La proteomica è una branca della biologia molecolare che ha l’obiettivo di identificare tutte le proteine che vengono espresse in una cellula, in un tessuto, in un organismo in condizioni fisiologiche e di valutarne l’alterazione in stati differenti. L’importanza di questo tipo di studio è data soprattutto dalla possibilità di valutare le modifiche post-traduzionali che si riflettono sulla funzionalità della proteina. Il proteoma infatti è un’entità dinamica: le cellule di uno stesso tessuto esprimono proteine differenti, e anche cellule di uno stesso tipo possono, in condizioni diverse (età, patologia, ambiente), esprimere proteine diverse. Con la proteomica quindi si possono comprendere quali siano i processi alla base della comparsa di stati patologici e quali biomarkers possano essere segnali di malattia55,56,57.
La proteomica si suddivide in:
• Proteomica sistematica: si occupa dell’identificazione e della caratterizzazione delle proteine;
• Proteomica differenziale: valuta la differente espressione delle proteine nelle cellule in determinate condizioni fisiologiche o patologiche, o nel corso di trattamenti farmacologici; • Proteomica funzionale: permette di individuare la funzione biologica di proteine di cui ancora non si conosce il ruolo, di comprendere le interazioni tra una proteina e il suo substrato, e di valutare la presenza di modificazioni post-traduzionali delle proteine, con il fine ultimo di descrivere a livello molecolare i meccanismi cellulari.
Alcuni degli obiettivi della proteomica sono:
• Identificazione di nuovi bersagli proteici per farmaci; • Validazione dei bersagli;
• Profilo d’azione dei farmaci (tossicologia in vitro); • “Farmaco-proteomica” (tossicologia in vivo); • Comparazione tra tessuti malati e normali;
• Comparazione tra tessuti malati e trattati farmacologicamente; • Studio delle modificazioni post-trascrizionali;
40 • applicazioni nel campo bio-medico;
• Determinazione di markers di patologie nei fluidi corporei; • Studi farmacologici;
• Analisi dei tessuti nelle patologie tumorali.
L’analisi proteomica di campioni prevede l’utilizzo di due tecniche: l’elettroforesi
bidimensionale (2-DE) per la separazione delle proteine, e la spettrometria di massa (MS) per
la loro identificazione strutturale.
2.1 Elettroforesi bidimensionale (2-DE):
L’elettroforesi bidimensionale (2-DE) è una tecnica che permette di separare le proteine contenute in un certo campione in base al loro punto isoelettrico e al loro peso molecolare. Storicamente, essa deriva dall’accoppiamento di due tecniche elettroforetiche elaborate da U.K Laemmli e da M. Gronow e G. Griffith, pertanto prevede due corse elettroforetiche, dette prima e seconda dimensione (figura 20).
41 La prima dimensione consiste nella isoelettrofocalizzazione (IEF), dove le proteine vengono separate in base al punto isoelettrico (pI). Il pI di una proteina è il pH in corrispondenza del quale la molecola non ha nessuna carica netta (figura 21). Le proteine infatti sono molecole
anfotere, cioè presentano una carica positiva, negativa o nulla in base al pH dell’ambiente in
cui si trovano. Avremo quindi proteine cariche positivamente a pH minori rispetto al loro pI, mentre le troveremo caricate negativamente a superiori.
Figura 21: Migrazione delle proteine in IEF
Per realizzare questa prima dimensione occorre un supporto in gel di poliacrilammide, su cui viene creato un gradiente di pH grazie a miscele di carrier anfolitici. Un tempo, la base sulla quale avveniva la prima dimensione era preparata in laboratorio con gel di acrilammide saturata con elettroliti anfoteri fatti migrare in un campo elettrico in modo da creare un gradiente di pH. Oggi si trovano in commercio gradienti immobilizzati di acrilammide in miscela acida da un lato e in miscela basica dall’altro già pronti che rendono l’analisi meno soggetta a errori dell’operatore, quindi più sicura.
Una volta caricato il campione proteico sulla strip prefabbricata, si sottopone la strip ad un campo elettrico che determina il movimento delle proteine: quelle con carica netta positiva migreranno verso il catodo, mentre quelle caricate negativamente verso l’anodo. Ciascuna proteina continuerà a muoversi fino a che non raggiungerà la zona del gradiente di pH in cui la sua carica netta sarà zero, ovvero il suo pI.
42 La seconda dimensione consiste in una classica SDS-PAGE, in cui le proteine focalizzate con la prima dimensione vengono separate in base al loro peso molecolare (PM) sfruttando un gel di acrilammide come setaccio molecolare. Inizialmente, si trattano le proteine con sodio
dodecilsolfato (SDS), un detergente anionico che va a mascherare la carica elettrica delle
proteine rendendole tutte cariche negativamente, così che la separazione avvenga unicamente in funzione del loro PM. Segue poi la corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide: applicando un campo elettrico, le proteine iniziano a migrare tutte verso l’anodo in funzione della loro massa. Le molecole più piccole, che non sono impedite dalle maglie del gel, si muoveranno più velocemente, mentre le molecole più grandi, che passano con più difficoltà, migreranno più lentamente e non raggiungeranno la fine del gel una volta terminata la corsa. Dopo la corsa elettroforetica, per riconoscere le proteine all'interno del gel, è possibile applicare una colorazione. La tipologia di colorazione che viene utilizzata in questa fase viene scelta tenendo di conto anche del fatto che essa può influire sulle tecniche che verranno eseguite in seguito58,59,60.
2.2 Spettrometria di massa (MS):
La spettrometria di massa è una tecnica che viene utilizzata per l’identificazione delle proteine precedentemente separate con l’elettroforesi bidimensionale. In particolare si vanno ad analizzare i peptidi ottenuti con l’utilizzo di specifiche proteasi. Infatti, una proteina, a seguito dell’azione della proteasi specifica, genera un insieme discreto di peptidi, definiti dalla loro massa, che è unico per quella data proteina. La miscela peptidica ottenuta viene analizzata con lo spettrometro di massa. Il principio su cui si basa la MS è la possibilità di separare una miscela di ioni secondo il loro rapporto massa/carica (m/z), generalmente attraverso campi magnetici statici o oscillanti. L’analisi di spettrometria di massa si compone di tre parti: • la ionizzazione delle molecole, che avviene ad opera di un fascio di elettroni generato da una sorgente che può essere chimica o fisica;
• la separazione degli ioni generati tramite analizzatori che permettono l’ingresso degli ioni al rivelatore in modo ordinato per favorirne l’analisi;
• ed infine la rivelazione tramite strumenti che amplificano il segnale emesso dagli ioni e lo inviano ad un calcolatore che lo digitalizza e lo elabora. Il PM rilevato dallo strumento viene confrontato con standard di molecole già riconosciute in laboratorio, per poter essere identificato61.
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