DNA G quadruplex

Come ulteriore caso di studio, trattiamo il telomero umano 143D per il qua- le abbiamo applicato una strategia di indagine semplicata. A dierenza dell'RNA non è stato infatti possibile esplorare gli eetti delle uttuazio- ni strutturali e d'ambiente attraverso la simulazione di dinamica molecolare classica, ma l'analisi si è concentrata solamente sulla struttura NMR. I risul-

tati precedenti hanno messo in evidenza come le diverse conformazioni NMR per il sistema 2KOC fornissero spettri CD del tutto paragonabili a causa delle loro similirità strutturale. Per quanto riguarda il G quadruplex, dato che le 6 conformazioni disponibili risultano anche in questo caso molto simili tra loro, abbiamo analizzato solo una di queste in modo da ridurre il costo computazionale.

Il quadruplesso ha una complessità strutturale maggiore dell'RNA, infatti esso contiene un numero di basi azotate superiore a quello del lamento di RNA (ventuno contro quattordici) ed inoltre i quartetti di guanine presenti nel quadrulex danno luogo ad un elevato numero di interazioni. Per que- sto motivo abbiamo cercato di creare un modello strutturale semplicato individuando un sottoinsieme di cromofori minimo in grado di riprodurre le proprietà spettroscopiche. Da lavori pubblicati in letteratura su sistemi si- mili [33], è noto che il segnale di dicrosimo per questo tipo di arrangiamento molecolare è determinato dalla disposizione relativa dei quartetti di guanine che giacciono su uno stesso piano, dovuto questo al modo con cui il lamento di DNA si ripiega a formare la caratteristica struttura.

Per questo motivo abbiamo eettuato prima un calcolo in vuoto (Figura 3.20), prendendo in considerazione come sistema QM le singole basi azotate, e costruendo matrici eccitoniche di dimensioni diverse: i) sistema completo che include l'intera struttura del quadruplex (ALL); ii) sistema semplica- to che considera solo i 3 piani di guanine centrali (sC) per un totale di 12 cromofori e 66 accoppiamenti. Questa modellizzazione è riportata in Figura 3.19.

Lo spettro di assorbimento della guanina è inoltre caratterizzato da due tran- sizioni elettroniche più intense a bassa energia di tipo π → π∗ _{che, come}

mostrato nella sezione 3.2, risultano rispettivamente intorno a 5.20 eV e 5.60 eV. Possiamo quindi calcolare uno spettro CD eccitonico selezionando solo queste due transizioni in modo da ottenere un Hamiltoniano eccitonico di di- mensioni ridotte (spettro sC,sT). Compariamo gli spettri risultanti da questi tre diversi approcci.

Gli spettri simulati in vuoto mostrano un prolo analogo al dato sperimen- tale. Dal confronto tra lo spettro ALL e quello sC risulta evidente che il couplet ad alta energia, intono a 180 nm, è dovuto alla presenza dei residui di Adenina e Timina, i quali presentano assorbimenti in questa regione. Lo spettro sC,sT risulta essere del tutto simile a quello sC. Questo indica che il segnale CD è determinato solo dalle transizioni più intense e non si modi- ca se vengono incluse transizioni elettroniche con forza dell'oscillatore bassa. In tutti i casi resta l'elevato blueshift ed il dierente rapporto relativo delle intensità dei picchi rispetto allo spettro sperimentale.

CAPITOLO 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 55

Figura 3.19: Rappresentazione del sistema in cui sono stati selezionati come cromofori QM solo le guanine, mentre il resto, in grigio, è incluso solo come ambiente; per ogni cromoforo QM, o coppia di questi per i calcoli dei cou- plings, l'ambiente è rappresentanto dalla struttura del G quadruplex da cui sono stati rimossi i sottosistemi QM

Figura 3.20: Spettri ECCD del G quadruplex simulati in vuoto a partire da diverse matrici eccitoniche. Lo spettro ALL considera tutte le transizioni di tutti i cromofori, lo spettro sC considera tutte le transizioni relative ai 3 piani di guanine centrali, lo spettro sC,sT considera solo le prime due transizioni π → π∗ realtive ai 3 piani di guanine centrali.

