre categorie diagnostiche principali:

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21

1. Bassa statura armonica, cioè associata a caratteristiche somatiche essenzialmente normali (es. varianti normali della crescita, deficit di GH o ipopituitarismo);

2. Bassa statura disarmonica, cioè associata a proporzioni corporee

grossolanamente anomale (es. osteocondrodisplasie,

mucopolisaccaridosi, ipotiroidismo);

3. Bassa statura associata a tratti fenotipi dismorfici, come in alcune sindromi genetiche con ritardo psicoevolutivo, anche lieve, a loro volta associate (sindrome di Prader-Willi) o meno (sindrome di Noonan) ad obesità14.

Queste categorie- sebbene utili per un orientamento nella pratica ambulatoriale- non devono essere rigidamente intese, essendo presente un’ampia variabilità fenotipica e di espressività clinica anche in rapporto all’età cronologica nell’ambito dello stesso quadro patologico. L’esempio tipico di quanto detto è rappresentato dall’aploinsufficienza del gene SHOX, che si può manifestare come una bassa statura idiopatica nel bambino piccolo e come grave ipostaturalità disarmonica in età adulta, in particolare nel sesso femminile16.

Quando la causa della bassa statura non risulti evidente dai dati anamnestici e clinici, gli esami di laboratorio da effettuare possono essere di ausilio per un primo screening che potranno poi portare a valutazioni più specialistiche (Tabella 4).

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22

Tabella 3. Dati anamnestici di rilievo nel bambino con ipostaturalità.

Anamnesi Parametro da ricercare Indicazioni sulla possibile causa di bassa statura

Familiare/ prenatale

Statura genitori e collaterali Bassa statura familiare

Età di inizio pubertà genitori e collaterali Ritardo costituzionale di crescita e pubertà Patologie genetiche con bassa statura Patologia specifica endocrina, metabolica o

ossea Età materna, presenza in gravidanza di

patologie, uso di farmaci, alcol, fumo, deficit nutrizionali o diete ipocaloriche

Basso peso alla nascita o ritardo di accrescimento intrauterino, anche da associare a sindromi specifiche

Consanguineità tra i genitori Aumentato rischio di malattie genetiche

Perinatale

Peso, lunghezza e circonferenza cranica Nanismi primordiali su base genetica, malformativa, scheletrica; ritardo di accrescimento intrauterino (infezioni, malnutrizione, alcolismo, ecc.) Parto distocico/podalico Deficit di GH, sindrome di Prader-Willi

Asfissia neonatale Ipostaturalità da danno cerebrale

Ipoglicemia neonatale Panipopituitarismo, sindrome

surreno-genitale

Ittero neonatale protratto Ipotiroidismo congenito Tumefazione transitoria di piedi e mani Sindrome di Turner

Ipotonia Sindrome di Prader-Willi, patologia

neurologica

Postnatale

Livello socio-economico Carenze nutrizionali

Rapporti affettivi e socializzazione Nanismo psico-sociale

Sviluppo intellettivo Ritardo mentale può associarsi a sindromi, malattie genetiche e metaboliche

Disfagia Ipotonia, patologia neurologica

Comportamento con il cibo Anoressie infantili e dell’adolescenza Disturbi o sintomi d’organo o generali Patologia organo-specifica (es. m. di Crohn) Traumi cranici gravi Deficit acquisito di GH (+ eventualmente

altre tropine ipofisarie) Terapie farmacologiche,

neurochirurgiche, radianti

Effetti iatrogeni su secrezione di ormoni ipofisari e/o danno diretto su tessuto osseo

Età di comparsa della bassa

statura

Molto precoce (1° anno) Ipotiroidismo congenito,

panipopituitarismo, patologia organica ad esordio precoce

Precoce (2-3° anno) Bassa statura familiare, deficit di GH isolato o associato a altri deficit ipofisari, patologia d’organo o metabolica, anoressie infantili Tardivo (dopo 3° anno) Ritardo costituzionale di crescita e pubertà,

sindrome di Turner, aploinsufficienza gene SHOX, ipotiroidismo giovanile, patologia d’organo

Variabile In rapporto all’insorgenza di disturbi

organici (es. craniofaringioma, malattie intestinali croniche) o psichiatrici (es. anoressia nervosa).

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Tabella 4. Analisi di laboratorio nel bambino con ipostaturalità.

Livello Esame Funzione diagnostica Note

I PCR (VES) Infiammazione o infezioni croniche

Insieme all’anamnesi e all’esame clinico possono indirizzare verso una specifica causa alla base del ritardo di crescita e permettere di diagnosticare la causa della bassa statura in una ampia percentuale di bambini.

Emocromo Anemie, discrasie ematiche, infezioni

Creatinina, elettroliti

Patologie renali, sindrome di Bartter/Gitelman

Calcemia, PTH Rachitismo vitamina D resistente, pseudoipoparatiroidismo Fosforemia Rachitismo iposfatemico Transaminasi Patologie epatiche EMA, Anticorpi

antitrasglutamin asi

Malattia celiaca

TSH, FT4 Ipotiroidismo congenito o acquisito Esame urine Funzione renale, acidosi tubulare

renale, diabete insipido

II IGF1

IGFBP3

Bassi livelli per età e sesso sono indicativi di un deficit di GH

La determinazione dei livelli di IGFBP3 ha maggiore validità nei bambini di età inferiore ai 3 anni.

