8.1 PCR
La scelta della proteina funzionale NS5 come bersaglio per la produzione di un antigene ricombinante origina dai dati presenti in letteratura, per i quali questa proteina risulta essere generalmente molto conservata ed al contempo specie-specifica. La procedura consiste nell’amplificazione della porzione genica d'interesse ed il seguente clonaggio in un vettore di espressione procariotico. La regione N-terminale di 640 bp della proteina funzionale NS5 è stata amplificata in un passaggio singolo utilizzando gli oligonucleotidi senso ed antisenso contenenti i siti di restrizione BamHI ed EcoRI rispettivamente. La miscela di reazione era costituita da un volume finale di 30 µl costituiti da tampone di reazione 1X, 3 mM di MgSO4, 0.3 µM degli oligonucleotidi senso ed antisenso, rispettivamente 5-'GAGGCGGATCCGCGGGGGGAATGTCACAC-3' e 5'- TTCCGAATTCTCAAACAGCCAGGTCCTG-3', 1 unità di enzima SuperScript III e 5 µl di templato. I cicli consistevano di una RT a 54 °C x 20' e 50 °C x 10'. L'amplificazione consisteva di 95 °C x 2', seguita da 12 cicli di 95 °C x 10'', 56 °C x 30'' con un decremento di 0.5° ogni ciclo e 68 °C x 40'', quindi 30 cicli di 95 °C x 10'', 62 °C x 30'' e 68 °C x 30''.
La regione di 516 bp (464-968 referenza AF260967) della proteina PreM/M è stata amplificata in un passaggio singolo utilizzando la miscela di reazione descritta sopra con i primers senso ed antisenso, rispettivamente 5'-
CAGCGGGATCCCAGTTACCCTCTCTAACTTCC-3' e 5'-
CAAGGGAATTCAAGCTGTAAGCTGGGGCCACC-3'. In seguito ad un inaspettato sito di restrizione BamHI all’interno del frammento amplificato, il frammento clonato va da
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464 a 850., escludendo la regione N-terminale.
La scelta del dominio III (DIII) dell’envelope come bersaglio per la produzione di un antigene ricombinante origina dai dati presenti in letteratura i quali individuano in questo dominio gli epitotopi che producono anticorpi neutralizzanti. La procedura consiste nell’amplificazione della porzione genica d'interesse ed il seguente clonaggio in un vettore di espressione procariotico. Il dominio III del gene Env è stato amplificato in due passaggi, una prima RT-PCR che amplifica 344 bp del gene Env ed una PCR interna (nested) di 305 bp. Nel primo step la miscela di reazione era costituita da un volume finale di 30 µl costituiti da 1X tampone di reazione, 3 mM di MgSO4, 0.3 µM degli oligonucleotidi 5'-CGTCGGGTCATTTGAAGTGTAG-3' senso e 5'- AAAGTCCCAAGCTGTGTCTCCT-3' antisenso, 1 unità di enzima SuperScript III e 5 µl di templato. I cicli consistevano di una RT a 55 °C x 30'', una denaturazione a 94 °C per 2' e 40 cicli di amplificazione di 94 ° x 15'', 56 °C x 30'', 68 °C x 30''. Nel secondo step (nested) la miscela di reazione era uguale a quella descritta sopra, ad eccezione degli oligonucleotidi che erano 5'-GGAAAGGATCCAGTTGAAGGGAACAACC-3' senso contenente il sito di restrizione BamHI e 5'- CTCCTGAATTCGTGGTTGTAAAGGCTTTGCC-3' in antisenso contenente il sito di restrizione EcoRI. L'amplificazione consisteva di 12 cicli di 94 ° x 15'', 50 °C x 30'', 68 °C x 1' e 30 cicli di 94 °C x 15'', 60°C x 20'' e 68°C x 1'. Enzima, tampone e magnesio sono stati forniti dall'Invitrogen, la prima coppia di oligonucleotidi stata progettata utilizzando il software gratuito on-line primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/)mentre la seconda coppia di oligonucleotidi è stata scelta direttamente dalla sequenza (accession number AF346315).
