Analisi retrospettiva sulle caratteristiche cliniche e clinico-patologiche del linfoma canino di pazienti esaminati in due sedi Universitarie (Pisa-Bangkok).

U

NIVERSITÀ DI

P

ISA

DIPARTIMENTO DI SCIENZE

VETERINARIE

C.D.L MAGISTRALE IN

MEDICINA

VETERINARIA

TESI DI

LAUREA A.A. 2016/2017

A

NALISI RETROSPETTIVA SULLE CARATTERISTICHE CLINICHE E

CLINICO-PATOLOGICHE DEL LINFOMA CANINO DI PAZIENTI ESAMINATI

IN DUE SEDI UNIVERSITARIE (PISA-BANGKOK)

Candidato

Sonia Ciampalini

Relatore

Prof. George Lubas

Correlatore

Alla mia famiglia

If you want to run, run a mile. If you want to experience a different life, run a marathon. Emil Zatopek

RIASSUNTO

Background: il linfoma maligno, o linfoma non-Hodgkin (NHL), è la forma tumorale ematopoietica più comune, sia nell’uomo che nel cane. In medicina umana la prevalenza di differenti sottotipi di NHL varia considerevolmente nelle diverse regioni geografiche, mentre, in medicina veterinaria, pochi studi sono stati fatti riguardo la distribuzione dei sottotipi di linfoma di diversi paesi.

Obiettivi: lo scopo è stato di classificare i linfomi canini diagnosticati presso due ospedali didattici veterinari e comparare i risultati per evidenziare eventuali differenze per presentazione clinica dei pazienti e morfologia del linfoma (classificazione citologica e immunofenotipica).

Materiali e metodi: Lo studio è stato condotto su 192 cani visitati presso l’Ospedale Didattico Veterinario “Mario Modenato” dell’Università di Pisa, (gennaio 2010 - maggio 2017), e su 436 cani dell’Ospedale Veterinario Bangkhen dell’Università di Kasetsart, Bangkok, Thailandia (gennaio 2015 - novembre 2017). I dati presi in esame riguardavano: i reperti clinici alla prima visita e la diagnosi citologica del linfoma. Per il gruppo ODVP sono stati valutati anche parametri clinico-patologici e di diagnostica per immagini.

Risultati: le razze risultate significativamente colpite dalla neoplasia sono state: Doberman (P<0.001) e Rottweiler (P=0.007) presso l’ODVP e Golden retriever (P=0.03) presso l’ODVB. Differenze significative fra i due gruppi di studio sono emerse riguardo la taglia del cane, con una prevalenza di cani di piccola taglia nel gruppo ODVB (P<0.001), l’età (la neoplasia è stata diagnosticata in cani più anziani nel gruppo ODVB; P=0.019), la presentazione clinica (P<0.001), la classificazione anatomo-clinica (P<0.001) ed immunofenotipica (P<0.001) per una maggiore incidenza di forme cutanee nel gruppo ODVB. Tutti gli altri confronti non sono risultati significativi e gli ulteriori parametri valutati per il gruppo ODVP sono risultati conformi alla bibliografia.

Conclusioni: Non è possibile dire, sulla base del presente studio, quali siano le cause delle differenze da noi riscontrate riguardo le manifestazioni della patologia nei due gruppi di studio, ma si potrebbe ipotizzare che i diversi stili di vita e le diverse condizioni ambientali possano giocare un ruolo in questo senso. Sarebbe interessante indagare questo aspetto attraverso uno studio epidemiologico che confronti le diverse condizioni di vita e i possibili aspetti eziologici nel determinismo della malattia.

ABSTRACT

Background: the malignant lymphoma, or non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) is the most common hematopoietic neoplasia in human and in dog patientes. In humans, the prevalence of different NHL subtypes varies according to geographical regions, while, in Veterinary Medicine a few studies were done regarding the distributions of lymphoma subtypes in different countries.

Objectives: the aim of this study was to classify canine lymphomas that have been diagnosed in two different veterinary teaching hospitals, to compare the results and find out if statistic differences of patient’s clinical presentations and lymphoma’s morphology (cytological and immunophenotipical classification) are present.

Materials and methods: One hundred and ninety-two dogs, diagnosed in the “Mario Modenato” Veterinary teaching hospital of Pisa between January 2010 and May 2017, and 436 dogs from the “Bangken” Veterinary Teaching Hospital of Kasetsart, Bangkok University between January 2015 and November 2017, were included in this study. The data included: clinical findings collected during the first visit and cytological diagnosis of lymphoma. Clinical pathology and medical imaging findings were collected by the ODVP group.

Results: the breeds significantly overrepresented among lymphoma cases were: Dobermann (P<0.001) and Rottweiler (P=0.007) for ODVP group and Golden retriever (P=0.03) for ODVB group. A significant statistic difference between the two groups has arisen for breed weight due to the high presence of small dogs in ODVB group (P<0.001), age (the disease has been diagnosed in older dogs in ODVB group, P=0.0019), clinical presentation (P<0.001), anatomic-clinical classification (P<0.001) and immunophenotype (P<0.001) because of the greater presence of cutaneous forms in ODVB group. Other comparisons were not statistically significant and the further parameters of ODVP group were conform to bibliography.

Conclusion: according to our study, it was not possible to recognize the cause of the differences that we discovered in the manifestation of lymphoma, but we can assume that different lifestyle and environmental factors could be involved in. It would be interesting to investigate this aspect with an epidemiologic research between the life conditions of and etiological factors to confirm our results.

1

INDICE

PARTE GENERALE

-

3

Introduzione . 4

CAPITOLO 1 6

DEFINIZIONE, INCIDENZA ED EZIOLOGIA ... 6

ANATOMIA DEL TESSUTO LINFOIDE ... 8

CENNI DI FISIOLOGIA DEL SISTEMA LINFOIDE ... 11

CLASSIFICAZIONE DEL LINFOMA ... ..ERRORE.IL SEGNALIBRO NON È DEFINITO.13 Classificazione anatomica ... 15

Classificazioni cito-istologiche ... 17

DIAGNOSI CITOLOGICA……….20

DIAGNOSI ISTOPATOLOGICA………..27

ANAMNESI E SEGNI CLINICI ... 344

PATOLOGIA CLINICA ... 35

DIAGNOSTICA PER IMMAGINI ... 36

PARTE SPERIMENTALE

.

37

Introduzione . 38

CAPITOLO 2 40

Materiali e Metodi POPOLAZIONE DELLO STUDIO ... 41

Criteri di inclusione ... 41 Informazioni raccolte ... 41 Segnalamento ... 42 Esame Clinico ... 42 Classificazione ... 42 RACCOLTA CAMPIONI ... 43

CBC (Complete Blood Count) ... 45

Profilo Biochimico ... 47

Profilo Coagulativo ... 47

Elettroforesi ... 47

Diagnostica per immagini ... 48

Intervalli di riferimento ... 48

2

Classificazione anatomo-clinica ... 48

Classificazione Immunofenotipica ... 49

Classificazione cito-istologica (Kiel, Kiel Updated, WHO) ... 49

ORGANIZZAZIONE DEI DATI ED ANALISI STATISTICHE ... 49

Organizzazione dei dati ... 49

Analisi statistiche ... 50

Capitolo 3

.

51

PARTE SPERIMENTALE DE GRUPPO ODVP ... 70

Capitolo 4

.

77

Discussioni SEGNALAMENTO ... 78

ESAME CLINICO ... 79

CLASSIFICAZIONE ... 79

PARTE SPERIMENTALE GRUPPO ODVP ... 82

Capitolo 5

.

84

Conclusioni

Bibliografia

.

86

3

4

INTRODUZIONE

Il linfoma è una neoplasia maligna derivante dalla proliferazione di linfociti neoplastici in tessuti solidi. Per la sua incidenza e gravità (basti pensare che cani con linfoma non sottoposti a trattamento farmacologico hanno una sopravvivenza mediana di circa 2 mesi)1_,

rappresenta una grande branca di interesse sia in medicina umana che veterinaria. Essi sono circa il 12-18% di tutte le neoplasie canine, con un’incidenza riportata fra 20 e 107 ogni 100,000 cani2_{, e nell’uomo rappresentano circa il 3-5% di tutte le neoplasie,}

classificandosi come la 9° neoplasia più comune negli uomini e la 7° fra le donne3_.