Le concentrazioni di IGF1 possono essere ridotte anche per un disturbo nutrizionale (es. malassorbimento per malattia celiaca, anoressia nervosa)

Cariotipo Sindrome di Turner e cromosopatie occulte

III Test di stimolo per la secrezione di GH

Deficit di GH se picco < 8 ng/ml in due test da stimolo classici effettuati in due giorni differenti o < 20 ng/ml un test potenziato (es. GHRH + arginina)

In bambini con bassa statura ma normale velocità di crescita, età ossea non ritardata e livelli di IGF1 nella media o superiori a questa, i test di stimolo per GH non dovrebbero essere eseguiti.

Test di stimolo per IGF1°

Resistenza al GH (es. sindrome di Laron)

Test poco standardizzato e con sensibilità non ben definita.

Test genetici di biologia molecolare

Patologie endocrine o genetiche di cui sia noto il difetto molecolare

Da effettuare su indicazione del pediatra endocrinologo o del genetista clinico sulla base di specifici reperti clinici o di laboratorio.

2.3 – PRINCIPALI CAUSE DI IPOSTATURALITÀ

(28)

24

Tabella 5. Cause di ipostaturalità.

Causa Esempi clinici

Ipoevolutismi primitivi (genetici) Sindromi dismorfiche (es. sindrome di Noonan, di Silver Russel, di Rubistain Taybi)

Sindromi associate a obesità (es. sindrome di Prader-Willi) Sindromi cromosomiche (es. trisomia 21, sindrome di Turner)

Noxae patogene prenatali Sindrome feto-alcolica

Nati piccoli per età gestazionale senza recupero accrescitivo

Malnutrizione materna/fetale in genere

Malnutrizione post-natale Alimentazione carente in calorie o nutrienti rispetto ai fabbisogni

Deficit di assorbimento (es. malattia celiaca) Malattie infiammatorie croniche dell’intestino

Malattie del metabolismo Glicogenosi

Mucopolisaccaridosi

Malattie d’organo o di sistema Cardiopatie congenite (cianogene e non cianogene) Broncopneumopatie croniche

Insufficienza renale cronica Acidosi tubulare renale Epatopatie croniche

Anemie croniche congenite o acquisite

Patologie neuromuscolari croniche (spesso associate a deficit di alimentazione)

Deficit immunitari

Patologie infiammatorie croniche

Displasie scheletriche Acondroplasia/ipocondroplasia

Aploinsufficienza del gene SHOX (sindrome di Léri-Weill e varianti)

Osteogenesi imperfetta

Malattie endocrine Panipopituitarismo

Deficit isolato di ormone della crescita Resistenza all’ormone della crescita Ipotiroidismo

Diabete mellito (non adeguatamente trattato) Ipersurrenalismo (sindrome di Cushing) Pseudoipoparatiroidismo

Disturbi psichiatrici Nanismo psico-sociale Anoressie della 1° infanzia

Anoressia nervosa dell’adolescenza

Ipostaturalità iatrogene Terapia cronica con corticosteroidi Radioterapia

Interventi neuro-chirurgici della regione ipotalamo-ipofisaria

Varianti normali della crescita Bassa statura familiare

Ritardo costituzionale di crescita e pubertà

(29)

25

Sulla base dei dati clinici e di laboratorio, si può inquadrare un bambino con ipostaturalità in alcune categorie diagnostiche principali:

1. Varianti normali della crescita (es. bassa statura familiare, ritardo costituzionale di crescita e pubertà);

2. Forme in cui la bassa statura rappresenta la caratteristica fenotipica principale (es. deficit di GH);

3. Forme in cui la bassa statura rappresenta una delle caratteristiche fenotipiche nell’ambito di condizioni mediche complesse (es. aploinsufficienza del gene SHOX, sindrome di Turner, sindrome di Noonan);

4. Forme secondarie a patologie croniche mediche o psichiatriche; 5. Bassa statura idiopatica (diagnosi di esclusione in assenza di una

causa genetica, endocrina, ambientale ben definibile)17.

In Figura 17 è riportata una flow-chart diagnostica utile per orientare una diagnosi differenziale, che può mostrarsi spesso articolata e complessa.

2.4 –TRATTAMENTO CON ORMONE DELLA CRESCITA

RICOMBINANTE (rGH)

“Gli obiettivi della terapia con ormone della crescita (GH) durante l’infanzia e l’adolescenza sono: indurre il recupero staturale o catch-up growth, mantenere la crescita nell’ambito del canale bersaglio, ottenere una statura finale nel range della normalità e del target genetico, ottenere gli altri effetti del GH a livello metabolico (metabolismo osseo e composizione corporea, metabolismo glico-lipidico, apparato cardio-vascolare), minimizzare i rischi della terapia e ottimizzare i costi”18,19.

(30)

26

La prescrivibilità del GH è regolamentata dalla Nota AIFA 3920 , che è

possibile nelle seguenti condizioni: deficit di GH, sindrome di Turner citogeneticamente dimostrata, deficit staturale nell’insufficienza renale

cronica, sindrome di Prader-Willi geneticamente dimostrata,

l’aploinsufficienza del gene SHOX , bambini nati piccoli per l’età gestazione (SGA) non hanno presentato un recupero accrescitivo a 4 anni di vita.

