Gli strisci citologici sono stati ottenuti tramite aspirazione con ago sottile di tessuti o fluidi patologici riscontrati all’esame clinico. Nella stragrande maggioranza dei casi, il prelievo è stato eseguito sui linfonodi interessati da megalia; nei casi di linfoadenopatia sistemica si è preferito effettuare il campionamento sui linfonodi prescapolari o poplitei evitando i sottomandibolari e perifaringei1, poiché drenano le prime vie del tratto
digerente e respiratorio e quindi frequentemente interessati da processi flogistici aspecifici.
Dopo tricotomia e disinfezione della parte interessata, il linfonodo viene individuato con una mano, mentre con l’altra si inserisce un ago senza siringa da 21 G nel tessuto e lo si fa penetrare più volte in diverse direzioni e profondità. Il tessuto linfonodale viene così accumulato all’interno dell’ago per capillarità. A questo punto si estrae l’ago dalla massa e si aspira aria da una siringa da 5ml senza ago e la si connette all’ago utilizzato per l’infissione; si espelle il materiale prelevato su vetrini portaoggetti. I vetrini vengono strisciati per apposizione parallela, due per volta, uno sull’altro, lasciati asciugare e colorati con coloratrice automatica con metodo May Grunwald Giemsa e osservati al microscopio ottico, inizialmente a ridotto ingrandimento (obiettivo 20x), poi a maggiore ingrandimento (obiettivo 40x) ed infine con l’obiettivo ad immersione 100x.
Agoaspirato midollare
In 82 casi del gruppo italiano è stato eseguito anche il prelievo midollare. L’agoaspirato midollare è stato eseguito preferibilmente dalla cresta iliaca, in alternativa dallo sterno, tramite un ago midollare munito di mandrino, di tipo Illinois. Dopo tricotomia nella regione anatomica scelta, si disinfetta e si infiltra con anestetico locale (1ml di Lidocaina), quindi l’ago viene infisso mantenendo il mandrino in sede. Quando la punta dell’ago tocca la corticale dell’osso, si effettuano lenti movimenti rotatori sul piano verticale, fino a che questa non inizia a penetrare l’osso e si continua con movimento più vigorosi, fino a che l’ago non risulta saldamente infisso nell’osso. A questo punto si rimuove lo stiletto centrale e si raccorda l’ago a una siringa da 10 ml, si retrae lo stantuffo e si aspira: il materiale midollare così ottenuto viene espulso su vetrini portaoggetto con banda smerigliata, fatti poi scivolare per apposizione parallela. Gli strisci ottenuti sono poi colorati e letti con la stessa metodica descritta per il prelievo linfonodale.
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Biopsia escissionale
In 72 casi del gruppo thailandese è stato eseguito un ulteriore esame istologico poiché la diagnosi citologica risultava dubbia o incompleta. La biopsia è stata eseguita previa tricotomia, disinfezione e anestesia del campo chirurgico tramite anestetico locale (lidocaina 1ml) di linfonodi megalici, masse extranodali o su lesioni cutanee. La tecnica è stata eseguita tramite biopsia escissionale o tramite l’utilizzo di punch. In entrambi i casi l’asportazione è stata eseguita in maniera tale che la biopsia comprendeva sia il tessuto centrale, sede della lesione, sia quello periferico, considerato sano. Successivamente la ferita chirurgica è stata chiusa con punti semplici staccati. I campioni prelevati sono stati fissati in formalina al 10% per 48h e inclusi in paraffina da cui successivamente sono state ottenute delle sezioni di 5micron di spessore tramite sezionamento al microtomo; le sezioni, una volta poste su vetrini portaoggetti, sono state colorate con ematossilina-eosina ed esaminate al microscopio ottico dai patologi del Dipartimento di Anatomia Patologica dell’Ospedale Didattico Veterinario Bangkhen dell’Università di Kasetsar.
Immunofenotipizzazione
L’identificazione della tipologia cellulare è stata eseguita in 2 metodiche diverse nei gruppi di studio: nel gruppo italiano è stata effettuata tramite citofluorimetria a flusso presso il Laboratorio di analisi della Clinica Veterinaria Privata “San Marco” di Padova (79 casi), mentre nel gruppo di studio dei casi thailandesi è stato eseguito l’esame di immunoistochimica su 110 casi.
Citofluorimetria
La citofluorimetria è diventata una tecnica relativamente diffusa per classificare le linee cellulari nelle popolazioni ematopoietiche. L’identificazione avviene tramite il riconoscimento di marker cellulari che vengono sovra-espressi sulle cellule neoplastiche e che normalmente non si trovano sulle cellule non neoplastiche. Parte del materiale aspirato dal midollo o linfonodo viene sospeso in 1ml di soluzione PBS (phosphate
buffered saline) tenuto a 4°C, mentre il sangue periferico e il midollo osseo vengono
raccolti all’interno di provette con EDTA. Vengono prelevati circa 100 microlitri di materiale a cui vengono aggiunti dai 5 ai 10 microlitri di immunoglobuline e lasciati reagire per 30’ a 20°: gli anticorpi utilizzati per la determinazione dell’immunofenotipo cellulare in corso di linfoma sono anticorpi anti CD3, CD4, CD8, CD45, CD21 e CD79a. Successivamente vengono aggiunti 2 ml di soluzione di lisi per 15’, il composto viene poi centrifugato per 10’ a 1200g. una volta separato il supernatante, il composto viene diluito con 4ml PBS e centrifugato per 10’ a 1200g e risospeso con un altro 1mL di PBS prima dell’analisi citofluorimetrica. Il citofluorimetro utilizzato è il CYTOMICS FC 500 della Beckman Coulter, Miami, FL, USA.
