AD UNA SITUAZIONE DI PERICOLO?
3.1 INTRODUZIONE
Gli animali dipendono dall’apprendimento associativo (definito come la creazione di un’associazione tra due stimoli o tra uno stimolo ed una risposta attraverso l’esperienza) per un ampio numero di scopi (Dukas 2013). Tra questi vi è anche l’evitare un pericolo quale quello rappresentato da un predatore (Turner et al 2006). Tra gli insetti, esempi in cui l’apprendimento associativo è coinvolto nell’evitare un pericolo sono molteplici e sono forniti dagli scarafaggi (Pritchatt 1968), dalle zanzare (Menda et al. 2013), dalle mosche del genere Drosophila (Quinn et al. 1974; Tully e Quinn 1985; Dukas et al. 2012), dai tafani (McGuire et al. 1990), dalle vespe della carta (Sheehan e Tibbetts 2011), dalle api senza aculeo (Craig 1994), dai bombi (Ings e Chitka 2009) e dalle api domestiche (Dukas 2001; Vergoz et al. 2007). Su questo tipo di apprendimento invece si conosce poco per quanto riguarda gli imenotteri parassitoidi (Völkl 2001). Al contrario, per gli imenotteri parassitoidi numerosi sono gli studi che si sono concentrati sull’apprendimento associativo coinvolto nella localizzazione dell’ospite (Wäckers e Lewis 1999; Takasu e Lewis 2003; Meiners et al. 2003; Costa et al. 2010) o del cibo (Takasu e Lewis 1996; Wäckers et al. 2002; Olson et al. 2003).
Per il parassitoide P. concolor l’apprendimento associativo è stato evidenziato nell’ambito del comportamento di ricerca dell’ospite ed ha coinvolto in particolare stimoli visivi. Le femmine del parassitoide infatti, dopo un’esperienza di ovideposizione nell’ospite associata ad un dato colore, hanno sviluppato una preferenza per quel dato colore (Benelli e Canale 2012a). In questo caso l’apprendimento è avvenuto in un contesto di vantaggio
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dal momento che lo stimolo incondizionato (l’ovideposizione) rappresenta per il parassitoide un’esperienza gratificante. Questa seconda parte di tesi ha inteso valutare la capacità di apprendimento associativo di P. concolor non in un contesto gratificante bensì in un contesto di pericolo. Si è voluto verificare se le femmine di P. concolor siano in grado di associare uno stimolo olfattivo innatamente attrattivo (stimolo condizionato) con uno shock elettrico (stimolo incondizionato). Lo stimolo olfattivo è stato rappresentato da due composti volatili rilasciati da frutti di pesca infestati da larve di C. capitata i quali risultano attrattivi nei confronti delle femmine del parassitoide (Benelli et al 2013a) e le guidano nella ricerca dell’ospite.
Considerando allora che gli stimoli olfattivi forniti sono per natura attrattivi, si è valutato se la loro l’innata attrattività potesse essere ridotta associando questi HIPVs (stimolo condizionato) ad un pericolo (stimolo incondizionato).
Oltre al trattamento associativo condotto con l’odore e lo shock, sono stati realizzati anche due trattamenti non associativi che fungessero da controllo i quali hanno coinvolto 1) lo shock elettrico ma non l’odore, 2) l’odore ma non lo shock elettrico.
3.2 MATERIALI E METODI
3.2.1 Allevamento del parassitoide e del suo ospite
Per l’allevamento di P. concolor e del suo ospite C. capitata si rimanda a quanto descritto nel paragrafo 2.2.1.
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3.2.2 Osservazioni generali
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una stanza illuminata con luce al neon, con una temperatura di 21±1°C ed un’umidità relativa del 50±5%. I biosaggi sono stati eseguiti tra marzo e maggio 2014, fra le ore 10.00 e le 16.00. Le femmine utilizzate per i test erano accoppiate ed avevano un’età compresa tra 6 e 12 giorni. Gli esemplari sono stati allenati e testati in condizioni di two-choice test utilizzando 2 HIPVs derivanti da frutti di pesca infestati da C. capitata: 1) etil octanoato, 2) decanale, entrambi per natura attrattivi nei confronti delle femmine del parassitoide.