La somministrazione del GH deve essere quotidiana, alla sera, attraverso somministrazione sottocutanea. La dose individuale di GH deve essere calcolata in base al peso o alla superficie corporea modificandola, quando necessario, a ogni controllo clinico 21.

Figura 17. Ipostaturalità: algoritmo diagnostico. (SB: statura bersaglio; EO: età ossea; BSF: bassa

statura familiare; BSI: bassa statura idiopatica; RCCP: ritardo costituzionale di crescita e pubertà; SGA: nato piccolo per età gestazionale).

(31)

27

3 – IPOSTATURALITÀ DA MUTAZIONE DEL GENE

SHOX

3.1 IL GENE SHOX

Nell’eziologia della bassa statura sono coinvolti più di 150 geni22,23, ma solo

la scoperta del gene SHOX – localizzato nella regione pseudoautosomica dei cromosomi sessuali- ha permesso di identificare, nell’aploinsufficienza di tale gene, la più frequente causa monogenica di ipostaturalità.

Un ruolo dei cromosomi sessuali nell’accrescimento era stato suggerito dall’evidenza di un’alterazione della crescita in individui maschi e femmine portatori di anomalie di tali cromosomi24. Un esempio è la sindrome di

Turner, che comporta la perdita di un cromosoma X (monosomia X) ed è associata costantemente a bassa statura. Studi citogenetici hanno dimostrato che le delezioni delle regioni terminali del braccio corto sia del cromosoma X che del cromosoma Y inducono ipostaturalità25,26. Nel braccio corto dei

cromosomi X e Y è inclusa la regione PAR1 (pseudoautosomal region 1) che fu proposta come regione contenente un locus genico coinvolto nella determinazione della crescita22,27 (Xp22.33 e Yp11.32).

Il gene SHOX (short stature homeobox-containing gene on chromosome X) si estende approssimativamente per 40 kb, a circa 500 kb dai telomeri dei cromosomi sessuali22. Tale gene, poiché contenuto all’interno della regione

pseudoautosomica, non è sottoposto al fenomeno di Lyon, il processo biologico di inattivazione di uno dei cromosomi X che ne comporta il silenziamento genetico. Per tale motivo, la funzione del gene SHOX è dose-dipendente e sono necessarie entrambe le copie del gene per assicurarne la funzione. Si parla di aploinsufficienza di SHOX quando uno dei due alleli del gene è mutato, nonostante l’altro allele sia funzionalmente attivo.

(32)

28

Da una prima caratterizzazione di SHOX furono identificati sette esoni (1-5, 6a e 6b) codificanti per due trascritti originati da splicing alternativo,

SHOXa e SHOXb, identici al 5’ ma differenti nell’esone finale al 3’ (6a vs

6b)25. I due trascritti vengono, a loro volta, tradotti in due differenti proteine SHOXa e SHOXb rispettivamente di 292 e 225 amminoacidi, con un diverso pattern di espressione. Recentemente la struttura genomica di SHOX è stata ulteriormente estesa a includere altri quattro esoni (2a, 7-1, 7-2 e 7-3) che codificano per nuove isoforme di SHOX28 (Figura 18).

(33)

29

I trascritti SHOXa e SHOXb contengono una sequenza di DNA denominata “homeobox”, codificante per un dominio di legame al DNA che caratterizza la famiglia dei fattori di trascrizione “homeodomain-containing”29. Una

sequenza genica homeobox è lunga circa 180 paia di basi e codifica per un dominio proteico (denominato "homeodomain fold") che, quando viene espresso, può legarsi al DNA e agire da regolatore dell'espressione genica. I geni homeobox regolano l’organogenesi durante l’embriogenesi e lo sviluppo sia dei vertebrati che degli invertebrati29,30, agendo sia come attivatori che come repressori trascrizionali nella regolazione dell’espressione spazio-temporale di differenti geni target22.

Il gene SHOX è altamente conservato tra le varie specie, dai mammiferi ai pesci e alle mosche ma, poiché è assente nel topo31, sono stati usati altri modelli animali per lo studio della sua funzione (es. pollo, un piccolo pesce d’acqua dolce: il danio zebrato o pesce zebra o zebrafish) e linee cellulari primarie.

Inoltre, mediante studi di espressione nell’uomo, è stata osservata una notevole differenza nei pattern di espressione delle isoforme di SHOX, a e b. Mentre entrambe sono espresse in maniera predominante nei fibroblasti del midollo osseo, SHOXa è espressa anche in molti altri tessuti25 come muscolo

scheletrico, placenta, pancreas e cuore28 e SHOXb nel muscolo scheletrico e

in tessuti fetali come il rene. Più recentemente, dall’analisi mediante Real Time-PCR (RT-PCR) è emersa un’espressione di SHOX in diversi tessuti fetali (muscolo, pelle, intestino, occhio, cervello, midollo spinale) e in tessuti adulti, in particolare placenta, muscolo scheletrico e tessuto adiposo 28. Una

debole espressione è stata anche riscontata in alcune regione cerebrali sia del feto che dell’adulto quali il cervelletto, il talamo, i gangli della base, che

(34)

30

implicherebbe un ruolo di SHOX nello sviluppo cerebrale, non ancora caratterizzato28, particolarmente per gli esoni 2a e 7.