Il cane è stato considerato per molti aspetti un modello di studio per l’eziologia, e spesso anche per la terapia del linfoma umano Non Hodgkin. Le ragioni si possono facilmente individuare non solo sulle analogie a livello morfologico e biologico della patologia, ma anche per gli stessi fattori ambientali condivisi da entrambe le specie.

Al giorno d’oggi, sebbene l’esatta causa risulti ancora sconosciuta, fattori ambientali e predisposizione genetica sono considerate essere determinanti nell’insorgenza della neoplasia.

In medicina umana sono stati molti gli studi che dimostrano l’esistenza di una differenza di distribuzione dei vari sottotipi cellulari nelle varie regioni geografiche, per esempio il linfoma a piccole cellule non clivato B è speso rilevato in Africa ed è stato associato col virus Eptein-Barr, mentre il virus umano linfotropico tipo I è stato correlato ad una prevalenza di linfomi di tipo T in Giappone ed a est della Cina4_{. Questi esempi dimostrano quanto la}

ricerca empirica sulla prevalenza di linfomi di tipo T e B in differenti regioni geografiche abbia contribuito alla scoperta di molte cause del linfoma NHL umano, e anche di molti fattori di rischio e strategie di prevenzione. Comunque, a differenza dell’uomo, molti pochi studi sono stati fatti sulla prevalenza dei sottotipi di linfoma canino.

La prima parte di questa tesi si propone di esaminare i meccanismi eziopatogenetici, le caratteristiche cliniche e gli approcci diagnostici descritti dalla letteratura scientifica veterinaria, facendo cenni talvolta alla letteratura umana come strumento di confronto. La seconda parte, invece, consiste in uno studio retrospettivo e comparativo di due gruppi di cani affetti da linfoma raccolti dagli ospedali veterinari didattici “Mario Modenato” dell’Università di Pisa e “Bangkhen” dell’Università di Kasetsart, Bangkok. Tutti i soggetti sono stati tipizzati dal punto di vista citologico attraverso l’esame del linfonodo e stadiati dal punto di vista clinico.

5

Lo scopo dello studio è stato quello di comparare le caratteristiche generali dei pazienti e gli aspetti morfologici dei vari sottotipi di linfomi per ricercare differenze significative fra i due gruppi di studio e valutarne la corrispondenza con quanto riportato in letteratura veterinaria ed umana.

6

CAPITOLO 1

Definizione, incidenza ed eziologia

Il linfoma

Il linfoma rappresenta il disordine ematologico tumorale più segnalato nel cane ed è definito come una proliferazione maligna di cellule linfoidi, quali linfociti e loro precursori, in sede di organi linforeticolari1_.

Si manifesta come masse solide nei linfonodi o in qualsiasi altro distretto dell'organismo dove è presente tessuto linfoide come milza, midollo osseo e visceri solidi come fegato e siti extranodali come intestino, stomaco, reni, cute, occhio, testicolo, osso, sistema nervoso centrale e periferico. Dal momento che la trasformazione maligna può interessare linfociti a stadi maturativi differenti e sia siti linfonodali che extranodali, il linfoma nel cane è considerato una patologia neoplastica molto eterogenea.

Presenta molte analogie col gruppo dei NHL (non Hodgkin’s Lymphoma) dell’uomo, la prima descrizione in patologia umana risale al 1832, ad opera di sir Thomas Hodgkin e la sintomatologia associata a questa forma è stata denominata malattia di Hodgkin in onore della sua scoperta. A testimonianza della complessità dell’argomento, il riesame dei campioni inizialmente classificati da Hodgkin ha evidenziato come una parte di questi fosse una forma diversa di linfoma, denominata per questo linfomi NHL. In medicina veterinaria, per il raro riscontro di linfomi di tipo Hodgkin, il termine viene scarsamente usato nella pratica5_.

Incidenza

Sebbene il linfoma canino sia spesso considerato una singola malattia, essa comprende un numero di forme neoplastiche distinte sia morfologicamente sia clinicamente.

Il linfoma rappresenta una delle neoplasie più frequenti nel cane, l’incidenza annuale è stata stimata da 13 a 114 casi per 100.000 cani6_{, e negli ultimi 10 anni l’incidenza è}

aumentata con un trend similare a quello osservato nell’uomo: è possibile che fattori di rischio ambientali possano esistere per entrambe le specie3_,78_.

7

I tassi di incidenza in età specifiche sono stimati di 1,5 per 100.000 cani sotto l’anno di età e di 85 per 100.000 cani fra 10-11 anni di età 9_{. Per questo motivo è stato valutato}

che il linfoma colpisce primariamente cani di mezza età, adulti con età media di 6-9 anni

10_.

Un rischio più basso è riportato in cani femmine ma molti articoli mostrano che non c’è una predisposizione di sesso. Esiste d’altro canto una predisposizione di razza come nel Boxer, Beagle, Bullmastiffs, Rottweiler, Basset hounds, San bernardo, Terrier scozzese, Bulldog e Golden retriever, mentre altre razze come il Bassotto e il Pomerania risultano essere a basso rischio8_{. Inoltre, alcune razze sembrano essere predisposte anche allo}

sviluppo di alcuni immunofenotipi, i.e. Boxer e Dog de Bordeaux sviluppano prevalentemente linfomi di tipo T, mentre Pastori tedeschi e Rottweiler tendono a sviluppare linfomi di tipo B. Questa osservazione fa ipotizzare un coinvolgimento di fattori genetici che potrebbero condizionare l'ereditabilità di questa malattia11_.

Eziologia

È considerata una patologia ad eziologia multifattoriale poiché non è stato possibile individuare un solo agente eziologico. L’elevata frequenza in alcune razze suggerisce una predisposizione su base genetica anche se sono inoltre riportati casi di raggruppamenti di linfomi maligni all'interno degli stessi nuclei familiari12 _{e questo fa}

ipotizzare una ereditabilità della patologia, ma è doveroso ricordare che membri della stessa famiglia sono spesso sottoposti alle stesse condizioni ambientali e ai medesimi fattori infettivi e per questo motivo sono state ipotizzate anche cause ambientali come l’utilizzo di erbicidi, esposizioni a benzene, fumo di tabacco, campi magnetici, materiale radioattivo e diossina. Per il breve periodo di latenza fra esposizione a un determinato fattore ambientale e comparsa di malattia, il cane rappresenta una sentinella di situazioni potenzialmente rischiose anche per l’uomo13_.

Così come nell’uomo, anche nel cane appare sempre più evidente l’associazione tra linfoma (soprattutto con immunofenotipo T) e aberrazioni cromosomiche. Ampliando le conoscenze nel campo del genoma canino, sarà possibile delucidare il ruolo patogenetico dei fattori genetici. Poiché nell'uomo sono state osservate anormalità cromosomiche in soggetti affetti da linfoma (tra cui traslocazioni mediante le quali proto-oncogeni verrebbero accoppiati con geni codificanti le immunoglobuline e di conseguenza attivati), anche nel cane è stato ipotizzato un coinvolgimento molecolare nel determinismo della malattia.

Numerosi studi hanno rivelato una potenziale associazione fra autoimmunità e/o sistema immunitario e neoplasia emopoietica nel cane. E' riportato, ad esempio, che cani con trombocitopenia immunomediata presentavano una maggior occorrenza di linfoma rispetto a quelli non colpiti da tale disordine 14_{. Nell'uomo è stato visto che la}

probabilità di manifestare un linfoma aumenta nei soggetti immunodepressi ed anche nel cane è rilevabile una soppressione della risposta immunitaria umorale e

8

cellulo-mediata in corso di linfoma15_{. Tuttavia non è ancora stato accertato se tale}

fenomeno rappresenti una causa o un effetto della malattia stessa; a questo proposito è interessante osservare che il grado di competenza del sistema immunitario umorale e cellulare non sembri variare in razze ad alto rischio rispetto a quelle a basso rischio 16_.

A differenza del gatto, nel cane non esistono prove certe di un'origine retro-virale del linfoma. Tuttavia è stato dimostrato che le cellule linfomatose canine contengono elevate quantità di trascrittasi inversa17 _{poiché sono state trovate particelle con}

proprietà retrovirali in cani affetti da linfoma ed è stata evidenziata un'attività di trascrittasi inversa nel sopranatante di colture cellulari di cani affetti18_{. E' stata inoltre}

riscontrata la presenza di particelle virali con morfologia dei retrovirus di tipo C nelle sezioni ultrasottili della linea cellulare DLC 01, ottenuta a partire da un linfonodo di un cane con sindrome di Sézary1 19_,20_.