3.2.3 Condizionamento del parassitoide
L’allenamento è stato realizzato all’interno di un’arena di vetro (diametro 30 mm, altezza 20 mm) contenente un piccolo disco di carta da filtro (diametro 10 mm) trattato con 2 µL di una soluzione contenente etil octanoato, o decanale, ed esano(solvente). Per entrambi gli HIPVs sono state testate due concentrazioni, 1µg/µL e 10µg/µL, risultate entrambe elettrofisiologicamente attive sulle femmine di P. concolor (Benelli et al. 2013a).
Il fondo dell’arena presentava una griglia elettrificata in grado di generare lo shock elettrico. Il sistema era costituito da due moduli: un timer (NE555), impostato in modo da fornire un shock della durata di 1.5 sec seguito da 4 sec senza shock, ed un secondo modulo che generava un voltaggio variabile da 16 a 115V attraverso un convertitore DC- DC (LT1082), regolabile attraverso un potenziometro (Dukas et al. 2012). Durante l’allenamento il voltaggio è stato mantenuto pari a 50V ed ogni femmina è stata esposta a 5 cicli di shock elettrico ognuno dei quali avente una durata di 16.5 sec. Il primo ciclo di shock di ogni allenamento è iniziato immediatamente dopo il rilascio dell’esemplare all’interno dell’arena. Il filtro con l’HIPV (stimolo condizionato) è stato sostituito con uno nuovo al termine di ogni allenamento.
Le procedure di controllo sono state eseguite in maniera analoga al trattamento associativo con la differenza che in un controllo è stato fornito solo lo shock elettrico (controllo shock) mentre nell’altro è stato fornito solo l’odore (controllo odore) (Dukas et al. 2012). Durante il trattamento di controllo per lo shock si è utilizzata l’aria e non il solvente dal momento che non può essere escluso l’apprendimento associativo del solvente da parte dei parassitoidi (Ngumbi et al. 2012). L’intervallo tra l’allenamento e la fase di test è stato di 5 min.
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3.2.4 Prove di apprendimento associativo
Per testare i parassitoidi, sia quelli allenati con lo stimolo olfattivo e lo shock elettrico che quelli allenati con solo l’odore o solo lo shock, è stato realizzato un two-choice test utilizzando l’arena descritta nel paragrafo 2.2.4 e mostrata nella figura 1.
Durante ogni test, una delle due camere laterali conteneva un ritaglio di carta da filtro (diametro 10 mm) non trattato mentre l’altra conteneva un identico ritaglio di carta da filtro trattato con 2µL di una soluzione costituita da un HIPV e da esano. Per entrambi gli HIPVs sono stati testate due concentrazioni: 1µg/µL e 10µg/µL.
Per ogni prova l’insetto è stato rilasciato all’interno della camera centrale ed osservato per 8 min. Si è ritenuto che la femmina avesse compiuto una scelta dopo essere entrata in una delle due camere ed esserci rimasta per almeno 20 sec mostrando in questo tempo antennal drumming e walking (Benelli et al. 2014a). La prova è stata considerata conclusa una volta che la femmina si era allontanata dallo stimolo scelto. Gli esemplari che entro 7 min dal rilascio non avevano compiuto alcuna scelta sono stati scartati. Per ogni HIPV testato e per ogni concentrazione sono state eseguite 30 repliche. Per ogni prova effettuata, sia per le femmine del controllo che per quelle allenate con l’odore e lo shock, sono stati raccolti i dati relativi a 1) stimolo scelto, 2) tempo di permanenza sullo stimolo. Gli stimoli sono stati rinnovati dopo ogni replica, mentre ogni 5 prove l’arena è stata accuratamente lavata con acqua tiepida e sapone, asciugata e trattata con esano. Per evitare che la posizione degli stimoli avesse un effetto sulla scelta, ogni 5 repliche la loro posizione è stata invertita e l’arena è stata ruotata.