Esiste un pattern di espressione spazio-temporale ristretto di SHOX: dalla 5ᵃ settimana di gestazione l’espressione è confinata a un’ampia banda nella porzione mediana degli arti in sviluppo; durante il processo di condensazione e condrificazione l’espressione diventa sempre più marcata intorno all’anello precartilagineo del gomito, mentre, quando lo sviluppo di tutte le ossa degli arti è completo, l’espressione di SHOX è marcata nel terzo medio dell’arto superiore (estremità distale dell’omero, radio e ulna, e in alcune ossa del polso)22. Lo stesso pattern di espressione può essere tracciato negli arti

inferiori. Ne consegue che il gene SHOX, nel suo ruolo di fattore di trascrizione, svolge primariamente la funzione di regolatore della crescita integrando diversi aspetti dello sviluppo osseo e della biologia della cartilagine di coniugazione.

Oltre che negli arti superiori e inferiori, l’espressione di SHOX si localizza nel primo e secondo arco faringeo31 che danno origine alla mascella, mandibola e alcune ossa dell’orecchio. Anche SHOX2 è espresso negli arti, ma nelle regioni più prossimali31, e nell’abbozzo cardiaco in via di

sviluppo32. Specificatamente, il gene SHOX2 sembra giocare un ruolo

fondamentale nello sviluppo cardiaco dal momento che topi, omozigoti per una delezione di tale gene, muoiono durante l’embriogenesi per un errata formazione del nodo senoatriale32. Diversamente, un pattern di espressione

molto simile a quello dell’embrione umano è stato riscontrato nell’embrione di pollo che, per tali similarità, è diventato un sistema modello per lo studio delle funzioni sia di SHOX che di SHOX2 nello sviluppo degli arti33. L’espressione del gene SHOX è regolata da promotori, sequenze di splicing

(35)

31

alternativo e sequenze cis-regolatorie (enhancers) localizzati sia a monte che a valle dell’unità trascrizionale (Figura 19).

Figura 1922. Meccanismi di regolazione dell'espressione del gene SHOX. A) Due promotori alternativi: P1

e P2. B) Elementi enhancers. C) Sequenze di splicing alternativo.

Due diversi promotori, P1 e P2, controllano i livelli di trascrizione, generando due diverse classi di mRNA, che codificano per proteine identiche ma che differiscono nella loro regione 5’ UTR per la presenza di 7 codoni AUG a monte della sequenza di lettura di SHOX; la presenza di questi ultimi nel trascritto ne riduce l’efficienza della traduzione generando in questo modo un meccanismo di controllo dei livelli di produzione di proteina

(36)

32

SHOX34. I due promotori, infatti, vengono usati alternativamente in risposta

a differenti stimoli fisiologici, garantendo una fine regolazione dei livelli di SHOX e della specificità del tessuto in cui viene espresso22.

Le sequenze di DNA non codificante (CNEs), che potenziano (enhancer) o reprimono (repressor) la trascrizione genica, possono localizzarsi sia in vicinanza della regione codificante ma anche a considerevole distanza da essa (fino a 2 milioni di paia basi lontano)35. Si tratta di sequenze regolatorie altamente conservate che, se alterate, determinano un’aploinsufficienza funzionale del gene che controllano. All’interno della regione PAR1 sono state identificate diverse sequenze non codificanti (CNEs), in particolare 4 a valle (CNE4, CNE3, ECR1, CNE9) 33,36,37 e tre a monte (CNE5, CNE3, CNE2) 38, con una distanza di 200 e 250 kb, rispettivamente, dal gene SHOX. Questi elementi sono conservati in tutte le specie in cui SHOX è presente22. La funzione di queste CNEs, quali enhancers della trascrizione di SHOX, è stata dimostrata sia nelle cellule umane37 che negli abbozzi di arti di pollo 37 e zebrafish39.

Infine, diverse isoforme, generate per splicing alternativo degli esoni del gene SHOX, si differenziano nella loro regione 3’-UTR e hanno siti di legame per differenti miRNAs. L’isoforma SHOXb contiene lo stesso dominio di SHOXa di legame al DNA (esoni III e IV), ma perde il dominio di trans-attivazione della proteina (codificato dall’esone VIa), non è quindi capace di attivare la transcrizione e agisce come regolatore negativo di SHOXa 22.

(37)

33

3.2 – LA PROTEINA SHOX

Le caratteristiche della proteina SHOX ripercorrono le caratteristiche geniche. La proteina SHOXb è identica alla proteina SHOXa nei primi 211 amminoacidi e perde la porzione C-terminale22. Si tratta di un fattore di trascrizione che contiene al suo interno importanti domini funzionali, le cui mutazioni rappresentano la base molecolare di diverse condizioni cliniche; quest’ultime, infatti, vanno a ridurre l’attività biologica di SHOX, influenzando il suo legame al DNA, la dimerizzazione o la traslocazione nucleare della proteina40. I principali domini funzionali di SHOX (Figura 20)

sono: l’homeodomain (HD), il segnale di localizzazione nucleare (NLS), il dominio di transattivazione (OAR), il dominio di dimerizzazione e il sito di fosforilazione di SHOX.

Figura 2022. La proteina SHOX e i suoi principali domini funzionali.

Il segnale di localizzazione nucleare risiede all’interno dell’elica di riconoscimento del DNA (homeodomain) definito da cinque amminoacidi

(38)

34

AKCRK 41. Poiché SHOX deve prima traslocare nel nucleo per esercitare la

sua funzione di fattore di trascrizione, diversi studi hanno stabilito l’alterazione della localizzazione nucleare come uno dei meccanismi alla base delle patologie SHOX-correlate41.