Numerosi studi hanno considerato la forte associazione fra l’esposizione di sostanze chimiche utilizzate in agricoltura e NHL ma con inconsistenti risultati dovuti in parte, alla probabilità di altri fattori predisponenti concomitanti. Solo un piccolo numero di studi in passato hanno considerato l’ipotesi dell’esposizione di pesticidi e erbicidi come rischio di linfoma canino 21_{. In particolare, è stata riferita un'associazione tra il rischio di linfoma}

maligno nel cane e l'esposizione agli erbicidi a base di acido 2,4-diclorofenossiacetico. Comunque, i risultati sono stati inconsistenti e l’associazione fra i composti chimici e il linfoma canino maligno (CML) rimane sconosciuta. Invece, un recente studio condotto fra il dicembre 2006 e giugno 2007 alla Facoltà di Medicina Veterinaria di Massachusetts, USA ha stimato la relazione fra l’esposizione a pesticidi e prodotti per la casa con l’insorgenza del CML che si sono presentati alla clinica concludendo che l’uso di alcuni prodotti per la casa possono essere collegati al CML e probabilmente anche con NHL umano 22_.

Al giorno d’oggi è sempre più avvalorata l’idea che studi epidemiologici negli animali da compagnia offrono un’opportunità per studiare gli effetti sulla salute di fattori di rischio ambientali che potrebbero essere di difficile ottenimento in umana. Le neoplasie canine sono state identificate come modelli appropriati per lo studio di tumori in umana e in particolare il linfoma canino che si manifesta con caratteristiche cliniche, patologiche e istologiche simili al NHL in medicina umana 12_.

Anatomia del tessuto linfoide

Il tessuto linfatico è deputato alla difesa dell’organismo tramite una risposta immunitaria acquisita, umorale o cellulo-mediata, contro antigeni che vengono captati da cellule linfoidi le quali rappresentano gli elementi chiave del sistema immunitario. I linfociti originano nel midollo osseo e la loro differenziazione e maturazione può avvenire o nel midollo osseo stesso, o nel timo. I linfociti che rimangono nel midollo osseo ed effettuano qui il loro sviluppo sono detti linfociti B mentre quelli che abbandonano il midollo per svilupparsi nel timo sono detti linfociti T. Dopo il loro

9

sviluppo, i rispettivi linfociti sono detti nativi o non attivati fino a quando non incontrano un antigene specifico in uno degli organi linfoidi periferici: linfonodo, milza e tessuti linfoidi associati alle mucose. Per questo motivo gli organi deputati alla maturazione dei linfociti sono chiamati organi linfoidi primari e quelli deputati alla risposta antigenica sono chiamati organi linfoidi secondari.

L’unità funzionale del tessuto linfatico è rappresentata dal follicolo linfatico presente sia nei linfonodi sia nella polpa bianca della milza. Il linfonodo è una stazione linfatica periferica, inserito lungo il decorso dei vasi linfatici deputato a filtrare la linfa. 5,23,24

Linfonodo

Esso è delimitato da un’esile capsula connettivale ed è strutturalmente suddiviso in corteccia, paracorticale e midollare centrata sull’ilo. Nella corticale sono contenuti i follicoli o noduli linfatici (primari e secondari) che a loro volta sono costituiti da linfociti B, mentre le cellule T, immunoblasti T e cellule dendritiche e macrofagi si distribuiscono nelle aree perifollicolari a formare la paracorticale; infine nella midollare sono presenti vasi sanguigni, cordoni linfatici e seni midollari.

Nel linfonodo che ha subito un processo di stimolazione alcune di queste cellule dentro i follicoli si moltiplicano fino a formare un aggregato chiamato centro germinativo: esso è costituito da una light zone e da una dark zone. La regione scura è esterna ed è costituita da linfociti B, chiamati centroblasti che proliferano e vanno incontro al processo di mutazione somatica e da cui derivano i centrociti, i quali hanno rallentato la proliferazione cellulare ed esprimono immunoglobuline di superficie. Nella regione chiara, interna, avviene la formazione delle immunoglobuline e delle cellule B della memoria.

Negli strisci allestiti da stazioni linfonodali non interessati da fenomeni patologici si osserva una popolazione cellulare polimorfa costituita da linfociti T e B, piccoli linfociti maturi e da altre popolazioni cellulari quali centrociti, centroblasti immunoblasti e rari linfoblasti. Anche le plasmacellule possono essere presenti.

Sotto stimolo dell’antigene, i linfociti B e T attivati migrano dalla paracorticale (dove è avvenuto l’incontro tra linfocita B o T e cellula presentante l’antigene) al follicolo primario dove formano il centro germinativo del follicolo secondario. I linfociti B attivati, ovvero centroblasti si accumulano nella zona scura del centro germinativo per poi migrare sotto forma di centrociti nella zona chiara dove incontrano nuovamente le cellule dendridiche. I centrociti che hanno recettori di superficie appropriati sono reclutati e vanno incontro al processo di blastizzazione, ovvero lasciano il centro germinativo per trasformarsi in immunoblasti e poi plasmacelleule o cellule B della memoria. Le plasmacellule migrano successivamente nel midollo osseo dove sotto stimolo di citochine iniziano la produzione anticorpale.

I linfociti sono piccole cellule rotonde da 7 a 15 micron che contengono un grande nucleo rotondo che si colora intensamente con ematossilina. È circondato da una sottile

10

linea di citoplasma contenente alcuni mitocondri, ribosomi liberi e un piccolo apparato di Golgi. La differenziazione delle sottopopolazioni linfocitarie è stata possibile grazie all’identificazione di molecole sulla superficie cellulare. Ciascuna molecola ha un nome chimico o funzionale designato come cluster of differentation (CD). Il sistema di nomenclatura CD conferisce una serie di numeri sequenziali a ciascuna molecola di membrana.

Attualmente sono stati identificati alcuni sottotipi di cellule linfoidi che possono regolare la produzione di anticorpi e dare luogo alla risposta immunitaria di tipo umorale o possono essere responsabili della risposta immunitaria cellulo-mediata attraverso meccanismi di citotossicità o di ipersensibilità ritardata. Si conoscono, infatti, i linfociti B, precursori delle plasmacellule, le plasmacellule, produttrici di immunoglobuline, i linfociti Tαβ TCR+ CD4+ (Th1 e Th2) con funzione immunoregolatrice, i linfociti T αβ TCR+ CD8+ con funzione citotossica, i linfociti T γδ TCR+ con funzione antibatterica e le cellule Natural Killer con funzione citotossica25_.

Quando gli agenti patogeni invadono i tessuti, le cellule dendridiche residenti sono attivate e migrano al rispettivo linfonodo drenante dove si accumulano nella corteccia e nella paracorteccia. Queste cellule dendridiche formano una rete attraverso la quale gli antigeni sono costretti a passare. Gli antigeni sono così catturati e sono successivamente presentati tramite queste cellule dendridiche a linfociti T-helper che presentano svariate migliaia di recettori antigenici sulla loro membrana. Essi sono inizialmente attivati nella paracorteccia, mentre i linfociti B rimangono sparsi random nei follicoli primari. Entrambe le popolazioni cellulari migrano successivamente verso i margini del follicolo dove interagiscono fra loro. Questo processo determina la stimolazione alla produzione di anticorpi; difatti la progenie dei linfociti B migra attraverso la midollare e inizia a secernere anticorpi. Parte di queste cellule abbandonano il linfonodo tramite i vasi linfatici efferenti e colonizzano linfonodi periferici. Alcuni giorni dopo, dopo che la produzione di anticorpi è stata inizialmente osservata nella midollare, appaiono anche i centri germinativi nella corteccia.

I linfonodi che sono stati stimolati dall’antigene intrappolano i linfociti che tendono così ad accumularsi e il linfonodo aumenta di volume. Dopo 24h i linfonodi rilasciano le cellule intrappolate per i giorni successivi.

Quando la risposta antigenica è di tipo cellulo-mediata piuttosto che anticorpo-mediata, come trapianti di pelle, le aree della paracorteccia che sono ricche di cellule T producono cellule pironinfiliche. La pyronina è un colorante per RNA; perciò cellule con un citoplasma pironinofilico sono ricche di ribosomi. Queste particolari cellule daranno origine ai linfociti T che parteciperanno alla risposta immunitaria cellulo-mediata.5,25

11

Cenni di fisiologia del sistema linfoide

Linfociti T helper e la loro risposta all’antigene

Gli antigeni che vengono inglobati e processati dalle cellule dendridiche sono successivamente presentati ai linfociti T helper negli organi linfoidi secondari. Ciascun T helper presenta migliaia di recettori antigenici di membrana uguali. Questi recettori, è doveroso precisare, che non vengono formati in modo da reagire agli antigeni esterni, ma sono generati in modo random. Contrariamente a quanto si possa pensare, il repertorio recettoriale è così vasto che ciascun antigene estraneo si legherà almeno ad un recettore specifico.