CAPITOLO 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 57 l'ambiente con il modello MMPol. Anche in questo caso consideriamo come porzione quantomeccanica la singola base azotata e descriviamo l'eetto degli altri cromofori, ed eventualmente del backbone, attraverso un set di cariche e dipoli indotti. La mancanza dei dati di simulazione di dinamica molecolare classica non permette di studiare un modello in cui è incluso esplicitamente anche il solvente. Visto quanto concluso dall'analisi in vuoto mostreremo gli spettri provenienti dai calcoli su di un sistema modello costituito dalle sole guanine, analogo quindi al precedente sC per la scelta dei cromofori QM ma in cui è stato rimosso il backbone del quadruplex e le altre basi azotate. Su questo sistema simuliamo due spettri: uno proveniente dalla matrice eccito- nica che comprende tutte le transizioni prese in considerazione (6) e l'altro, in analogia a quanto fatto in vuoto, dalla matrice eccitonica semplicata se- lezionando le sole due transizioni π → π∗ _{più intense a bassa energia, in uno}

shcema analogo a quello applicato per lo spettro sT,sC. Rispetto al vuoto la dierenza in MMPol sta nel diverso ambiente che i cromofori sentono nel sistema reale rispetto a quello nel sistema semplicato, dove questo è costi- tuito dalle sole altre guanine.

Compariamo questi due risultati con lo spettro proveniente dal G quadru- plex, senza alcuna selezione e comprendendo l'intera struttura, in ambiente MMPol (Figura 3.21).

Contrariamente al vuoto qui il tipo di selezione modica notevolmente l'a- spetto dello spettro, e nell'ordine:

- gli spettri sul sistema modello, con e senza selezione delle transizioni, mostrano un prolo spettrale praticamente sovrapposto, conferman- do che anche in questo caso bastano le prime transizioni bright per descrivere bene le proprietà spettroscopiche del sistema.

- lo spettro completo ALL risulta nettamente diverso rispetto agli altri due. Il couplet a più alta energia si sposta a lunghezze d'onda maggiori contribendo ad incrementare l'intensità del picco intorno a 200 nm. La banda positiva intorno a 240 nm risulta invece meno intensa.

I dati ci indicano quanto la simulazione dello spettro CD sia sensibile all'ef- fetto dell'MMPol. Solo nel caso intermedio, cioè considerando solo le guanine come cromofori, si ottiene un buon accordo col dato in vuoto , conservandone anche tutti i difetti già indicati e tra questi sopratutto il notevole blueshift rispetto al dato sperimentale, come già sottolineato, ed anche qui l'inclusio- ne di transizioni elettroniche al di fuori delle bright più intense non ha alcun eetto.

Figura 3.21: Spettri ECCD del G quadruplex simulati in MMPol a partire da diverse matrici eccitoniche. Lo spettro ALL considera tutte le transizioni di tutti i cromofori, lo spettro G quartet considera tutte le transizioni relative ai 3 piani di guanine isolati mentre lo spettro G quartet,sT considera solo le prime due transizioni π → π∗ _{realtive a questi.}

CAPITOLO 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 59 mentre con ambiente MMPol il miglior risultato si ottiene con la selezio- ne dei quartetti di guanine, siamo anche giunti al punto in questione: un sistema più semplice, ma che conservi le principali proprietà di risposta spet- troscopica dell'intera molecola biologica, si può considerare e si trova essere rappresentato dai piani dei quartetti G, che costituiscono anche la peculia- rità strutturale del telomero. Oltre a ciò è suciente tener conto di poche transizioni, le più intense, senza includere quelle a più alta energia e dark, con un eetto positvo sul tempo di calcolo.

Prima di procedere con l'analisi proviamo a spiegare lo spostamento in ener- gie (circa 1 eV verso il blu) cercando anche di includere l'eetto del solvente. Una valida alternativa all'MMPol è rappresentata dall'utilizzo di un modello continuo (Capitolo 2) che permette di tener conto in maniera implicita del- l'eetto di bulk dovuto alla presenza del solvente, descritto attraverso la sua costante dielettrica. Ai risultatati già mostrati aggiungiamo quindi anche il risultato ottenuto da un calcolo PCM, in cui il soluto è rappresentato dalle sole guanine, collocate all'interno di una cavità molecolare che comprende i tre piani di queste.

Come nei casi precedenti, il sistema modello viene ulteriormente sempli- cato selezionando le prime due transizioni più intense. Lo spettro ottenuto con questo Hamiltoniano eccitonico, viene confrontato in Figura 3.22 con lo spettro CD calcolato a partire dallo stesso Hamiltoniano, ma sostituendo le site energies calcolate con quelle sperimentali trovate in letteratura [33] (4.4 eV e 4.9 eV circa).