Mutazioni a carico dell’homeodomain riducono la capacità di dimerizzazione della proteina, compromettendone l’attività trascrizionale40;

l’homeodomain è, cioè, compreso nel dominio di dimerizzazione (Figura 20).

La porzione C-terminale della proteina ospita il dominio di transattivazione, necessario per l’attività trascrizionale di SHOX; l’isoforma SHOXb, che ha perso tale regione, è inattiva come fattore di trascrizione. Dall’altro lato, condividendo il solito homeodomain, può legare le stesse sequenze di DNA di SHOXa e formare eterodimeri con SHOXa modulandone l’attività42.

La proteina SHOX viene fosforilata in vivo su residui multipli di serina:

Ser106 rappresenta il principale sito di fosforilazione di SHOX43. Ser106, insieme ai residui adiacenti Glu107-Asp108-Glu109, rappresenta un sito di fosforilazione da parte della casein-kinasi II (CKII) che, preferenzialmente, fosforila la serina in regioni ricche di residui acidi 43. Specifici inibitori di

CKII riducono fortemente la fosforilazione di SHOX in vivo nelle cellule che la esprimono, modulandone l’attività trascrizionale (senza intaccarne la localizzazione nucleare e la capacità di legame al DNA) e inducendo l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi43.

SHOX è espresso nella cartilagine di accrescimento o di coniugazione, ovvero il sottile strato di cartilagine compreso tra l’epifisi e la metafisi delle ossa lunghe44, che durante la crescita staturale continua ad allungarsi per accrescimento interstiziale dal lato rivolto verso l’epifisi e ad essere

(39)

35

contemporaneamente sostituita da tessuto osseo dal lato rivolto verso il centro diafisario. I due processi, di accrescimento e di ossificazione, procedono con uguale velocità, esitando in un aumento in lunghezza della diafisi. La cartilagine di accrescimento è una struttura complessa45 nella quale, procedendo dall’epifisi alla diafisi, si può riconoscere (Figura 21):

- Zona della cartilagine in riposo o di riserva, che contiene condrociti indifferenziati a riposo derivati dalle cellule

staminali mesenchimali, con morfologia tipicamente

rotondeggiante, distribuite isolatamente o in gruppi e prive di attività proliferativa. Queste cellule confinano con i condrociti della zona proliferativa di cui ne rappresentano i precursori; - Zona di proliferazione, che assicura il continuo accrescimento

in lunghezza del segmento scheletrico. I condrociti proliferano attivamente disponendosi in lunghe colonne longitudinali; questa disposizione è resa possibile dal fatto che i solchi di segmentazione delle successive divisioni cellulari sono disposti su piani tra loro paralleli. Le lacune cartilaginee in tale zona, detta zona della cartilagine seriata, sono appiattite con il loro diametro maggiore perpendicolare all’asse longitudinale dell’abbozzo cartilagineo. Questa precisa modalità di proliferazione delle cellule cartilaginee ha un preciso significato morfologico in quanto fa sì che la diafisi si accresca in lunghezza assai più rapidamente che in larghezza. I condrociti proliferanti producono grosse quantità di matrice extracellulare -collagene tipo II, IX e XI, proteoglicano aggrecano-;

(40)

36

- Zona di ipertrofia o di maturazione delle cellule e di ingrandimento delle lacune, in cui la proliferazione cellulare si arresta, le cellule si ipertrofizzano, diventano vacuolizzate. Questi condrociti secernono grosse quantità di matrice extracellulare ricca in collagene tipo X. Si mantiene ancora la disposizione in colonne longitudinali ma le lacune si ingrandiscono notevolmente a spese della matrice interposta; - Zona della cartilagine calcificata o in regressione, in cui la

matrice extracellulare si calcifica e va incontro a regressione riducendosi a sottili setti interposti tra le lacune allargate, inducendo così la degenerazione delle cellule;

- Zona di invasione vascolare e di deposizione di osso, in cui le cavità longitudinali, derivanti dalla confluenza delle lacune cartilaginee, sono invase da anse capillari e da tessuto connettivo provenienti dagli spazi midollari della diafisi e vi si differenziano cellule ematopoietiche e osteoblasti, i quali depositano uno strato di tessuto osteoide che calcifica mano a mano che viene depositato. Questo processo è mediato dal rilascio, da parte dei condrociti differenziati, di fattori di

crescita endoteliali vascolari, che stimolano la

vascolarizzazione, e metalloproteinasi 13 che degrada la matrice extracellulare, favorendo l’invasione vascolare46.

Diversi ormoni, fattori paracrini, molecole della matrice extracellulare e proteine intracellulari controllano in maniera coordinata l’attività dei condrociti della cartilagine di coniugazione con diversi meccanismi22. Lo

sviluppo della placca di crescita è, infatti, influenzato da molti fattori45,47

(41)

37

nucleari che rispondono ai retinoidi, agli ormoni tiroidei, agli estrogeni e androgeni, vitamina D, glucocorticoidi48, etc).

Figura 21. Sezione longituidinale di disco epifisario colorata con Alcian blu e PAS (da G. Quintarelli).