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Immunoistochimica
Le sezioni tissutali che sono state prelevate durante la biopsia per l’esecuzione dell’esame istologico sono state inoltre utilizzate per l’esame immunoistochimico (IHC) per la determinazione dell’immunofenotipo. Le sezioni di 5 micron tagliate dal blocchetto di paraffina vengono montate su un vetrino portaoggetti e riscaldate a 60° in forno per 1h per permettere l’aderenza della sezione sul vetrino. Successivamente viene eseguita la deparaffinazione e reidratazione delle sezioni tramite l’immersione dei vetrini in concentrazioni decrescenti di etanolo (da 100 a 95%). La colorazione IHC viene eseguita tramite il sistema Novolink polymer detection che impiega una tecnica di polimerizzazione controllata che consente l'identificazione qualitativa in microscopia ottica degli antigeni in sezioni tissutali fissati attraverso fasi sequenziali intervallate da fasi di lavaggio. Il kit comprende i seguenti reagenti: blocco della perossidasi endogena, blocco proteina endogena, anticorpi secondari anti Ig in siero animale al 10% in soluzione salina tamponata con tris/proclin allo 0,09%, DAB cromogeno diaminobendizina in soluzione stabilizzante, soluzione tampone, ematossilina.
Le sezioni sono state immerse in un buffer citrato 0,1 M a pH 6.0 per 15’ in un forno a microonde a 200w. È stata successivamente applicata il blocco della perossidasi endogena per 5’ ed è stato successivamente applicato l’anticorpo primario alle sezioni per 30’ a temperatura ambiente, sono stati utilizzati anticorpi policlonali di coniglio contro CD3 (Leica Bond, Newcastle, UK) per l’identificazione delle linee cellulari di tipo T e anticorpi monoclonali diretti contro CD79a per l’identificazione della linea pan-B. Per l’immunoidentificazione i vetrini sono stati incubati col blocco proteico post-primario (Post Primary Block) contenente anticorpi anticoniglio coniugati con l’host reactive protein (HRP) in camera umidificata a 37° per 15’. Per la visualizzazione del legame anticorpale è stata sviluppata la reazione perossidasica tramite l’incubazione della sezione per 5’ con un cromogeno DAB+ (3,3'-diaminobendizina), 5 microlitri cromogeno in 1 ml di soluzione, che produce un precipitato visibile marrone in corrispondenza del sito antigenico. Le sezioni tissutali vengono contro-colorate con ematossilina e i risultati vengono poi interpretati col microscopio ottico.
CBC (Complete Blood Count)
L’emogramma è stato eseguito dal sangue raccolto preferibilmente dalla vena giugulare, o in alternativa dalla cefalica, in una provetta contenente K3-EDTA. L’emocromo è stato eseguito utilizzando l’analizzatore ematologico IDEXX ProCyte Dx®, che impiega tre tecnologie: la citometria a flusso laser (per la conta leucocitaria differenziale), la fluorescenza ottica (per la conta dei reticolociti e delle piastrine) e l'impedenza a flusso laminare (per la conta eritrocitaria). I parametri indagati sono:
o RBC: n° eritrociti (x10^12/L); o WBC: n° Leucociti (x10^9/L); o Hgb: Emoglobina in g/dL; o Hct: Ematocrito %;
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o MCV: Volume corpuscolare Medio in fL; o MCH: Emoglobina corpuscolare Media in pg;
o MCHC: concentrazione emoglobinica corpuscolare media in g/dL; o PLT: n° Priastrine (x10^9/L)
o MPV: Volume Piastrinico Medio in fL; o Pct: priastrinocrito %;
o RDW: Ampiezza di distribuzione eritrocitaria in %; o PDW: ampiezza di distribuzione piastrinica%.
E’ stato anche allestito un vetrino strisciato con sangue prelevato dalla provetta contenente K3-EDTA e colorato con coloratrice automatica con metodo May Grunwald Giemsa, al fine di eseguire la conta e l’analisi morfologica delle tre popolazioni cellulari (eritrociti, leucociti e piastrine) e valutare la stima piastrinica. Per quanto riguarda l’esame morfologico, le alterazioni sono state indicate con una scala di + (da 1+ a 4+) o con un +/- in base alla frequenza di osservazione dell’alterazione ogni 100 WBC o RBC. Nel caso degli eritrociti nucleati (nRBC), sul referto viene indicato il preciso numero di cellule che sono state osservate durante la conta di 100 WBC.
La gravità delle anemie è stata classificata in base all’ematocrito in:
o leggera (Hct: 30-37%) o moderata (Hct: 20-29%) o grave (Hct: 19-13%) o gravissima (Hct: <13%).
In alcuni soggetti con valore di ematocrito inferiore a 30% sono stati inoltre allestiti vetrini strisciati con colorante Nuovo Blu di Metilene per il conteggio reticolocitario parziale (%) e assoluto (x10^9/L), la Correzione della Percentuale dei Reticolociti (CRP) e l’Indice di Produzione Reticolocitaria (RPI). I valori di RPI inferiori a 1 sono stati considerati indicativi di anemia non rigenerava, mentre valori superiori a 2 di anemia rigenerativa.
Per quanto riguarda il comparto leucocitario, sono stati identificati i seguenti leucogrammi:
o infiammatorio acuto: leucocitosi neutrofilica con shift a sinistra e lieve linfopenia,
o Infiammatorio cronico: conta leucocitaria normale o elevata, neutrofili normo-aumentati e monocitosi,
o da induzione corticosteroidea: lieve neutrofilia con shift a destra, lieve monocitosi, linfopenia ed eosinopenia,
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