Dal momento che abbiamo mantenuto gli stessi valori per i coupling, le varia- zioni nelle forme delle bande sono associabili principalmente ad un generale spostamento dello spettro verso lunghezze d'onda maggiori. Tale spostamen- to può essere quanticato confrontando la posizione delle due bande positive a lunghezze d'onda maggiori, e risulta essere pari a 0.7 eV, una quantità ben maggiore dell'errore del metodo DFT rispetto al CCSD(T).

A questo punto confrontiamo in 3.23 i risultati ottenuti con i diversi model- li di ambiente con il dato sperimentale, tenendo conto dello shift energetico sopra stimato. Per questo confronto abbiamo considerato solo il sistema sem- plicato costituito dai tre piani di guanine in ragione dei confronti fatti in precedenza.

Tutti gli spettri calcolati riproducono bene la sequenza dei segni dei picchi. Il vuoto ed il PCM risultano quasi sovrapposti e risultano più vicini al dato sperimentale in termini di distanza relativa tra i picchi. Anche lo spettro MMPol è molto simile ai precedenti anche se risulta lievemente più com- presso, in analogia a quanto osservato precedentemente nel caso della beta hairpin sulle strutture NMR. Inoltre, possiamo dire che l'eetto di bulk del solvente descritto con il modello PCM non sembra essere signicativo ai ni

Figura 3.22: Spettri ECCD simulati col modello PCM sul sistema model- lo costituito da sole guanine: lo spettro in blu è ottenuto usando valori sperimentali per le site energies.

Figura 3.23: Spettri ECCD del G quadruplex realtivi al sistema semplica- to costituto dai tre piani di guanine calcolati utilizzando diversi modelli di ambiente. Gli spettri calcolati sono stati shiftati di 0.7 eV.

CAPITOLO 3. RISULTATI E DISCUSSIONE 61 della riproduzione dello spettro. Va inoltre sottolineato che il picco meglio riprodotto è quello della banda intensa intorno ai 260 nm, sia per l'intensità che per la forma; solo nell'MMPol risulta più stretto per le ragioni già evi- denziate.

Lo shift applicato, stimato dal calcolo precedente, permette quindi di otte- nere una buona sovrapposizione tra gli spettri calcolati ed il dato sperimen- tale. questo risultato suggerisce che lo shift osservato è dovuto ad un errore intrinseco del TDDFT sulle site energies delle guanine.

Capitolo

4

Conclusioni

In questo lavoro di tesi abbiamo applicato diversi modelli QM/Classici per descrivere le proprietà chirottiche di molecole biologiche multicromoforiche come l'RNA β hairpin 2KOC ed il telomero umano 143D, in modo da si- mularne gli spettri CD. Per tale scopo abbiamo descritto gli stati eccitati delle due molecole biologiche grazie alla teoria eccitonica, considerandoli cioè come combinazioni lineari degli stati eccitati dei singoli cromofori. Per far questo abbiamo calcolato le energie di eccitazioni dei singoli cromofori e le interazioni tra le stesse (in termini dei coupling eccitonici) usando l'approc- cio quantomeccanico di tipo TDDFT. In particolare, per calcolare i coupling, abbiamo utilizzato un metodo che va oltre l'approssimazione dipolare impie- gando invece le densità elettroniche di transizione. Dai calcoli quantistici abbiamo ricavato anche le grandezze siche necessarie al calcolo della forza rotazionale e quindi abbiamo riprodotto gli spettri ECCD dei due oligomeri. Per introdurre gli eetti dell'ambiente abbiamo impiegato un approccio di tipo ibrido, in cui cioè si combina una descrizione quantomeccanica con una classica. Due modelli alternativi sono stati utilizzati per descrivere la parte classica: un modello di tipo atomistico in cui ogni atomo dell'ambiente è de- scritto da una carica puntiforme e da una polarizzabilità (metodo MMPol) e un modello continuo in cui l'ambiente perde la sua natura atomistica e viene descritto come un dielettrico (PCM).

Più in particolare nel caso della β hairpin si è fatto uso della Dinamica Mole- colare classica con solvente esplicito e dalla traiettoria così ottenuta sono stati estratti varie congurazioni, su ciascuno delle quali sono stati svolti i calcoli QM facendo poi una media e comparando i risultati da questo sampling con quelli sulle strutture NMR. Utilizzando questa metodologia è possibile tener conto delle uttuazioni d'ambiente e strutturali del sistema. Si è impiegato in questo caso il metodo QM/MMPol dove i singoli cromofori o le coppie