In questo complesso meccanismo, il gene SHOX rientra tra i pathway intracellulari espressi all’interno della cartilagine di accrescimento. La proteina SHOX viene espressa dalla 12ᵃ settimana di gestazione fino alla tarda infanzia49. Nel processo di ossificazione endocondrale, tale proteina si

trova espressa principalmente nei condrociti maturi ipertrofici; più irregolare è l’espressione nei condrociti della regione di riserva e di proliferazione, mentre è assente nelle cellule osteoblastiche e osteoclastiche50. In tali cellule SHOX agisce come modulatore della proliferazione cellulare e dell’apoptosi e ha un ruolo diretto nella regolazione della differenziazione dei condrociti della placca di crescita, essendo espresso soprattutto nei condrociti ipertrofici/apoptotici. Il meccanismo con cui l’espressione di SHOX induce

(42)

38

l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi fu dimostrato nell’induzione di uno stress ossidativo all’interno della cellula che, a sua volta, porta a rottura della membrana lisosomiale con il rilascio di catepsina B al citosol e successiva attivazione del percorso apoptotico caratterizzato dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale e attivazione delle caspasi (processo di condroptosi); viceversa le cellule che esprimono forme mutate o tronche di SHOX non mostrano nessuna di queste attività51.

Figura 2222. Interattoma di SHOX.

La scoperta dei segnali intracellulari attivati a valle dal fattore di trascrizione SHOX ha poi fornito ulteriori delucidazioni sul complesso processo di formazione dell’osso (Figura 22). In particolare, il BNP (brain natriuretic peptide) è stato identificato come target diretto di SHOX e come mediatore

(43)

39

delle sue funzioni cellulari all’interno della cartilagine di accrescimento52

(Figura 23). L’identificazione di BNP come effettore a valle di SHOX può aprire nuove potenziali vie terapeutiche per la bassa statura: come dimostrato nel topo, livelli aumentati di BNP nel siero potenziano la crescita scheletrica, in maniera analoga all’ormone della crescita e ai fattori di crescita insulino-simili, per cui una sua applicazione sistemica in combinazione con rGH nei pazienti con aploinsufficienza di SHOX potrebbe rappresentare una nuova prospettiva terapeutica52. Studi di ingegneria genetica su topi hanno mostrato che anche CNP e il suo recettore Npr2 sono espressi nella cartilagine di accrescimento (Figura 23), implicati nella regolazione della crescita endocondrale53.

Successivi studi hanno dimostrato un effetto di SHOX sull’espressione del gene del recettore del fattore di crescita fibloblastico FGFR354 (Figura 23). Mutazioni “gain of function” di FGFR3 causano l’acondroplasia, l’ipocondroplasia, caratterizzate da un accorciamento rizomelico degli arti dovuto a un’alterata ossificazione endocondrale55. Mediante l’utilizzo di

RT-PCR e ibridazione in situ, Decker e altri54 hanno dimostrato un effetto repressivo di SHOX sull’espressione di FGFR3 suggerendo una potenziale correlazione tra la bassa statura rizomelica dei pazienti con acondroplasia da mutazione di FGFR3 e SHOX54. Inoltre, SHOX, attraverso l’inibizione della

trascrizione di FGFR3, può avere un impatto sulle vie di trasduzione a valle di quest’ultimo, JAK-STAT e MAPK56.

Oltre a BNP e FGFR3, SHOX interagisce con il trio dei fattori di trascrizione

SOX (SOX5, SOX6 e SOX9)57 formando un complesso che regola la

differenziazione dei condrociti (Figura 23). Dall’interazione con il trio SOX, SHOX modula l’espressione di ACAN, che codifica per il proteoglicano aggrecano; l’aggrecano è uno dei principali componenti della matrice

(44)

40

extracellulare e svolge un ruolo fondamentale nella funzione della cartilagine di accrescimento. Per questo motivo, SHOX è co-espresso con SOX5, SOX6 e SOX957.

Un altro gene up-regolato da SHOX all’interno della cartilagine di accrescimento è Ctgf (connective tissue growth factor), che contiene al suo interno diversi siti di legame di SHOX; entrambi, SHOX e Ctgf vengono coespressi nella zona ipertrofica58.

Per ciò che concerne invece i regolatori dell’espressione di SHOX, il primo a essere identificato fu HOXA959 (della famiglia dei fattori di trascrizione

HOX che svolgono un ruolo nello sviluppo scheletrico degli arti e assiale), che regola negativamente l’espressione di SHOX.

Anche RUNX2 e RUNX3 agiscono in sinergia con SHOX nello stimolare la maturazione condrocitaria tramite Bmp460.

Figura 2322. Pattern di espressione dei principali fattori cellulari coinvolti, insieme alla proteina SHOX,

(45)

41

Probabilmente le funzioni svolte da SHOX durante l’embriogenesi differiscono da quelle esercitate dalla proteina in epoca postnatale: questo si deduce dal fatto che molti degli effetti dell’aploinsufficienza del gene SHOX nell’uomo si manifestano solo nella medio-tarda infanzia22.

3.3- VARIANTI GENETICHE DI SHOX

La più frequente alterazione di SHOX nell’uomo riportata in letteratura è rappresenta da una delezione, più o meno grande, del gene61,62 o delle regioni enhancer extrageniche, situate a distanza di 50-250 kb a valle dalla regione codificante63 (~80%64).