Il recettore di membrana dei linfociti T è denominato T cell receptor (TCR) ed è strutturalmente simile al frammento variabile Fab delle molecole anticorpali. È composto di due catene polipeptidiche altamente variabili, α e β, unite da un ponte disulfidrico al livello delle porzioni costanti. Ciascuna catena del TCR è formata da 4 domini: il dominio N terminale che consente il legame con l’antigene ed è la porzione variabile. Il secondo dominio presenta una sequenza aminoacidica fissa che non varia e per questo denominata dominio costante. Solo una piccola parte della popolazione linfoide T (1-5%) contiene al posto delle catene α e β, le catene γ e δ e si pensa che sia localizzata soprattutto nei tessuti epiteliali. Il complesso polipeptidico α e β forma un solco nel quale peptidi antigenici si legano perfettamente.

Associati a questo complesso polipeptidico si trovano il complesso CD3, costituito da 4 catene polipeptidiche (ε,δ,γ,ε) e un polipeptide intracitoplasmatico ξ. Tutti insieme questi 8 polipeptidi formano il recettore delle cellule T (TCR). I linfociti T esprimono inoltre un co-recettore detto CD4 o CD8 importante per il riconoscimento dell’antigene. Entrambi i recettori appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline ma, i linfociti T CD4+ si legano agli antigeni presentati dal MHC di tipo II localizzato sulla cellula presentatrice di antigene (APC) e appartengono esclusivamente ai linfociti T helper, mentre i linfociti T CD8+ citotossici, riconoscono gli antigeni presentati dal MHC di tipo I.

I linfociti CD4+ possono differenziarsi in una ulteriore sottoclasse: Th1, promotori dell’immunità cellulo mediata o Th2, promotori dell’immunità umorale. Tale differenziazione è determinata dal tipo di antigene e dalle citochine presenti nell’ambiente circostante. Patogeni quali Mycobacterium e Leishmania, una volta fagocitati dalle APC si localizzano all’interno di vescicole intracitoplasmatiche e sono riconosciuti dai T CD4+ che si differenziano in Th1 e danno il via all’immunità cellulo-mediata attraverso l’attivazione dei macrofagi. Altri patogeni quali stafilococchi e streptococchi che si localizzano e crescono nei fluidi extracellulari sono fagocitati dalle APC che li degradano e mostrano i peptidi degradati sulla loro superficie cellulare associandoli a MHC II; i T CD4+ che riconoscono questi antigeni si differenziano in Th2 e promuovono l’attivazione dei linfociti B e la loro produzione anticorpale. Le più

12

importanti citochine coinvolte nel processo di differenziazione dei linfociti T CD4+ sono l’IL-12 e IFN-γ per i Th1 e IL-4 e IL-6 per i Th2.

Gli antigeni presentati da MHC I sono in genere virus o batteri intracellulari che si moltiplicano e sono degradati nel citoplasma delle APC26_.

I linfociti T CD8+ attivati sono detti citotossici in quanto liberano citotossine (perforina e granzima), tossiche per le cellule infette e producono citochine quali interferone γ (IFN-γ), Tumor Necrosis Factor α e β (TNF-α, TNF-β).

Linfociti B e la loro risposta all’antigene 26

I linfociti B sono gli effettori della risposta umorale. Il recettore dei linfociti B è costituito da una immunoglobulina IgM, responsabile del riconoscimento antigenico e da due paia di proteine accessorie Igα e Igβ, necessarie per l’attivazione cellulare. Altre 3 molecole proteiche, CD19, CD21 e CD81 fungono da amplificatori della risposta cellulare allo stimolo antigenico.

I linfociti B nativi, una volta abbandonato il midollo esprimono solo la molecola IgM, e solo dopo aver subito una maturazione nel sistema linfoide periferico possono esprimere anche la molecola IgG sulla loro superficie cellulare. L’attivazione e la differenziazione dei linfociti B in genere richiede l’ausilio dei linfociti T helper, ma può anche avvenire indipendentemente attraverso l’interazione con i prodotti batterici. Se l’antigene è di origine proteica è necessario il contributo dei linfociti T helper: questi antigeni sono detti timo dipendenti e una volta fagocitati dai linfociti B sono degradati e associati a MHC II che a sua volta è riconosciuto dai CD4+ che si attivano esprimendo la molecola CD40 la quale si lega con il recettore CD40 del linfocita B e lo attiva. Se l’antigene è invece un polisaccaride o lipopolisaccaride di origine batterica non necessita l’intervento dei linfociti T helper e per questo è detto antigene timo

indipendente. La risposta anticorpale prodotta da questo meccanismo è però meno

specifica rispetto a quella fornita tramite l’ausilio dei linfociti T helper perché produce un limitato isotipo anticorpale con minor affinità antigenica e non induce la differenziazione delle cellule B della memoria.

Cellule Natural Killer (NK)26

Le cellule Natural Killer sono grandi linfociti contenenti nel loro citoplasma numerosi granuli ben visibili. Queste cellule sono responsabili della risposta immune non specifica precoce o innata che avviene entro breve tempo (ore).

Queste cellule non presentano né i recettori T (CD3) né le immunoglobuline dei recettori B; presentano invece altre molecole quali il CD56 e il CD16 e sono capaci di riconoscere MHC I. Le NK distruggono le cellule bersaglio liberando il contenuto dei loro granuli citoplasmatici (perforina e granzima).

Le NK sono inoltre capaci di uccidere le cellule opsonizzate dagli anticorpi attraverso il legame del CD16 con le IgG situate sulla cellula bersaglio.

13

Quest’ultimo meccanismo è detto: citotossicità cellulo-mediata e anticorpo-dipendente (ADCC). Le NK secernono alcune citochine quali IFN-γ, TNF-α, fattori stimolanti la formazione delle colonie granulocitiche e macrofagiche (GM-CSF), e quindi sono capaci anche di stimolare la differenziazione dei Th1, favorendo la risposta immune specifica.

Classificazione del linfoma

La classificazione del linfoma è un argomento molto controverso e numerosi schemi sono stati proposti negli anni con la necessità di correlare tipo morfologico, manifestazioni cliniche, terapia e prognosi. Ciò è dovuto, in parte alle differenti entità con cui la patologia si può manifestare ma soprattutto, alle maggiori conoscenze in campo biologico che evolvono durante il tempo. Così come in medicina umana, il linfoma canino non è una singola patologia ma è un gruppo eterogeneo di molte condizioni con differenti presentazioni cliniche i quali richiedono approcci terapeutici differenti e quindi prognosi diverse.

Molte di queste classificazioni sono state sviluppate per Non-Hogking Lymphoma NHL) in umana e riadattate anche da patologi veterinari per classificare i casi di linfoma canino.27

Una delle prime e più usate si basa sulla localizzazione anatomica della neoplasia. In questo schema si identificano 5 forme: multicentrica, gastrointestinale, mediastinica, cutanea ed extranodale (occhio, sistema nervoso centrale, ossa, testicolo, vescica, cuore e cavità nasali).28

Le classificazioni cito-istologiche (Kiel, WHO ed altre) invece, si basano sull’architettura e sulla morfologia delle cellule tumorali nel tessuto colpito e si divide in base al grado di malignità (basso, intermedio, alto) e immunofenotipo (B e T). Sfortunatamente il riconoscimento dell’entità della malattia basato su una combinazione di caratteristiche morfologiche e comportamentali non è ancora stato stabilito in oncologia veterinaria 29_.

Ad oggi il sistema di classificazione base dei tumori ematopoietici in umana così come nel cane è quella della WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO), la quale caratterizza le patologie sulla base degli aspetti clinici, morfologia tumorale, immunofenotipo e alterazioni genetiche. E’ composta da circa 30 sottotipi di linfomi canini secondo la maturità delle cellule neoplastiche, ovvero linfomi dei precursori linfoidi, che spesso originano dal tessuto linfoide primario (midollo osseo o timo) e linfomi di cellule mature o periferiche che originano dal tessuto linfoide secondario.