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di 909 bp del gene Env. La miscela di reazione era costituita da un volume finale di 30 µl costituiti da 1X tampone di reazione, 3 mM di MgSO4, 0.3 µM degli oligonucleotidi 5'- GATCGATGGATCCGATTTAACTGCCTTGGAATGAGC-3' senso e 5'- AAGCTTCGAATTCCATTAGCCGTAGGTTGTTCCCTTC-3' antisenso, 1 unità di enzima SuperScript III e 5 µl di templato. I cicli consistevano di una RT a 55 °C x 30'', una denaturazione a 94 °C per 2', 10 cicli di amplificazione di 94 ° x 10'', 55 °C x 30'', 68 °C x 2', seguiti da 30 cicli di 94 ° x 10'', 62 °C x 10'', 68 °C x 2'. Enzima, tampone e magnesio sono stati forniti dall'Invitrogen, la prima coppia di oligonucleotidi stata progettata utilizzando il software gratuito on-line primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/)mentre la seconda coppia di oligonucleotidi è stata scelta direttamente dalla sequenza (accession number AF260968).
8.2 Clonaggio
I prodotti di PCR ottenuti dai frammenti codificanti il dominio DIII dell'envelope, il dominio DI/DII, la porzione N-terminale della proteina NS5 e la proteina PreM/M sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione BamHI/EcorI per generare le estremità sfalsate seguendo le istruzioni del produttore (ROCHE). Gli stessi enzimi sono stati usati per aprire i vettori di espressione pRSETB e pRSETC (Invitrogen). I vettori sono stati defosforilati usando la fosfatasi batterica alcalina (BAP), quindi vettori ed ampliconi sono stati purificati utilizzando il kit NucleoSpin Extract II (MACHERY-NAGEL) previa separazione elettroforetica su gel d'agarosio e scissione delle bande d'interesse. I prodotti purificati sono stati sottoposti ad una reazione di ligasi. Le due miscele di reazione avevano un volume finale di 20 µl contenente un tampone 1X, il vettore ed il frammento purificati in un rapporto quantitativo 1:3 che non eccedeva la quantità totale di 100 ng di
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DNA, ed 1 unità di enzima ligasi. Il tutto è stato incubato per 18 ore a 25 °C. Tampone ed enzima di ligasi sono stati forniti dall'Invitrogen.
Le cellule di E.coli DH5α chimicamente competenti sono state scongelate ed incubate in ghiaccio per 30' con 3 µl di reazione di ciascuna ligasi. Dopo uno shock termico a 42°C per 30 '' le cellule sono state incubate a 37°C per 1 ora in 1ml di terreno SOC quindi piastrate su terreno LB -Agar contenenti l'antibiotico ampicillina alla concentrazione di 100 µg/ml. Le piastre sono state incubate a 37°C per 18 ore. Le colonie antibiotico resistenti cresciute sono state analizzate in PCR per la presenza dell'inserto. Alcune colonie positive sono state inoculate in 5ml di LB con ampicillina alla concentrazione di 100 µg/ml ed incubate per 18 ore a 37°C. I plasmidi contenente l'inserto sono stati purificati con il kit NucleoSpin Plasmid (MAKERY-NAGEL) e analizzati su gel d'agarosio. Il corretto posizionamento degli inserti nel vettore di espressione è stato verificato mediante analisi di sequenza con il sequenziatore automatico CEQ 8000 (Beckman) ed il kit CEQ-DTCS secondo le istruzioni della ditta, utilizzando primer universali T7 promoter e T7 reverse interni al vettore
8.3 Espressione delle proteine ricombinanti
I plasmidi contenenti i vettori con gli inserti nella corretta griglia di lettura sono stati utilizzati per trasformare le cellule E.coli BL21 Star (D3) pLysS chimicamente competenti (Invitrogen) e ciascuna trasformazione è stata usata come inoculo in 5 ml di LB contenente ampicillina 100 µg/ml e cloramfenicolo 35µg/ml ed incubata a 37 °C per 18 ore. Circa 1/50 di terreno saturo è stato utilizzato come inoculo in 50 ml di LB contenente ampicillina 100 µg/ml e cloramfenicolo 35µg/ml. Raggiunta una densità ottica di 0,4 OD è stata prelevata un’ aliquota come controllo negativo, mentre la coltura
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rimanente è stata indotta con IPTG alla concentrazione finale 1 mM. L'induzione è stata protratta per altre 3 ore a 37 °C. Al termine dell'incubazione le cellule sono state centrifugate a 2500 rpm per 10' alla temperatura di 4 °C. Il pellet ottenuto è stato risospeso e sonicato in 5 ml di tampone PBS1X . L'estratto crudo di E.coli ottenuto è stato analizzato mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante con gradiente di concentrazione 4-12% e visualizzato mediante colorazione con Blu di Coomassie.