Le microdelezioni, comprendenti singoli o multipli esoni, sono più rare e riguardano approssimativamente il 5% dei casi 65.

Più frequenti sono, viceversa, le mutazioni missense e nonsense, presenti all’interno di tutto il gene, anche se più frequentemente all’interno degli esoni 3 e 4 (sede dell’homeodomain)66. La maggior parte delle mutazioni

missense di SHOX, localizzate nell’homeobox, sono in grado di alterarne le funzioni biologiche quali la capacità di legare il DNA, la dimerizzazione e la traslocazione all’interno del nucleo oppure l’attività trascrizionale 40.

Più recentemente sono state riportate duplicazioni di SHOX parziali o complete in pazienti con fenotipo correlato ad aploinsufficienza di SHOX

67-70; il meccanismo con cui le duplicazioni di SHOX ne causano un deficit

sembra essere legato a una non appropriata distanza tra le regioni promoter e le regioni enhancer, come succede nei riarrangiamenti cromosomici.

(46)

42

3.4 –ASPETTI CLINICI DELLE PATOLOGIE CORRELATE AL DEFICIT DI SHOX

Le varianti genetiche di SHOX causano bassa statura con un’alta variabilità fenotipica, raggruppabile in tre condizioni cliniche ovvero la bassa statura idiopatica (ISS), la discondrosteosi di Léri-Weill (LWD) e la displasia mesomelica di Langer (LD)71.

Come accennato, la bassa statura nella sindrome di Turner, dovuta ad aberrazioni strutturali e numeriche del cromosoma X, rappresenta un’ulteriore manifestazione dell’aploinsufficienza del gene SHOX.

In eterozigosi, il deficit di SHOX si manifesta spesso con un quadro non specifico in età prescolare, in quanto le principali caratteristiche di una sproporzione mesomelica degli arti si possono presentare solo con il progredire dell’età cronologica72. I segni della patologia sono più severi nel

sesso femminile dalla pubertà in poi, probabilmente per un effetto “tossico” degli estrogeni1673. Le delezioni di SHOX sul cromosoma X sono molto più frequenti delle delezioni sul cromosoma Y 64.

Attualmente non è stata individuata una chiara correlazione tra la gravità del fenotipo e il tipo di mutazione sottostante: spesso, mutazioni identiche sono in grado di causare sia una bassa statura idiopatica che la sindrome di Léri-Weill o rimanere addirittura asintomatiche73.

3.4.1 – LA DISCONDROSTEOSI DI LÉRI-WEILL

La discondrosteosi di Léri-Weill (LWD), dovuta a mutazioni in eterozigosi, è una displasia scheletrica caratterizzata da:

(47)

43

Bassa statura mesomelica: ipostaturalità disarmonica caratterizzata dalla presenza di un simmetrico accorciamento degli avambracci e delle gambe, con altezza finale intorno a 135 cm;

Deformità di Madelung: si tratta di una deformità del polso e dell’avambraccio, con “sublussazione spontanea dell'ulna distale in avanti”74 che dà all’avambraccio e alla mano l’aspetto deformato a

dorso di forchetta (Figura 24). Si ha un accorciamento e inarcamento bilaterale del radio associato alla dislocazione distale dell’ulna e all’incuneamento delle ossa carpali75 (figura 25). Quest’insieme di

cambiamenti anatomici del polso sembra essere dovuto a una fusione prematura dell’epifisi distale del radio e alla formazione di legamenti aberranti, come il ligamento di Vickers75, che uniscono il semilunare e la porzione distale del radio. Spesso causa dolore e impotenza funzionale. I pazienti presentano una ridotta ampiezza dei movimenti e una limitazione della supinazione, della dorso-flessione e della deviazione radiale. La pronazione e la flessione sono di solito normali. Un effetto similare si può osservare anche a carico degli arti inferiori con incurvamento della tibia e ginocchio valgo64.

Oltre alla deformità di Madelung, dal punto di vista radiologico si possono poi riscontrare in un Rx di mano e polso sinistro (Figura 26):

la triangolarizzazione dell’epifisi distale del radio che, invece di assumere la forma di un trapezio, assume una forma triangolare all’età ossea > 10 anni nelle femmine e > 11 anni nei maschi 76;

la piramidalizzazione della fila di ossa carpali che diventa a forma di cuneo, in cui l’osso semilunare costituisce la punta della piramide e invade lo spazio articolare 77;

(48)

44

la lucentezza radiografica del bordo ulnare del radio, dove l’osso appare meno denso che dall’altra parte 77.

Sulla base di ciò quando si legge una radiografia di mano e polso di bambini con bassa statura, si deve valutare non solo la maturazione ossea ma anche i segni radiologici di una carenza di SHOX; la presenza di questi segni permette di richiedere un’indagine molecolare di SHOX77.

Si può poi avere: brevità del IV e del V metacarpo, palato ogivale, micrognazia, scoliosi, ipertrofia muscolare soprattutto dei polpacci, cubito valgo, altri segni dismorfici78.

Nell’80% dei casi, questa condizione è riconducibile a delezioni parziali o complete del gene o degli elementi enhancer (15-40%), mentre il rimanente 20% è dovuto a mutazioni missenso in eterozigosi79.