3.2.5 Analisi statistica dei dati
Per ogni choice-test, per confrontare il numero di parassitoidi che hanno scelto un dato stimolo è stato utilizzato il test del χ2 con correzione di Yates. I dati relativi al tempo di permanenza sullo stimolo sono stati analizzati con un modello lineare generalizzato con un fattore fisso: y = Xß + ε dove y è il vettore delle osservazioni (tempo di permanenza), X è la matrice di incidenza, ß è il vettore degli effetti fissi (il trattamento) e ε è il vettore dei residui effetti casuali.
3.3 RISULTATI
I risultati hanno mostrato che le femmine di P. concolor sono in grado di associare entrambi gli HIPVs alla presenza di un pericolo solamente se questi vengono testati alla
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concentrazione maggiore. Quando etil octanoato e decanale vengono impiegati alla concentrazione di 10µg/µL le femmine del braconide scelgono in modo significativamente maggiore l’aria piuttosto che gli HIPVs, mentre quando i due composti vengono testati alla concentrazione di 1µg/µL il numero degli esemplari che scelgono l’aria non è significativamente maggiore rispetto al numero degli esemplari che scelgono i due composti (Fig. 2).
Figura 2: Effetto dell'apprendimento associativo in presenza di un pericolo sull’attrattività
esercitata da differenti HIPVs sulle femmine accoppiate di P. concolor. Gli HIPVs sono stati testati all’interno di una arena in un two-choice test vs aria. Per ogni esperimento, l’asterisco indica differenze significative nelle scelte delle femmine di P. concolor (test del χ2 con correzione di Yates, P<0.05 ; naïve = femmine che non hanno subito il condizionamento; trained = femmine condizionate mediante associazione tra stimolo e shock elettrico) (da Benelli et al. 2014c)
35 Training Treatment A Time spent on the cue (s) (±SE) Treatment B Time spent on the cue (s) (±SE) χ2 d.f. P Compound Dosage (µg/µL) Odour + Shock Ethyl octanoate 1 301.88 ± 41.33 Blank 229.14 ± 36.17 1.774 1 0.183 ns 10 155.50 ± 30.78 265.59 ± 32.79 3.648 1 0.052 * Decanal 1 243.47 ± 38.82 275.47 ± 43.45 0.321 1 0.571 ns 10 86.00 ± 19.36 268.18 ± 25.80 13.960 1 < 0.001 * Odour Ethyl octanoate 1 262.54 ± 27.07 Blank 168.00 ± 25.23 3.934 1 0.047 * 10 280.50 ± 30.44 234.50 ± 45.68 0.676 1 0.411 ns Decanal 1 345.83 ± 32.56 309.00 ± 49.02 0.341 1 0.559 ns 10 299.41 ± 30.35 220.12 ± 56.85 1.770 1 0.183 ns Shock Ethyl octanoate 1 282.04 ± 27.84 Blank 138.86 ± 33.75 6.696 1 0.009 * 10 283.17 ± 28.54 297.86 ± 54.18 0.065 1 0.799 ns Decanal 1 255.41 ± 29.22 181.50 ± 33.65 2.029 1 0.154 ns 10 279.18 ± 29.53 215.63 ± 52.07 1.255 1 0.263 ns
Tabella 1: Tempo medio speso su un dato stimolo (Treatment A, Treatment B) da femmine di P.
