Materiali e metod
2.2.9 Raccolta delle frazioni salivari e purificazione da sal
Sono state raccolte le frazioni HPLC di saliva non marcata in 80 eppendorf ogni minuto, tramite l’utilizzo di un raccoglitore. Ogni frazione raccolta era di un volume pari a 500 µL. Sono state recuperate le frazioni di interesse (dalla 14 a 23) e, per eliminare i sali presenti a livello del campione raccolto, sono state fatte passare attraverso dei filtri da 3000 Da (3K)( Figura12). In questo modo avviene la purificazione delle proteine, che avendo un PM maggiore non passano attraverso il filtro e quindi vi rimangono all’interno, mentre i sali, che hanno un PM inferiore, attraversano i pori separandosi così da esse. Come prima cosa i filtri sono stati inseriti nelle apposite eppendorf, lavati con 100 µL di acqua Milli-Q ciascuno e sono stati centrifugati a 14000g per i minuti necessari. Una volta eliminata l’acqua dalle eppendorf di raccolta sono state filtrate le frazioni di interesse (500 µL ciascuna) e tramite centrifugazione per 30 minuti a 14000g. Successivamente, per poter raccogliere il concentrato, i filtri sono stati capovolti nelle eppendorf e centrifugati dinuovo per 2 minuti a 1000g; per ciascuna frazione è stato ricavato un concentrato di 48 µL che è stato poi studiato al SELDI.
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Capitolo 3
Risultati e discussioni
3.1SELDI-TOF-MS
Il rilevamento dei picchi tramite il software di elaborazione dati ProteinChip ha evidenziato un totale di 116 picchi sul CM10 con rapporto m /z tra 2000 e 1000-000. Ogni spettro è stato così descritto con 116 variabili, dove ogni variabile corrisponde all’intensità di un picco per un dato rapporto m/z. Abbiamo quindi selezionato i principali picchi discriminanti per il nostro confronto. La tab 2 illustra i picchi principali discriminanti, ottenuti tramite regressione logistica; si riportano le previsioni di tale analisi statistica con il tasso di errore, ovvero la percentuale % dei campioni che vengono erroneamente classificati dal modello.
Tabella 2: Analisi multivariata SELDI
L’identificazione di questi picchi è avvenuta eseguendo una separazione delle proteine con off-gel. Questa tecnica consente di separare le proteine, presenti nel campione, in base al loro punto isoelettrico (pI) e di raccoglierle in frazioni liquide. Queste frazioni sono state poi nuovamente analizzate al SELDI-TOF-MS al fine di individuare le frazioni in cui venivano ritrovati i nostri picchi di interesse.
FM vs H m/z V19 4423 V21 4548 V54 7354 V83 13288 Tasso di errore % 12.3%
48 Dunque elaborando i nostri campioni di saliva, il frazionamento OFFGEL ha permesso di focalizzare la nostra attenzione su 2 picchi: V21 (m/z 4548) ritrovato nella frazione con pI di 4.9, e V83 (m/z 13288) ritrovato nella frazione con pI di 6.1.(figura13)
Figura 13: Immagini ingrandite dei picchi ritrovati nelle frazioni off-gel. A) picco v83 con m/z 13288
della frazione cpn pI 6.1. B) picco v21 con m/z 4548 della frazione con pI 4.9
12500 13000 13500 14000 14500 0 25 50 75 uA 1322 1250012500 1300013000 1350013500 1400014000 1450014500 0 5 10 15 uA F10 v83 12500 13000 13500 14000 14500 V83 (m/z 13288) Saliva totale Frazione off-gel con pI 6.1 A 4500 4550 4600 4650 0 20 40 60 80 uA F5 v21 4500 4550 4600 4650 4500 4550 4600 4650 0 20 40 60 80 uA F5 v21 4500 4550 4600 4650 4500 4550 4600 4650 0 20 40 60 80 uA F5 v21 4500 4550 4600 4650 4500 4550 4600 4650 0 50 100 150 uA 1551 4500 4550 4600 4650 4500 4550 4600 4650 0 50 100 150 uA 1551 4500 4550 4600 4650 V21 (m/z 4548) Saliva totale Frazione off-gel con pI 4.9 B
49 3.2 HPLC-SEC
Per identificare a quali proteine, differenzialmente espresse tra sano e patologico, corrispondano tali picchi, siamo andati ad effettuare la separazione delle proteine salivari in base al PM. Queste proteine sono separate solo in base al pI, inoltre ne conosciamo il rapporto m/z, quindi l’obiettivo è quello di ottenere frazioni contenenti le proteine a diverso PM e isolare la frazione che presenta, almeno in misura prevalente e separate da quelle a peso molecolare più alto, le due proteine di interesse. Tali frazioni saranno poi inviate all’analisi di massa per permetterne l’identificazione.