Il grande vantaggio è che questa classificazione permette di predire il comportamento biologico delle cellule neoplastiche e di conseguenza anche la risposta alla terapia e la prognosi negli animali trattati. Altro parametro che viene valutato è l’architettura che le cellule neoplastiche assumono nel linfonodo (diffuso o follicolare).

14

Il campione istologico può solo essere prelevato tramite chirurgia in anestesia generale e questa procedura può essere non accettata in alcuni pazienti che presentano una grave condizione fisica. Come conseguenza solo il 10% dei casi di linfoma può essere classificato tramite istologia; il resto, il 90% viene classificato tramite citologia2_{. Per}

questa condizione, la stragrande maggioranza dei veterinari oncologi intraprende una chemioterapia sulla base dell’esame citologico di campioni prelevati tramite FNA del linfonodo interessato, e immunofenotipo, che comunque rimangono una procedura assolutamente raccomandabile.

Sebbene alcuni sottotipi siano facili da identificare tramite citologia (il linfoma a cellule chiare può essere trattato come il linfoma della zona T, quello a cellule medie macronucleate come il linfoma della zona marginale, il linfoma centroblastico polimorfo come quello B a grandi cellule diffuso), sembra però che non sia ragionevole per un ottimale inquadramento diagnostico e terapeutico perché manca dell’architettura istologica2_.

La classificazione di Kiel updated adottata per i cani è il secondo sistema più comune ed è basato sulla morfologia delle cellule neoplastiche e l’immunofenotipo. Tutti questi criteri possono essere stabiliti all’esame microscopico di campioni cellulari valutando le dimensioni del nucleo, il volume cellulare, la distribuzione e la basofilia del citoplasma, la forma del nucleo, la struttura della cromatina, la presenza e la distribuzione dei nucleoli e l’attività mitotica. L’utilità prognostica di questa classificazione è la forte relazione tra la morfologia e l’immunofenotipo che permette con accuratezza di stabilire il sottotipo al 90%30,31_.

Appare quindi chiaro che la base per la classificazione sia l’identificazione di caratteristiche morfologiche nella citologia e istopatologia, ma negli ultimi anni hanno preso campo anche altre tecniche addizionali quali immunocitochimica, immunoistochimica e l’immunofenotipizzazione tramite citofluorimetria a flusso e PCR per l’identificazione di antigeni di superficie cellulari specifici per determinate linee cellulari.

I test diagnostici da soli non sono perfettamente sensibili o specifici perciò test multipli sono spesso usati in congiunzione o sequenza per aumentare l’accuratezza e assicurare una corretta diagnosi e prognosi.

Di seguito verranno espresse le varie classificazioni e le procedure diagnostiche associate.

15

Classificazione anatomica

24,32,28

Forme primarie nodali

La forma multicentrica è significativamente più comune e rappresenta circa l’80% di tutte le forme.La linfoadenopatia superficiale e indolente, e la epatosplenomagalia sono le manifestazioni cliniche più comuni e sono spesso associate a segni non specifici come perdita di peso, vomito, diarrea, PU/PD, debolezza, ascite, febbre e dispnea. I linfonodi sono massivamente aumentati di volume (da 5 a 15 volte), compatti e indolenti alla palpazione. Nel caso in cui i linfonodi ingrossati ostruiscano meccanicamente un dotto linfatico, può insorgere edema; se comprimono le vie aeree, la tosse può essere una complicazione.

Linfoma gastrointestinale

Questa forma è meno presente, si aggira circa dal 5% al 7% ma, come la forma multicentrica, cani con linfoma intestinale comunemente manifestano segni enterici non specifici come vomito, diarrea, perdita di peso e diminuzione dell’appetito. L’esame fisico rivela spesso masse intraddominali correlate ai linfonodi mesenterici o ileo-cieco-colici e ispessimento delle anse intestinali, specialmente se il linfoma intestinale è diffuso.

Linfoma Mediastinico

E’ caratterizzato da ingrandimento dei linfonodi cranio-mediali e/o del timo e si manifesta circa nel 5% dei casi. Cani con linfoma mediastinico presentano alterazioni respiratorie causate dalle stesse lesioni occupanti spazio, intolleranza all’esercizio fisico ed effusione pleurica.

Linfoma Epato-Splenico32,33

É una forma relativamente rara, si caratterizza per la mancanza di linfoadenopatia generalizzata ma con un coinvolgimento di linfociti maligni nel fegato, milza e midollo osseo, specialmente di origine T. Biologicamente questa forma di linfoma è aggressiva e risponde poco alle terapie.

Linfoma Intravascolare (angiotrophic, angioendotheliomatosis)

È una forma indistinta di linfoma ed è definito come la proliferazione di linfociti neoplastici nel lume e nella parete dei vasi sanguigni in assenza di una massa primaria extravascolare o di una leucemia. È stato riportato molte volte in letteratura veterinaria e in molti casi coinvolge il sistema nervoso centrale e periferico (incluso l’occhio).32

16

Le forme primarie extranodali

Possono insorgere in ogni porzione al di fuori del sistema linfatico includendo gli occhi, il sistema nervoso centrale (CNS), rene, ossa, testicoli, vescica, cuore e cavità nasale.

Linfoma Cutaneo

E’ una delle forme extranodali più comuni nel cane. Può essere primitiva, oppure rappresentare la localizzazione secondaria della forma multicentrica e, non epiteliotropa ed epiteliotropa (canine epitheliotropic T-cell lymphoma, CELT). Quest’ultima è caratterizzata da una infiltrazione di linfociti T neoplastici con tropismo specifico per epidermide, manifestandosi nelle forme di micosi fungoide, sindrome di

Sezary e reticulosi pagetoide. L’eziologia rimane sconosciuta ma da alcuni studi si pensa

che dermatiti atopiche possano predisporre allo sviluppo del linfoma CELT: i linfociti T infatti possono proliferare ed espandersi in senso clonale se stimolati da segnali antigenici persistenti o anormalità funzionali delle cellule di Langherans. Le lesioni cutanee sono rappresentate da noduli, placche, ulcere, eritemi e dermatiti esfoliative, scaglie, alopecia e prurito. Lesioni muco-cutanee e mucosali sono relativamente frequenti. Una lesione caratteristica in cani con questa forma di linfoma sono masse dermo-epiteliali dalla forma circolare e sopraelevata con avvallamento centrale di pelle normale. Una rara forma di linfoma cutaneo è caratterizzata da un coinvolgimento generalizzato della pelle con cellule T maligne circolanti anche nel sangue periferico. Questi linfociti spesso sono grandi 15 fino a 20 micron e hanno dei nuclei ripiegati e clivati. Nell’uomo è chiamata sindrome di Sézary, è anche stata riportata nel cane. Linfomi B cutanei sono spesso diffusi nella pelle e nelle papille dermiche.

Linfoma Sistema Nervoso Centrale (SNC)

Cani con linfoma neurale sono spesso valutati perché i segni neurologici riflettono l’estensione e localizzazione della neoplasia. Spesso è coinvolto il CNS ma sono stati riportati casi anche di coinvolgimento di nervi periferici. Si riconoscono 3 forme cliniche: linfoma epidurale solitario, linfoma neuropilo e linfoma dei nervi periferici. Convulsioni, paralisi e paresi sono le manifestazioni neuropatiche più comuni. Questa forma si manifesta frequentemente in corso di ricaduta del linfoma multicentrico trattato con chemioterapia per mesi o anni. Questi pazienti sviluppano un’insorgenza acuta di segni neurologici tipicamente mentre la forma multicentrica è in remissione. Questa forma di ricaduta tardiva è collegata al fatto che molti farmaci usati per il trattamento non attraversano la barriera ematoencefalica se usati a dosi standard e perciò la forma neurologica si manifesta clinicamente per infiltrazioni di cellule linfoidi neoplastiche nel SNC.

Linfoma oculare

L’infiltrazione di cellule linfoidi causa uveiti, ispessimento dell’iride, glaucoma, […] e ifema.

17

Classificazioni cito-istologiche

La prima classificazione istologica è quella di Rappaport34 _{che suddivide i linfomi in}

cinque tipi in base alle caratteristiche morfologiche delle cellule predominanti (Tabella 1.3.1). Ogni tipo morfologico, in rapporto alla struttura istologica del tessuto neoplastico, può presentare varianti nodulari o follicolari (le cellule sono raggruppate in addensamenti pseudo-follicolari più o meno netti o sfumati, privi della distinta configurazione di un centro germinativo caratteristico dei noduli linfatici) e diffuse (la distribuzione delle cellule è uniforme in ogni punto).