CAPITOLO 4. CONCLUSIONI 63 di questi vengono considerati a livello QM mentre il resto della molecola a livello MMPol; nel caso del sampling sulla dinamica essendo presente anche il solvente acquoso, anche questo è stato descritto a livello MMPol. É stata condotta un'analisi comparata tra i risultati ottenuti sulle strutture NMR ed MD in vuoto, non ottenendo un buon accordo con i dati sperimentali. Si è proceduto allo stesso modo includendo la descrizione dell'ambiente potendo apprezzare un notevole miglioramento della riproduzione dello spettro speri- mentale della β hairpin. In conclusione possiamo dire che l'accoppiamento del modello QM/MMPol con la dinamica classica in solvente ore un buon me- todo per la simulazione delle proprietà chirottiche di sistemi complessi, come il caso in esame dell'RNA β hairpin, grazie in particolare all'inclusione della distribuzione statistica della proprietà di risposta spettroscopica dovuta sia alle uttuazioni strutturali del sistema che a quelle dell'ambiente. Invece nel caso degli spettri sulle strutture NMR la rappresentazione statica del sistema abbinata alla descrizione MMPol dell'intorno molecolare per ogni cromoforo QM introduce un'asimmetria nel sistema che sembra condurre il modello a sovrastimare gli eetti elettrostatici e di polarizzazione. Per il G quadruplex si è operato in modo diverso, non avendo fatto una simulazione di dinamica classica su questo più complesso sistema. Abbiamo trovato nei quartetti di guanine, che rappresentano la peculiarità strutturale di questo sistema, l'in- sieme minimo di cromofori con cui riprodurre la risposta spettroscopica della molecola selezionando solo questi come cromofori QM. Da questo approccio semplicato si sono ottenuti spettri spostati ad energie notevolmente più alte rispetto al dato sperimentale. Per cercare ragione della discrepanza tra cal- colo ed esperimento abbiamo utilizzato un sistema modello, costituito dalle sole guanine disposte come nel G quadruplex ma eliminando il resto della struttura, su cui si è applicato il metodo QM/PCM per includere l'eetto di bulk del solvente . Con questo modello semplicato, abbiamo trovato lo shift dello spettro simulato rispetto al dato sperimentale, suggerendo come questo sia dovuto ad un errore intrinseco del metodo TDDFT utilizzato. Ab- biamo poi applicato lo stesso schema QM/MMPol usato nel caso dell'hairpin anche a questo modello semplicato costituito dai soli quartetti di guanine. Utlizzando i risultati così ottenuti, ma traslando gli spettri simulati in base all'errore intrinseco del metodo, si è trovato un buon accordo col dato spe- rimentale anche se nel caso dell'MMPol si sono riscontrati gli stessi difetti osservati nella simulazione dello spettro dell'hairpin sulla base di strutture NMR. In conclusione possiamo proporre come futura applicazione uno studio di dinamica molecolare anche nel caso del G quadruplex in modo da poter vericare i risultati già esposti e discussi sulla β hairpin e l'estensione de- gli approcci proposti anche a sistemi diversi dagli oligonucleotidi, come ad esempio proteine che mostrino attività ottica, e combinando l'approccio MM

Elenco delle tabelle

3.1 Adenina. Comparazione delle energie di stato eccitato e forza dell'oscillatore (f) tra CC ed i funzionali PBE0, B3LYP, CAM- B3LYP, M062X e col metodo ZINDO. . . 31 3.2 Citosina. Comparazione delle energie di stato eccitato e forza

dell'oscillatore (f) tra CC ed i funzionali PBE0, B3LYP, CAM- B3LYP e M062X e col metodo ZINDO. . . 32 3.3 Guanina. Comparazione delle energie di stato eccitato e forza

dell'oscillatore (f) tra CC ed i funzionali PBE0, B3LYP CAM- B3LYP e M062X e col metodo ZINDO. . . 33 3.4 Uracile. Comparazione delle energie di stato eccitato e forza

dell'oscillatore (f) tra CC ed i funzionali PBE0, B3LYP, CAM- B3LYP e M062X e col metodo ZINDO. . . 34 3.5 Dimero CG. Comparazione delle energie di stato eccitato e

forza dell'oscillatore (f) tra CC ed i funzionali PBE0, B3LYP, CAM-B3LYP e M062X e col metodo ZINDO. . . 35 3.6 Correlazione delle energie DFT e ZINDO con il riferimento

CC per ciascun funzionale e ciascuna base azotata. . . 36 3.7 Valor medio dello spostamento in energia degli stati eccitati