La marcatura con fluoresceina isotiocianato ha permesso di evidenziare, tramite cromatografia ad esclusione molecolare con rivelatore a fluorescenza, i tempi di uscita delle proteine salivari.
La cromatografia ad esclusione molecolare rappresenta un metodo efficace di separazione delle proteine salivari in base al loro peso molecolare. Questo tipo di cromatografia presenta inoltre il vantaggio di recuperare il campione alla fine dell’analisi, anche se più diluito, e di svolgere quindi le ulteriori analisi di caratterizzazione proteica che ci interessano.
Una parte delle frazioni salivari contenenti i picchi di interesse è stata marcata con FITC per essere analizzata in cromatografia liquida, un’altra parte invece ha subito gli stessi passaggi ma non è stata marcata, e costituisce la parte che sarà inviata alla spettrometria di massa.
Come si vede dal cromatogramma riportato in figura 14, le proteine salivari marcate con FITC escono con un picco ampio nell’intervallo di tempo compreso tra 14 e 24 minuti, mentre è presente un picco basso a circa 64 minuti probabilmente dovuto alla FITC non reagita.
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Figura 14: Cromatogramma della frazione salivare marcata con FITC
In uno studio precedente è stata messa a punto una curva di calibrazione che ha utilizzato proteine a PM noto e messo in relazione il log PM con il tempo di ritenzione. Compatibilmente con tale curva di calibrazione, possiamo supporre che la proteina con rapporto m/z 13288 esca al minuto 17, mentre quella con m/z 4548 esca a 22 minuti circa.
Il cromatogramma della frazione salivare marcata ci è servito per definire i tempi di uscita delle proteine e quindi la raccolta delle frazioni, iniettando la frazione non marcata che presenta un cromatogramma piatto.
Dopo iniezione della frazione non marcata, abbiamo proceduto con la raccolta delle frazioni in uscita dall’HPLC, indirizzando la nostra attenzione nell’intervallo di tempo compreso tra 14 e 24 minuti, raccogliendo ogni minuto l’eluato (figura15).
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Figura 15: Zoom del cromatogramma che rappresenta le frazioni raccolte da HPLC
Per l’analisi in spettrometria di massa, la presenza di sali nei campioni dovuta alla fase mobile dell’HPLC può risultare un problema. Sono presenti infatti concentrazioni abbastanza elevate di PBS e NaCl, che potrebbero interferire con l’analisi. Abbiamo provveduto dunque alla desalificazione dei campioni mediante filtri con cut-off 3000 Da ed abbiamo inviato i campioni da identificare alla spettrometria di massa.
L’identificazione di tali proteine, differenzialmente espresse tra pazienti fibromialgici e pazienti sani, potrebbe costituire un fondamentale aiuto nella diagnosi di una patologia complessa quale la fibromialgia. Tale patologia, come abbiamo già riferito, è di difficile diagnosi, la quale è essenzialmente di tipo clinico, ed inoltre non presenta biomarkers specifici da utilizzare in test di laboratorio.
L’individuazione di potenziali biomarcatori della patologia è anche di notevole importanza per una terapia farmacologica mirata, che non curi solo i sintomi e che superi l’utilizzo quasi esclusivo di antidepressivi e analgesici, e per fornire una indicazione dell’efficacia della terapia. Questi potenziali biomarcatori a basso peso molecolare si aggiungerebbero a quelli già individuati precedentemente e potrebbero costituire con questi un pannello di biomarcatori utile anche nel distinguere i pazienti con prevalente patologia psichiatrica.
52 L’eventuale riconoscimento di tali proteine salivari consentirebbe inoltre di utilizzare, per lo screening diagnostico e terapeutico, un materiale biologico semplice da prelevare e con maggiore compliance per il paziente rispetto al più comune prelievo ematico, vantaggio importante per questa patologia che spesso sconfina in disturbi della sfera psichiatrica.
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