Tabella 1.3.1: Classificazione di Rappaport Tipo Linfoma

1 Indifferenziato

2 Linfoblastico poco differenziato 3 Linfocitico ben differenziato 4 Misto linfocitico-istiocitico 5 Istiocitico

Classificazione Luke-Collins- Kiel

Quasi in contemporanea vennero pubblicate anche la classificazione Luke-Collins27 _nel

nord America e la classificazione Kiel in Europa. Entrambi combinano le caratteristiche morfologiche a quelle immunologiche tramite la scoperta di marker enzimatici specifici per le popolazioni linfocitarie […]. Nel primo caso i linfomi vengono suddivisi a seconda dell’origine dei linfociti in T, B ed U (undefined cells ovvero cellule non associabili ai primi 2 gruppi), istiocitico (cellule che non presentano un’origine linfocitaria), ed inclassificabile.34

La classificazione di Kiel (Tabella 1.3.2) è il metodo senza dubbio più usato e distingue i linfomi in basso e alto grado di malignità. Al primo gruppo appartengono i linfomi linfocitici B e T, le micosi fungoidi, la sindrome di Sèzary, i linfoplasmocitici, il plasmocitico, il centrocitico, il centroblastico-centrocitico (follicolare, follicolare-diffuso, diffuso). Al secondo gruppo appartengono i linfomi centroblastici (puri e misti), i linfoblastici (B, tipo Burkitt, T a cellule convolute, non classificabili), gli immunoblastici (con differenziazione plasmocitica, B) e gli anaplastici che suddivide i linfomi in due importanti gruppi: quello a basso grado di malignità e quello ad elevato grado di malignità35_.

18

Tabella 1.3.2: Classificazione Kiel Grado Linfoma

Basso

Linfocitico (Linf. B o T; micosi fungoide, s. Sèzary) Linfoplasmocitico

Plasmocitico Centrocitico

Centroblastico-Centrocitico (follicolare e/o diffuso)

Alto

Centroblastico (puro o monomorfo; misto o polimorfo) Linfoblastico (B. Burkitt; T a cellule convolute; non classif.) Immunoblastico

Anaplastico

Ogni schema di classificazione utilizzava criteri propri per l'identificazione dei vari tipi di linfomi ed era periodicamente aggiornato man mano che progredivano le conoscenze sulla struttura e funzione del sistema immunitario, risultava però difficoltoso lo scambio di informazioni fra studiosi di paesi diversi. Per questo motivo il National Cancer

Institute degli USA sponsorizzò uno studio di 1400 casi multi instituzionali27_{, durato}

parecchi anni e pubblicato nel 1982, che prevedeva la partecipazione degli autori delle principali classificazioni dei linfomi non Hodgkin assieme ad altri studiosi, con lo scopo di trovare un punto di accordo, almeno sulle forme di linfoma più frequenti. Ne scaturì, una nuova classificazione, la Working Formulation a scopo clinico, che doveva fornire una specie di linguaggio comune a tutti gli studiosi della materia, al fine di favorire il confronto fra i risultati della terapia dei vari tipi di linfoma.

Questa classificazione, come tutte le altre, ha i suoi vantaggi e svantaggi. Il suo limite principale è che essa è basata su criteri esclusivamente morfologici, cioè sull'aspetto che le cellule neoplastiche presentano quando osservate al microscopio, e non prevede l'utilizzo di metodiche d'indagine più moderne ed affidabili, come l'immunoistichimica e la biologia molecolare, che hanno permesso di dimostrare come alcune delle categorie previste dalla Working Formulation siano eccessivamente eterogenee, comprendono cioè tumori molto diversi per origine, caratteristiche biologiche e cliniche, risposta alla terapia, ecc.

Classificazione WHO

L’organizzazione mondiale della sanita (WHO) ha pubblicato, nel 2002, la classificazione

Revised European–American Lymphoma (REAL)28 _{degli animali domestici. Questa}

classificazione è stata adottata da quella umana ed include insieme tutti i tumori ematopoietici sotto la guida di esperti veterinari WHO.

19

Questa classificazione comprende una lista di neoplasie ematopoietiche e il suo scopo principale era quello di correlare ciascuna categoria di linfoma al suo comportamento e al grado di maglignità36_{. Sfortunatamente il riconoscimento dell’entità della neoplasia}

riguardo la morfologia e il comportamento biologico non è sempre stabilito in oncologia veteriaria11_.

La lista contiene circa più di 30 sottotipi di linfomi, alcuni dei quali specifici del cane, e si basa essenzialmente sulla caratterizzazione istologica, presentazione clinica, morfologia del tumore e immunofenotipo. Difatti, i tumori richiedono un esame istopatologico di sezioni tissutali quali preferibilmente linfonodi, immunofenotipizzazione e spesso anche la valutazione della biologia citologica e molecolare.

Questa classificazione divide le neoplasie in base al grado di sviluppo cellulare in: linfomi dei precursori linfoidi (che spesso originano negli organi linfoidi primari) e linfomi di cellule periferiche o mature che spesso originano negli organi linfoidi secondari11_.

Nel corso degli anni ci sono stati molti miglioramenti nelle conoscenze delle neoplasie linfoidi e del loro trattamento. Le nuove scoperte riguardano prevalentemente la biologica molecolare tramite l’identificazione clonare di neoplasie maligne37_{. Questo ha}

permesso che la classificazione WHO umana subisse ulteriori revisioni, nel 2008 e successivamente nel 2016, imponendosi sempre più come migliore monografia di linee guida utilizzate maggiormente per la diagnosi dei linfomi maligni. I vantaggi significativi riguardano la loro implicazione clinica e biologica e gli scopi principali rimangono quelli di aiutare e facilitare l’identificazione delle patologie neoplastiche non comuni.

L’edizione del 2008 (IV in oncologia umana) “Classificazione WHO dei Tumori Ematopoietici e dei Tessuti Linfoidi” è stata pubblicata dall’ International Agency for

Research Cancer (IARC), sotto coordinamento del European Association for Haematopathology and the Society for Hematopathology38_{, ed è stata ultimamente}

aggiornata nel 2016 con una nuova revisione, la V, la quale è comunque considerata come parte della IV poiché ci sono solo limitate variazioni rispetto all’edizione precedente. La monografia rivisitata incorpora comunque un gran numero di informazioni che sono state definite negli ultimi 8 anni in relazione ad alcune importanti implicazioni diagnostiche, prognostiche e terapeutiche.

L’applicazione di tale classificazione in oncologia animale ha trovato molti riscontri, con il vantaggio, anche in questo caso, di predire il comportamento biologico e quindi anche la risposta alla terapia e la prognosi degli animali trattati. La grande vastità di sottotipi di linfomi canini si discosta per qualche aspetto dalla specie umana ma il loro comportamento biologico è virtualmente identico.

Differenze significative riguardano generalmente l’incidenza del linfoma follicolare nei cani che risulta essere minore rispetto all’uomo. Nel cane, l’architettura follicolare è stata riscontrata solo in pochi casi, in contrasto al linfoma follicolare umano che risulta essere circa nel 20% - 25% dei linfomi NHL.28

Sfortunatamente però, l’applicazione in oncologia canina è spesso problematica. L’architettura del linfoma che può essere valutata solo da campioni tissutali prelevati in

20

sede chirurgica sotto anestesia generale è spesso inaccettabile e quindi solo il 10% dei casi di linfomi possono essere completamente valutati con l’istologia31_.

Stadiazione Clinica del Linfoma

La World Health Organization staging scheme è basato sul grado di metastasi, invasività e presenza di segni clinici39_{(Tabella 1.4.3).}

Tabella 1.3.3: classificazione secondo World Health Organization Classificazione World Health Organization

STADIO I Patologia che coinvolge un singolo linfonodo

STADIO II Linfoadenomegalia regionale, ristretta ad una singola area STADIO II Linfoadenomegalia generalizzata

STADIO IV Epato-splenomegalia (con o senza linfoadenomegalia)

STADIO V Coinvolgimento del midollo osseo, Sistema nervosa centrale o di altri siti extranodali -SOTTOTIPO A: Nessun segno clinic

-SOTTOTIPO B: Con segni clinici di malattia

Diagnosi citologica

L’esame citologico di strisci di sangue o campioni ottenuti tramite FNA di tessuti o fluidi è comunemente usato nella diagnosi di linfoma sia nei cani che nei gatti. I vantaggi della citologia sono che il prelievo è semplice e l’osservazione del preparato è veloce e può essere effettuato in loco senza grosse spese, la colorazione avviene con una colorazione

Romanowsky quale Diff Quik® o Wright Giemsa. Recentemente, molti autori hanno

dichiarato che l’uso della citologia è un metodo efficiente per la diagnosi specialmente se supportato da test di immunoistochimica (ICC) o di immunofluorescenza.