(49)

45

Figura 25. Deformità di Madelung: aspetto anatomico e radiologico (Rx)75

Figura 26 64. Confronto immagini Rx mano-polso sinistro normale (sopra) e Rx mano-polso sinistro in

(50)

46

3.4.2 – LA DISPLASIA MESOMELICA DI LANGER

La displasia mesomelica di Langer (LD) è dovuta alla perdita in omozigosi del gene SHOX80. Si tratta di una displasia scheletrica grave caratterizzata da una bassa statura di notevole entità, con un’altezza che varia da 5.5 a -8.9 DS81, aplasia o marcata ipoplasia dell’ulna e/o del perone e severo

accorciamento del radio e della tibia (Figura 27), ipoplasia della mandibola e micrognazia22.

Figura 27. Radiografie di soggetti con displasia mesomelica di Langer80.

3.4.3 – BASSA STATURA IDIOPATICA

La bassa statura idiopatica (ISS) è una condizione caratterizzata da un’altezza inferiore a -2 SDS per età e sesso in assenza di malattia endocrina, sistemica, nutrizionale o aberrazione cromosomica. In una percentuale variabile, a seconda degli studi, dei bambini ritenuti affetti da questa condizione è stata rilevata un’aploinsufficienza del gene SHOX22,25,72,82-84;

(51)

47

tecniche genetiche utilizzate unitamente alla valutazione delle regioni enhancer81, che venivano omesse nei primi studi 85.

3.5 – DIAGNOSI

Nella diagnosi di aploinsufficienza del gene SHOX un primo aspetto da considerare è una storia familiare di bassa statura disarmonica, che si trasmette con modalità dominante. Dal punto di vista auxologico, la lunghezza alla nascita è, di solito, solo moderatamente ridotta, ma un rallentamento della crescita lineare compare già dal primo anno di vita con un progressivo rallentamento della velocità di crescita 64. La bassa statura

può rimanere l’unica caratteristica clinica in questa fase, mentre il classico fenotipo di bassa statura disarmonica mesomelica compare più frequentemente in età scolare e aumenta in frequenza e severità alla pubertà86, soprattutto nel sesso femminile. Un’analisi antropometrica

dettagliata delle proporzioni corporee fornisce un importante criterio di selezione per consentire un uso più razionale dei test genetici22.

Rispetto agli standard per età, l’arm span è significativamente ridotto in confronto alla statura in piedi e la lunghezza delle gambe minore rispetto a quanto atteso dalla statura da seduto 64. Il rapporto altezza da seduto/altezza totale è aumentato 87. La statura adulta è riportata tra -4/-1 DS in assenza di terapia. L’età ossea è normale o di poco inferiore all’età cronologica e lo sviluppo puberale può essere lievemente anticipato e rapidamente progressivo.

I principali indicatori clinici di aploinsufficienza del gene SHOX sono riportati in Tabella 6.

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Rappold e altri78 hanno creato uno score (Tabella 7) per selezionare i pazienti

in cui effettuare il test genetico. Su uno score totale di 24, il cutoff, corrispondente a un valore predittivo positivo per mutazioni o delezioni del gene SHOX del 19%, è 7.

La conferma diagnostica richiede un’analisi molecolare.

Tabella 6. Aploinsufficienza del gene SHOX.

Tabella 7. Scoring system, basato su criteri clinici, per identificare i pazienti da sottoporre al test

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3.6 – TERAPIA

Come nella sindrome di Turner88, trial clinici randomizzati hanno dimostrato l’efficacia della terapia con rGH anche nei bambini con aploinsufficienza di SHOX. Su tali basi, il trattamento è approvato sia in USA che in Europa, Italia compresa, dalle agenzie regolatorie. Il proseguimento della terapia fino al raggiungimento dell’altezza finale permette, in media, il guadagno di più di 1.3 DS, che corrispondono a 8-9 cm22. Alcune evidenze fanno presumere che la terapia con rGH sia più efficace se iniziata precocemente88, prima

dello sviluppo puberale e nei pazienti con delezioni degli enhancers di SHOX piuttosto che nei pazienti con delezioni intrageniche di SHOX89. Rimane ancora da definire se la soppressione gonadica con analoghi del GnRH90 o la soppressione della sintesi degli estrogeni mediante inibitori dell’aromatasi (AI) possa migliorare le deformità scheletriche e la crescita staturale91.

L’importanza della diagnosi di ipostaturalità da alterazioni del gene SHOX deriva, dunque, dalla possibilità di avere a disposizione un trattamento efficace. Una mancata diagnosi (e conseguente mancato trattamento) può avere conseguenze, oltre che sullo stato di salute della persona affetta, anche per il professionista, in quanto può determinare un contenzioso di tipo medico-legale per “malpractice”.

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4 - OBIETTIVI DELLA TESI

L’obiettivo principale di questa tesi è stato quello di valutare, all’interno di una popolazione di bambini caratterizzati dal sintomo “bassa statura” e/o ridotta velocità di crescita in assenza di deficit ormonali o patologie genetiche note, la frequenza e il tipo di mutazioni del gene SHOX.

Il secondo obiettivo è stato quello di analizzare le caratteristiche cliniche dei pazienti al momento della diagnosi (età cronologica, statura, velocità di crescita, BMI, età ossea, lunghezza alla nascita, target staturale genetico). Il terzo obiettivo, infine, è stato quello di analizzare la risposta alla terapia con rGH in un sottogruppo di pazienti che hanno raggiunto un follow up di almeno 24 mesi.

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