Raccolta saliva

I campioni di saliva sono stati raccolti mediante l’utilizzo di Salivette (Surescreen Diagnostics LTD; Derby, UK); dispositivo che contiene al suo interno una provetta in polipropilene forata in cui è inserito un tampone cilindrico in grado di assorbire la saliva. La raccolta dei campioni è avvenuta la mattina presto e a tutti i soggetti è stato chiesto di non assumere cibo (comprese gomme o caramelle) e bevande dalla sera prima fino al campionamento. I campioni di saliva sono stati campionati secondo un protocollo standardizzato tra le 8 e le 11 del mattino. Per evitare e minimizzare la degradazione proteica, i campioni sono stati trattati immediatamente e mantenuti in ghiaccio durante il processo. Non sono state evidenziate patologie del cavo orale o processi infiammatori in corso, che potrebbero alterare l’analisi.

La saliva è stata subito centrifugata a 4°C per 20 minuti a 17000g per eliminare le mucine e il particolato eventualmente presente. E' stato realizzato un pool di saliva e il contenuto proteico, presente nel sovranatante, è stato determinato con il dosaggio proteico (DC/BioRad), utilizzando come standard l'albumina da siero bovino (BSA). Il campione di saliva è stato conservato a -80°C fino all'analisi.

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2.2.3 SELDI-TOF-MS

Per l’analisi al SELDI-TOF-MS abbiamo utilizzato come ProteinChip Arrays il CM10, matrice che cattura le proteine con carica di superficie positiva. La soluzione di binding buffer per CM10 è stata preparata con CH3COONa 100mM a pH 4, mentre il tampone

per lavaggi è stato preparato con HEPES 5 mM pH 7. Inoltre alle aliquote di saliva (20µg) è stata aggiunta (2:3 v/v) una soluzione tampone denaturante, composta da urea 9 M e 2% di CHAPS, e il tutto è stato lasciato in incubazione per 30 min prima di caricare il campione sui chip. Questi chip sono stati preparati secondo protocollo istituito da Bio-Rad. Per prima cosa i chip sono stati lavati due volte con uno specifico

binding buffer (sodio acetato100 mM pH 4 per CM10), poi vi è stato caricato il

campione e sono stati lasciati in incubazione per 1h , sotto agitazione. Passato il tempo debito i chip sono stati poi lavati due volte con 150 µl di tampone HEPES 5 mM a pH 7, centrifugando e agitando ad ogni lavaggio, e sono stati fatti essiccare all’aria per 5 minuti. Infine, per facilitare desorbimento e ionizzazione, in ogni spot è stato caricato per due volte 1 µl di soluzione satura al 50% di SPA 50%, ACN e TFA 1%.

I chip sono stati poi letti tramite lettore ProteinChip SELDI usando un protocollo automatico (energia laser di 3500 nJ, attenuazione matrice 1000; massa 10 kDa e acquisizione di range di massa da 0 a 100 kDa) e l’analisi dello spettro è stata effettuata tramite un software di elaborazione dati 3.5 per ProteinChip. Gli spettri sono stati esaminati visivamente e spettri di scarsa qualità sono stati esclusi da ulteriori analisi. Prima dell’analisi è necessario un processo di pre-elaborazione dati, che consiste in calibrazione, sottrazione della linea di base, normalizzazione e rilevazione del picco. La calibrazione, effettuata secondo le istruzioni del produttore, è necessaria per l’accuratezza di massa. Il software è stato calibrato esternamente utilizzando All-in-One

Proteine standard e All-in-one Peptide standard. La sottrazione della linea di base è

stata ottenuta utilizzando un algoritmo che elimina ogni segnale di base causato da distorsioni della matrice. Le intensità dei picchi tra i campioni in questo gruppo di studi sono state normalizzate alla corrente ionica totale (TIC), per evitare l'interferenza del segnale da SPA. L’Auto-rilevazione dei picchi è stata eseguita tramite expression

difference mapping (EDM) alle seguenti condizioni: rapporto segnale / rumore di 3 o

superiore per il primo passaggio e 2 per il secondo passaggio, presentazione in almeno il 10% degli spettri per l’identificazione, finestra di massa 0,1% e range di massa tra

41 2,000-100,000 Da. I picchi aventi un rapporto m / z <2 KDa non sono stati utilizzati per l'analisi, poiché sovrapponibili con il segnale SPA.

Analisi statistiche

I dati di SELDI-TOF-MS sono stati analizzati tramite analisi univariata (Mann- Whitney), e successiva analisi multivariata (regressione logistica). L'analisi univariata ha permesso di determinare le differenze significative possibili tra l'intensità dei picchi nello spettro del gruppo sperimentale rispetto ai controlli. Sono stati calcolati i valori-p associati a ogni picco utilizzando il test di Mann-Whitney (significativo quando <0,05). Successivamente, abbiamo usato l'analisi multivariata per estrarre i picchi potenzialmente rilevanti tra quelli riscontrati dall'analisi uni variata.