concolor precedentemente esposte a i) HIPVs e shock elettrico, ii) HIPVs, iii) shock elettrico. Per ogni riga, l’asterisco indica una differenza significativa; ns = mancanza di significatività; d.f. = grado di libertà (Modello Lineare Generalizzato, P<0.05) (da Benelli et al. 2014c)
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Per quanto riguarda i due controlli, in entrambi i trattamenti i due HIPVs hanno ribadito la loro innata attrattività nei confronti delle femmine di P. concolor, confermando così l’affidabilità dei risultati ottenuti nel trattamento associativo (Fig. 2). I risultati delle due prove non associative mostrano poi che i parassitoidi, pur preferendo gli HIPVs al controllo, non trascorrono su di questi un tempo significativamente maggiore (Tab. 1). Fa eccezione l’etil octanoato testato alla concentrazione di 1µg/µL per il quale i tempi di permanenza sono maggiori che sul controllo per entrambi i trattamenti non associativi. Le femmine allenate con l’odore e lo shock congiuntamente trascorrono più tempo sullo stimolo non associato al pericolo quando gli HIPVs sono testati alla concentrazione maggiore, mentre quando questi sono testati alla concentrazione minore il tempo di permanenza sullo stimolo associato alla mancanza di pericolo non risulta significativamente maggiore rispetto al tempo di permanenza sui composti (Tab. 1).
3.4 DISCUSSIONE
Le femmine del braconide P. concolor sono risultate in grado di apprendere uno stimolo olfattivo in un contesto di pericolo. Questo apprendimento associativo annulla l’innata attrattività di etil octanoato e decanale quando i due HIPVs sono testati alla concentrazione minore, mentre la inverte quando questi sono testati alla concentrazione maggiore. Infatti nel primo caso le femmine testate non preferiscono in maniera significativamente maggiore né gli HIPVs, per natura attrattivi, né il controllo mentre nel secondo caso è emersa una preferenza significativa per il controllo. Psyttalia concolor ha dimostrato quindi di apprendere degli stimoli sia in presenza di uno stimolo incondizionato gratificante, come evidenziato da Benelli e Canale (2012a) - che hanno dimostrato che le femmine del braconide sviluppano una preferenza per degli stimoli visivi (colori) associati ad un’esperienza di ovideposizione - che in presenza di uno stimolo incondizionato non gratificante, come evidenziato da questo lavoro. Il fatto che l’attrattività innata di etil octanoato e decanale sia invertita unicamente quando i due HIPVs sono testati al dosaggio maggiore mentre viene annullata quando testati al dosaggio minore può essere collegato ad un effetto dose-risposta. Infatti, sebbene per le femmine di P. concolor entrambi gli HIPVs siano elettrofisiologicamente attivi sia alla concentrazione di 1µg/µL che a quella di 10µg/µL, è stato evidenziato che sia etil octanoato che decanale producono aumenti significativi delle risposte antennali del braconide quando la concentrazione alla quale vengono testati cresce da 1 a 10 µg/µL (Benelli et al. 2013a).
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Tra gli insetti un caso analogo in cui l’apprendimento associativo in presenza di un pericolo porta ad invertire una preferenza innata è rappresentato dalla zanzara Aedes
aegypti. È stato infatti dimostrato che questa specie impara ad evitare stimoli
precedentemente attrattivi (un colore ed un odore) dopo averli associati ad uno shock elettrico (Menda et al. 2013).
È stato ampiamente dimostrato che gli imenotteri parassitoidi sono in grado di apprendere stimoli visivi (Segura et al. 2007; Benelli Canale 2012a; Wäckers e Lewis 1999) ed olfattivi (Takasu e Lewis 2003; Meiners et al. 2003; Costa et al. 2010) quando tali stimoli sono coinvolti nella ricerca dell’ospite o di fonti alimentari ( Takasu e Lewis 1996; Oliai e King 2000; Wäckers et al. 2002). Al contrario, per quanto ci è dato sapere, fino ad ora per i parassitoidi non sono stati pubblicati dati che riguardano l’apprendimento associativo di stimoli olfattivi quando tale apprendimento è coinvolto nell’evitare un pericolo, per quanto sia stato evidenziato che le femmine dell’imenottero eucoilide L. heterotoma, endoparassitoide degli stadi larvali del genere Drosophila, durante la ricerca dell’ospite evitano di visitare i microhabitat dell’ospite che presentano l’odore di parassitoidi conspecifici ed etero specifici (L. clavipes) (Janssen 1995a,b).