I limiti però sono che la FNA non permette l’osservazione e la valutazione dell’architettura tissutale e non fornisce il materiale per altri studi addizionali come IHC. In genere il prelievo avviene da linfonodi superficiali ma può essere eseguito anche su organi interni come fegato milza addome o masse toraciche ma in questo caso viene eseguito come una vera operazione chirurgica.

L’esame citologico è eseguito nelle seguenti condizioni:

o per stabilire la diagnosi definitiva, includendo uno specifico sottotipo, o per scegliere il linfonodo più rappresentativo per la biopsia escissionale e

l’esame istopatologico,

o per stabilire l’estensione della patologia (grado)

o per monitorare il corso e la risposta alla terapia e la remissione, o per determinare target potenziali per la terapia.

21

Criteri citologici generali

La diagnosi citologica di linfoma è basata sulla percentuale di cellule neoplastiche in campioni (spesso cellule clastiche immature arrestate a un certo grado di differenziazione). Lo striscio dell’aspirato linfonodale preparato al momento della diagnosi iniziale o al momento della ricaduta, sono un buono strumento diagnostico. In generale si considerano campi in cui i linfociti si presentano in un monostrato con poche cellule danneggiate.

I criteri per la classificazione morfologica usati per la diagnosi e per la tipizzazione si basano sulle dimensioni cellulari (piccole, medie, grandi quando il nucleo è più piccolo, uguale o più grande del diametro di un eritrocita), la forma del nucleo, la densità e la struttura della cromatina, il numero e la dimensione e la distribuzione dei nucleoli e l’estensione e la basofilia del citoplasma e l’indice mitotico.

Generalmente con più del 50% di cellule blastiche neoplastiche suggeriscono per linfoma, ma in genere la popolazione neoplastica comprende circa più del 70-80% delle cellule 11_.

Dimensioni cellulari: In base alla percentuale di piccole cellule sulla popolazione totale delle cellule neoplastiche, i linfomi si classificano come “a grandi cellule” (< del 50% di piccole cellule), “misto” (50-70% di piccole cellule) e “a piccole cellule” (> 70% delle piccole cellule).

Attività proliferativa: L’attività proliferativa delle cellule neoplastiche è uno dei parametri per determinare il comportamento biologico del tumore, e da questo poi poter predire la presentazione clinica e la prognosi. Risulta utile per classificare il grado di malignità secondo cui un basso indice mitotico e piccole cellule neoplastiche sono rappresentativi di linfomi a basso grado di malignità, mentre casi che mostrano la presenza di medie e grandi cellule con un indice mitotico (IM) da moderato a elevato sono classificati come linfomi ad alto grado di malignità.

La conta delle figure mitotiche negli strisci citologici è una pratica di routine nella lettura degli strisci citologici. È ormai affermato che i linfomi a basso grado di malignità sono caratterizzati da basso indice mitotico mentre quelli ad alto grado sono caratterizzati da un moderato a elevato numero di indice mitotitco.

Si osservano 5 campi a ingrandimento 500x e si contano le figure mitotiche: 0 a 1- basso MI; 2 a 4 – medio MI; e >5 – elevato MI30_.

Nucleo: possono essere rotondi e circolari con nessuna indentazione, oppure presentare una forma irregolare, lievi indentazioni o convoluzioni prevalentemente presenti in una regione più piccola lungo il margine nucleare. Infine, vi sono nuclei di forma irregolare con indentazioni profonde, singole o multiple, fessure o convoluzioni (fig.1).

Nuleoli: sono considerati grandi nucleoli quando hanno le dimensioni superiori di un globulo rosso con bordi angolari (non rotondi).

22

Altri paramenti che vengono considerati durante la valutazione sono la presenza di linfociti binucleati, multinucleati, mitosi atipiche e il numero medio delle figure mitotiche per campo (fig.1)40_.

Figura 1: Morfologia del nucleo (A–E) e mitosi atipiche (F–H) in agoaspirato linfonodale di cani con linfoma multicentrico ad elevato grado di malignità. (A) Nucleo rotondo, (B and C) nuclei irregolarmente rotondi, (D and E) nuclei irregolari, (F) incompleto distacco dei cromosomi, (G) mitosi tripolari (H) asimmetria polare in anafase, colorazione Wright-Giemsa, obiettivo 910040_.

La popolazione cellulare osservata da campioni di linfoma può essere monomorfa in cui le cellule neoplastiche hanno una morfologia simile, o pleomorfa in cui le cellule presentano una morfologia molto variegata e quindi il linfoma origina da più cellule a vario stadio maturativo. Nella maggior parte dei casi però, i linfociti neoplastici sono indistinguibili da quelli normali per morfologia e dimensioni, per cui, la sola osservazione citologica rappresenta un criterio di classificazione che in questi casi può indurre in errore.

Alcune caratteristiche di atipie cellulari possono essere riscontrate e sono indici di linfomi anaplastici, come la presenza di cellule binucleate o multinucleate e contorni nucleari irregolari e sono indici di malignità e sono associati a remissioni brevi e tempo di sopravvivenza diminuito40_.

Alcuni problemi possono essere riscontrati nel differenziare fra linfoma a cellule chiare e linfoma della zona T e l’iperplasia delle cellule T. Comunque, alcuni autori suggeriscono che la presenza di numerose interdigitazioni cellulari e alcune grandi cellule blastiche associate a informazioni cliniche (e.g. dermatiti croniche) sono a favore di una diagnosi di iperplasia di cellule T.

A _B C D

23

Presenza di corpi linfoghiandolari e macrofagi a corpi tingibili.

I Lymphoglandular bodies (LGBs) sono piccolo frammenti rotondi o irregolari di citoplasma di cellule linfoidi sparsi sullo striscio fra linfociti intatti, questi sono basofilici con bordi sfumati e il loro diametro varia da 2 a 7 micron e sono prodotti in risposta a un danno alle cellule linfoidi. Questi sono utili per differenziare il linfoma da altri tumori maligni e sono osservati sia nei linfomi a bassa che ad alta malignità.

È stato osservato che i LGBs sono molto più abbondanti nei linfomi di tipo B rispetto a quelli di tipo T, o nelle leucemie mieloidi.

L’esame istopatologico, e anche quello citologico, di molti linfomi ad alto grado di malignità rivela la presenta di un pattern “starry sky”, questo aspetto è dovuto alla presenza di numerosi macrofagi dai corpi tingibili (TBMs) che sono sparsi fra i linfociti neoplastici. Questi macrofagi contengono cellule apoptotiche neoplastiche o loro frammenti e la presenza di questi TBM è una conseguenza di un aumento nella proliferazione e nel grado di aptoptosi che tipicamente è osservato in molti sottotipi di linfomi ad alto grado di malignità e specialmente di tipo large B-cell lymphoma (specialmente il subtipo centroblastico), Burkitt-type o lymphoblastic lymphoma, ma è invece raramente osservato nel linfoma plasmacitoide B. Questo parametro citologico invece non è mai presente nei linfomi a basso grado e raramente nei T dovuti alla loro attività proliferativa e per questo è un parametro utile per la tipizzazione, fortunatamente i TBMs sono facilmente riscontrati sugli strisci citologici.

Immunofenotipizzazione tramite citologia

Alcune caratteristiche citologiche sono fortemente utili per l’immunofenotipizzazione delle cellule in preparati colorati Giemsa. Infatti, le caratteristiche morfologiche che indicano immunofenotipi T comprendono contorni nucleari irregolari, citoplasmi pallidi e voluminosi con granuli fini azzurrofili e la presenza di plasmacellule sullo sfondo dello striscio. In alcuni casi la presenza di iperplasia delle vene postcapillari che è tipica dei linfomi della zona T, possono essere osservati su preparati citologici. L’attività proliferativa delle cellule neoplastiche misurata con l’indice mitotico varia molto fra i vati tipi di linfomi, comunque è in genere più elevato in linfomi t alto grado.