2.2.4 OFFGEL.

Per l’isoelettrofocalizzazione (IEF), che permette di separare le proteine in base al loro punto isoelettrico, abbiamo utilizzato un kit OFFGEL ad elevata risoluzione con gradiente di pH tra 3-10. I campioni di proteine salivari (800 µl ) sono stati solubilizzati in un tampone di frazionamento Protein OFFGEL, fornito dal produttore, contenente urea, tiourea, DTT, glicerolo e tampone con anfoliti. Le aliquote sono state poi distribuite uniformemente in 24 pozzetti 3100 di OFFGEL Fractionator, secondo le istruzioni dettate dal fornitore. Quindi abbiamo applicato un programma preimpostato (limiti di separazione: 8000 V, 200 mW, e 50 μA; tensione di partenza, 200-350 V; tensione di termine, 2000-4200 V; dopo l'applicazione di 64 KVH, le zone di separazione di proteine sono state mantenute in costante voltaggio). Al temine, sono state recuperate le frazioni liquide ed è stato poi misurato il pH di ciascun pozzetto. Le 24 frazioni off-gel ottenute sono state analizzate al SELDI-TOF, per indagare la presenza di picchi di interesse. Aliquote di frazioni off-gel (corrispondente a 20μl) sono state analizzate mediante SELDI-TOF / MS. Il Campione è stato caricato su spot di CM10 Protein Chip Array.

42 2.2.5 Purificazione da urea

Per poter eliminare le interferenze provocate dall’urea, i campioni, ottenuti dalla separazione OFF GEL, sono stati purificati tramite passaggio in colonnina

(Figura10). E’ stata preparata la soluzione di CH3COONH4 50 mM a pH 7, tramite la

quale sono stati effettuati 5 lavaggi da 5 ml ciascuno, necessari per lavare la colonnina conservata in una soluzione di NaN3 0,02%. Successivamente sono state preparate le

eppendorf di raccolta. Quindi, una volta pulita la colonnina, vi sono stati caricati 70 µL del campione e 5 ml per volta di soluzione di CH3COONH4 fino a 15 ml per l’eluizione.

Abbiamo raccolto frazioni di 1 ml circa, a partire dal caricamento del campione, in eppendorf numerate. Al termine della separazione la colonnina è stata rilavata con 25 ml della soluzione di CH3COONH4 e quindi protetta con una nuova soluzione di NaN3

0,02%. Tra le eppendorf di raccolta sono stati prelevati, 20 µl da ciascuna frazione di interesse (2-3-4-5-6), dove è presumibile che inizi ad uscire la proteina di interesse, e conservati a – 80°C . Tutte le frazioni ricavate sono state portate a secco in centrifuga sottovuoto alla temperatura di circa – 60°C. Una volta terminato il processo sono state conservate in frigorifero a – 80°C.

43 2.2.6 Marcatura con FITC

La marcatura con FITC è stata effettuata per determinare i tempi di ritenzione da utilizzare poi nell’analisi del campione non marcato. Abbiamo seguito il protocollo di marcatura con FITC Sigma, il quale prevede la marcatura di 1 ml di campione di saliva, con concentrazione circa 2 mg/ml, preparato in tampone carbonato 0,1 M a pH 9 e la preparazione della FITC 1 mg/ml in etanolo. Quindi il campione è stato prima solubilizzato per 30 min in tampone carbonato, poi ad esso sono stati aggiunti 50 μl di FITC goccia a goccia, vortexando il campione dopo ogni aggiunta. Il campione si lasciava sotto agitazione al buio per 24 h a temperatura ambiente. Una volta trascorso il tempo stabilito, per interrompere la reazione con FITC sono stati aggiunti 0,48 μl di NH3 lasciando sotto agitazione, al buio, per due ore. Terminate le due ore, il campione

così marcato è stato analizzato tramite HPLC. 2.2.7 Studio cromatografico (HPLC)

L'analisi cromatografica dei campioni di saliva è stata eseguita utilizzando una colonna Zenix SEC-100. In uno studio precedente sono state fatte prove che hanno previsto l’iniezione di un campione di saliva marcato con FITC proveniente da soggetti sani, questo ha permesso di standardizzare il processo e di ottimizzare il metodo. A fronte di ciò l’analisi è stata eseguita a una composizione di fase mobile costituita dal 97% di A e dal 3% di B con un flusso di 0,5 ml/min.

I solventi sono sempre stati degassati accuratamente prima della misura. Il volume d'iniezione era pari a 10 μL. La temperatura della colonna cromatografica è stata termostatata a 25°C.

La rivelazione è stata eseguita utilizzando una λ di eccitazione pari a 496 nm e misurando l'intensità emessa a 518 nm.

Per la preparazione della fase mobile sono state usate le seguenti concentrazioni di tampone fosfato (PBS), utilizzato come eluente A:

PBS 150mM + NaCl 200mM +NaN3 0,02% pH 7

L'eluente B della fase mobile è il modificatore organico acetonitrile (ACN).

44 di NaH2PO4, NaCl e, per consentire una migliore conservazione ed evitare la

proliferazione, è stata aggiunta anche sodio azide (NaN3); le quantità sono state

aggiunte in base alla concentrazione scelta. La soluzione è stata quindi portata a pH 7 con NaOH 10 M, successivamente è stata filtrata tramite filtrazione sottovuoto (Figura11) e, dopo averne ricontrollato il pH, è stata conservata in frigorifero a 4 °C in un contenitore di vetro.

Dopo aver fatto l’avvinamento delle linee, abbiamo impostato il lavoro utilizzando una composizione di fase mobile costituita dal 97% di A e dal 3% di B con un flusso di 0,5 ml/min.

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