DFT rispetto al CCSD(T); riportiamo la deviazione media assoluta (MAD), ottenuta come media sui valori assoluti degli spostamenti ∆E dell'energia DFT rispetto a quella CC. . . 37

Elenco delle gure

1.1 RNA β hairpin: la sequenza che la identica in termini delle basi azotate in essa contenute è (GGCACUUCGGUGCC) di 14 nucleotidi; le quattro basi centrali (UUCG) formano il loop della struttura a forcina. . . 5 1.2 DNA G quadruplex: la sequenza che identica questo oligo-

nucleotide ricco in guanine è [AG3(T2AG3)3]; i 22 nucleotidi si avvolgono nella caratteristica struttura telomerica dove le guanine formano dei quartetti che identicano 3 piani nella parte centrale della struttura. . . 6 3.1 Riportiamo uno schema semplicato della struttura del qua-

druplesso (a) e di uno dei tre piani di guanine che costituisco- no la parte principale della sua struttura; ogni guanina forma due legami ad idrogeno con ognuna delle sue due vicine, così da essere tenute insieme complessivamente da otto legami ad idrogeno. . . 25 3.2 Spettri CD sperimentali della struttura 2KOC e 143D regi-

strati in soluzione acquosa. . . 27 3.3 Adenina: il CAM-B3LYP è rappresentato in turchese, l'M062X

in nero, il PBE0 in rosso, in blu il B3LYP ed in grigio lo ZINDO. 29 3.4 Citosina: il CAM-B3LYP è rappresentato in turchese, l'M062X

in nero, il PBE0 in rosso, in blu il B3LYP ed in grigio lo ZINDO. 29 3.5 Guanina ed Uracile. Il CAM-B3LYP è rappresentato in tur-

chese, l'M062X in nero, il PBE0 in rosso, in blu il B3LYP ed in grigio lo ZINDO. . . 30 3.6 Dimero CG. Il CAM-B3LYP è rappresentato in turchese, l'M062X

in nero, il PBE0 in rosso, in blu il B3LYP ed in grigio lo ZINDO. . . 37

ELENCO DELLE FIGURE 67 3.7 Rappresentazione schematica della β-hairpin. . . 39 3.8 Si riportano con colori diversi gli andamenti dell'energia totale

del sistema durante la dinamica e le fasi di equilibratura: in nero (prima frazione del graco praticamente indistinguibile all'asse delle ordinate) ed in rosso sono riportati i valori di energia totale durante l'equilibratura del sistema a V costante mentre in verde ed in blu durante la fase di dinamica; è evi- dente come l'energia totale si stabilizzi intorno ad un valore medio già dopo poche centinani di femtosecondi. . . 42 3.9 L'andamento della pressione (sinistra) e della densità (destra)

del sistema raggiungono entrambe un plateau già entro il pri- mo ns di dinamica NPT. . . 43 3.10 Riportiamo l'RMSD calcolato rispetto alla struttura di parten-

za su di un campione di strutture estratte dalla MD; questo oscilla attorno ad un valor medio di circa 1.6 Å. . . 44 3.11 Confronto tra la struttura NMR iniziale (a) e variazioni strut-

turali durante la dinamica (b). Gli atomi di idrogeno sono omessi per chiarezza. Nella gura (b) le strutture rappresen- tate in rosso corrispondono alla geometria NMR. . . 45 3.12 Confronto tra gli spettri ECCD di ogni conformero NMR e la

loro media; i venti spettri, ciscuno per ogni struttura sperimen- tale, sono stati mediati direttamente per ottenere lo spettro Ave-NMR. . . 46 3.13 Tutte le simulazioni degli spettri ECCD sono riportate in -

gura, dove col presso 'Ave' si intende la media sugli snap- shots dell'MD e con 'NMR' lo spettro medio dalle strutture sperimentali. . . 47 3.14 Gli spettri ECCD simulati sono riportati insieme al dato spe-

rimentale shiftando di una stessa quantità (0.25 eV) i risultati del calcolo, così da sovrapporre alla banda sperimentale in- torno ai 265 nm la corrispondente dello spettro simulato da MD. . . 48 3.15 In grigio è rappresentato l'ambiente descritto a livello MMPol;

è evidenziato il residuo da cui viene presa la struttura della base azotata che fa da cromoforo mentre il resto del residuo rientra nella descrizione MMPol. . . 50 3.16 Confronto tra gli spettri ECCD di ogni conformero NMR e

la loro media, includendo gli eetti dell'ambiente secondo il modello NMR @ MMPol. . . 51

3.17 Tutte le simulazioni degli spettri ECCD sono riportate in -