L’aspetto di linfomi a cellule chiare o dei linfomi della zona T è altamente specifica e la diagnosi può essere basata già all’esame citologico, ma anche se l’esame citologico permette di predire l’immunofenotipo con una certezza del 90% in molti tipi di linfomi, la conferma esclusiva avviene solo con colorazioni immunocitochimiche con minimo 2 anticorpi: anti-CD3 (T lymphocyte marker) e anti-CD79+(B lymphocyte marker)11_.

24

Classificazione Kiel

L’uso della classificazione Kiel nella pratica diagnostica permette di classificare il linfoma in 2 grandi categorie: low-grade e high-grade. In tutta la ricerca nella quale la classificazione di Kiel è stata attuata, la percentuale di linfomi ad alto grado domina (71,05%-80,76%)31 _{rispetto a quelli a basso grado. La spiegazione più plausibile è che}

l’analisi citopatologica è prevalentemente consigliata in casi in cui i segni clinici di tumori maligni è evidente (Tabella 1.3.4).

L’analisi istopatologia dei linfonodi o di altri organi affetti facilita comunque la diagnosi, specialmente in casi dubbi di linfomi a basso grado.

Tabella 1.3.4: classificazione secondo Kiel, criteri cellulari31

Grado Morfologia cellulare Basso grado

Linfocitico (B, T, Micosi Fungoide, Sindrome Sezary) Piccole cellule con nucleo rotondo, cromatina addensata a zolle e scarso citoplasma

Linfoplasmocitico

Piccole cellule con nucleo rotondo, eccentrico e citoplasma basofilo esteso. Differenziazione plasmacellulare

Centrocitico Cellule con nucleo clivato e cromatina a zolle Centroblastico centrocitico (follicolare e/o diffuso) Cellule di dimensioni variabili centroblasti e

centrociti Cellule Medie-Macronucleolate (MMC)

Cellule medio-piccole con cromatina decondensata e un voluminoso nucleolo centrale. Citoplasma poco esteso

Alto grado

Centroblastico (monomorfo, polimorfo) Grandi cellule con nucleo rotondo, cromatina fine e numerosi nucleoli iuxtanucleari (mono). Il polimorfo si caratterizza per la presenza di cellule MMC, piccoli blasti, centroblasti e immunoblasti Linfoblastico (B, Burkitt; T, cellule convolute;

inclassificabile)

Cellule di medie dimensioni, nucleo rotondo o clivato con cromatina a zolle e scarso citoplasma basofilo

Pleomorfo Cellule di varie dimensioni con nuclei irregolari e abbondante citoplasma

Immunoblastico Cellule prevalentemente di grandi dimensioni, nucleo irregolare con uno o più nucleoli voluminosi e citoplasma pallido esteso

A piccole cellule non specificate Cellule di piccole-medie dimensioni con nucleo irregolare, cromatina a zolle e nucleoli

Anaplastico Cellule di grandi dimensioni, nucleo irregolare, citoplasma esteso e intensamente basofilo

25

Tabella 1.3.5: Classificazione Kiel Modificata, 1991 Linfomi Basso Grado Linfomi Alto Grado Linfocitico B Centroblastico Monomorfo B

Linfoplasmacitico B Centroblastico Polimorfo B

Prolinfocitico B e T A predominanza piccole cellule

Centrocitico B A predominanza grandi cellule

Centroblastico-Centrocitico B Immunoblastico B e T Macronucleato a cellule medie

B

Tipo Burkitt B Piccole cellule chiare T Plasmocitoide B e T Pleomorfo a piccolo cellule T Linfoblastico B e T

Micosi Fungoide (T) Pleomorfo misto, e grandi cellule T Anaplastico

Blastico a piccolo cellule – non classificabile

Linfocitico. Al livello citologico si rileva la presenza di cellule omogenee, composte da

piccoli linfociti molto simili a quelli normali. Essi infatti, sono caratterizzati da un nucleo rotondo, cromatina addensata e a zolle, nucleoli invisibili. Il citoplasma è poco esteso, pallido o leggermente basofilo. Le mitosi sono eccezionali e questo ne spiega la crescita lenta.

Linfoplasmocitico. Detto anche immunocitoma, questo tipo di linfoma si caratterizza per

una percentuale variabile di cellule con differenziazione plasmocitaria. Esse presentano un nucleo eccentrico, citoplasma basofilo esteso con un’area chiara iuxta-nucleare (zona dell'apparato di Golgi). L'assenza di mitosi, di macrofagi fagocitanti, nonché di centroblasti ed immunoblasti ne sottolineano il carattere linfomatoso e ne permettono la differenziazione nei confronti di una iperplasia plasmocitaria.

Prolinfocitico. Può avere sia fenotipo T che B. Sono caratterizzati da una predominanza

di cellule di taglia piccola che hanno nuclei con cromatina densa e nettamente nucleolata, citoplasma a corona stretta. Sono linfomi a crescita lenta.

Centrocitico Questo tipo di linfoma è assai raro. Si identifica con la presenza di una

popolazione cellulare, di numero variabile, caratterizzata da un nucleo più grande rispetto a quello dei linfociti normali e inoltre presenta una incisura più o meno profonda. La cromatina a zolle, ma un po' meno addensata rispetto ai linfociti normali.

Centroblastico-Centrocitico. Linfoma assai raro nel cane, caratterizzato dalla presenza di

cellule piccole e medie. Quelle più piccole presentano le caratteristiche dei centrociti (da ricercare le incisure nucleari, talvolta poco evidenti), mentre le cellule medie sono rappresentate da centroblasti con cromatina fine, numerosi nucleoli addossati alla membrana nucleare, nucleo talvolta irregolare e citoplasma basofilo.

26

A cellule medie macronucleolato. Questo tipo è caratterizzato da una grande

omogeneità di cellule tumorali di taglia variabile piccola-media (1.5 volte il volume di una emazia). Il nucleo di tali cellule presenta cromatina decondensata ed un voluminoso nucleolo centrale il cui contorno è sottolineato da un rinforzamento della cromatina. Il citoplasma è poco esteso, moderatamente basofilo (senza area chiara iuxtanucleare).

Centroblastico monomorfo. Questo tipo di linfoma è poco frequente ed è caratterizzato

da una popolazione omogenea di cellule grandi (taglia superiore al volume di due emazie). Le cellule linfomatose presentano un nucleo rotondo, cromatina fine e numerosi nucleoli in posizione iuxta-nucleare, un citoplasma moderatamente basofilo. Grado di malignità elevato.

Centroblastico polimorfo. La maggior parte dei linfomi del cane, appartiene a questo

gruppo che, come indica il nome, è costituito da più tipi cellulari. Sul preparato linfonodale infatti si possono ritrovare cellule di taglia media, rappresentate dai centroblasti (in percentuale elevata), piccole cellule blastiche con nucleo rotondo, cromatina decondensata e irregolarmente rinforzata, nucleoli multipli e prominenti, citoplasma stretto e iperbasofilo (anch'esse presenti in percentuale assai elevata); cellule di taglia grande di tipo immunoblastico (mai superiori al 20%) e cellule medie macronucleolate della zona marginale (presenti in percentuale minore). Sono frequenti i macrofagi fagocitanti che, per la loro particolare distribuzione in mezzo alle cellule linfomatose, assumono il cosiddetto aspetto a cielo stellato. L'indice mitotico è variabile. Questo tipo di linfoma proprio per il suo carattere eterogeneo, può essere ulteriormente diviso in due sottogruppi: uno in cui predominano le piccole cellule (PSC ovvero predominantly small cell), l'altro in cui predominano le cellule più grandi (PLC che significa predominantly large cell).

Immunoblastico. Linfoma poco frequente e talvolta difficile da distinguere dal

precedente.

Caratterizzato da una elevata percentuale di cellule di tipo immunoblastico (maggiori dell'80%) che presentano una taglia molto grande, nucleo irregolare e citoplasma abbondante. L'indice mitotico è alto. Può avere fenotipo sia B che T.

Tipo Burkitt. Questo tipo di linfoma è caratterizzato da una proliferazione omogenea di

cellule di taglia piccola, con nucleo rotondo, cromatina irregolarmente rinforzata, nucleoli multipli o singoli prominenti, citoplasma ridotto e iperbasofilo. L'indice mitotico è elevato.

Plasmocitoide. Può presentare entrambi i fenotipi, sia B che T. Caratterizzato da cellule

di taglia piccola che assumono una differenziazione plasmocitaria grazie al loro citoplasma esteso ed iperbasofilo. L'indice mitotico è elevato.