Resveratrolo (Res)

Res è un noto e potente attivatore naturale di SIRT1.

Figura 29. Nell’uva si possono ritrovare piccoli quantitativi di polifenoli, resveratrolo incluso.

E' un polifenolo prodotto nell'uva rossa e nei suoi derivati, che può incrementare la sopravvivenza cellulare, prolungare la durata di vita e ridurre il rischio di patologie cardiovascolari. Svolge un ruolo centrale nell'infiammazione e nella soppressione tumorale [Pervaiz S, 2003] ed è inoltre dotato di un'azione scavenger nei confronti dei ROS [Fang et al., 2002; Olas et al., 2001; Stojanovic et al., 2001; Murcia et al.,2001; Burkitt et al., 2000; Fremont et al., 1999; Ray et al., 1999] (Figura 29).

Figura 30. Effetti benecfici di Res su alcune delle più diffuse disfunzioni fisiologiche.

Nel lievito, il Res si è dimostrato in grado di mimare l'effetto di Sir2 sull'aumento della durata della vita durante CR, tuttavia gli effetti di CR e del Res non sono additivi [Howitz et al.,2003]. In topi sottoposti ad una dieta ipercalorica, la stimolazione di SIRT1 da parte di Res è in grado di prolungare la durata della vita [Baur et al., 2006]. Un ulteriore studio sull'aging nel lievito ha suggerito che Sir2

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agisse indipendentemente dai meccanismi coinvolti da CR [Kaeberlein et al., 2004].

Res è capace di attivare SIRT1 ma non gli altri omologhi di Sir2; gli effetti su SIRT1 sono stati dimostrati nel lievito, nei vermi e in alcuni pesci [Howitz et al., 2003; Bass et al., 2007; Valenzano et al., 2006]. L'aumentata attività di SIRT1 da parte del Res è stata inoltre riconosciuta nei mammiferi.

Chen e colleghi riconobbero che cellule esposte a Res vedevano una rapida attivazione di SIRT1, d’altra parte questo effetto poteva essere invertito tramite una inibizione di questo enzima [Chen et al., 2009]. Analogamente, Raval ed il suo gruppo dimostrarono che i tessuti ottenuti da ratti trattati con Res mostravano un incremento dell'attività di SIRT1 di circa l'85% comparati con il gruppo rappresentante il veicolo [Raval et al., 2005]. Tutti i risultati hanno dimostrato che Res era in grado di attivare SIRT1, con un meccanismo ad oggi non del tutto chiaro. È emerso da saggi in vitro che l’attivazione di SIRT1 indotta dal Res è substrato-dipendente: Res sembra infatti in grado di incrementare l'attività di SIRT1 aumentando l'affinità per il suo substrato: NAD+_{. Per valutare come Res sia} in grado di promuovere l’attivazione di SIRT1 sono stati svolti numerosi studi in vitro da Borra e il suo gruppo di ricerca, i quali sintetizzarono differenti substrati peptidici acetilati, alcuni dei quali contenenti un fluoroforo e altri che invece non lo presentavano. Per determinare se l’attivazione da parte di Res richiedesse il fluoroforo, fu utilizzato un substrato non contenente il fluoroforo, testato sia in presenza che in assenza di Res. La quantità di nicotinamide formata, come prodotto di reazione, aumentava ogni volta, ma la presenza di Res non influenzava significativamente il tasso di formazione di nicotinamide. Questi dati hanno dunque dimostrato che il fluoroforo era richiesto per l’attivazione da parte di Res. Nello specifico Res attiva l’enzima nei confronti di un peptide acetilato, ma smette di influenzarne l’attività una volta rimosso il fluoroforo [Kaeberlein et al., 2005; Borra et al., 2005]. Fu successivamente ipotizzato e dimostrato da Margie e colleghi che Res determinava un più stretto legame al fluoroforo nel substrato peptidico [Margie et al., 2005]. Per valutare questa ipotesi, fu condotto uno studio sfruttando una reazione competitiva, dalla quale risultò evidente che Res aumentava l’affinità di legame per SIRT1 dei peptidi resi fluorescenti, ma non dei peptidi mancanti del fluoroforo.

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Complessivamente questi dati hanno suggerito che l’attività di Res su SIRT1 è quella di indurre dei cambiamenti conformazionali nell’enzima, che così accoglie meglio il legame del fluoroforo con i corrispettivi substrati peptidici.

Res può servire come un simulatore di regolatori endogeni, che potrebbero alterare la struttura e la funzione SIRT1, rendendo possibile un apparente upregulation dell'enzima. SIRT1, una volta attivato, può mostrare una alterata specificità per un distinto substrato acetilato o può dimostrare una maggiore affinità per quest'ultimo. Poiché SIRT1 non è in grado, da solo, di mostrare selettività per il substrato [Blender et al., 2005], potrebbe aver bisogno dell'aiuto di un attivatore per sfruttare questa proprietà intrinseca e discriminare tra i possibili target.

Il Res è ancora oggi uno dei più potenti attivatori di SIRT1, tuttavia mostra numerosi effetti off-target non correlati alle sirtuine. Probabilmente il difetto più grande di Res nel sondare la funzionalità di SIRT1 è la sua mancanza di specificità (Figura 31) ma, un altro punto da sottolineare è la biodisponibilità. Infatti nei mammiferi è bassa a tal punto che le dosi richieste per attivare SIRT1 in vivo non sono mai raggiunte, o solo per un breve intervallo.

Figura 31. Target molecolari di Res: come agente farmacologico Res ha un ampio numero di

target che ne determinano una scarsa specificità d'azione.

Da qui la necessità di trovare nuove molecole naturali o sintetiche che possano agire positivamente sull'attività di SIRT1, superando le problematiche che contraddistinguono il Res.

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Scopo della ricerca

Dal momento che l'aspettativa di vita umana aumenta grazie all'efficace trattamento delle malattie cardiovascolari e di altre, vi è necessità di sviluppare strategie volte a preservare l'efficacia dei meccanismi cardioprotettivi anche nei cuori invecchiati o per rallentare l’aging. Chiaramente, la correzione della disfunzione dei canali ionici mitocondriali può migliorare la funzione degli organelli e può anche essere utile per rallentare il processo di aging mitocondriale e le relative patologie. Attivatori dei mitoK sono quindi agenti promettenti e innovativi per limitare il danno miocardico causato da episodi ischemici [Testai et al., 2014]. Nell’organismo umano, l’attività costitutiva di SIRT1 è basilare per la regolazione di svariati processi fisiologici e particolarmente interessante dal punto di vista farmacologico è il suo possibile coinvolgimento nei processi di aging e nelle patologie correlate. L’espressione del gene che codifica per questo enzima decresce nel corso degli anni ed è alterata in diverse patologie, spesso fatali. A tal proposito SIRT1 è stato dimostrato essere un enzima chiave nel contrastare il danno miocardico da I/R e nell'attenuare il processo apoptotico e lo stress ossidativo a cui vanno incontro i cardiomiociti in tale condizione. Partendo da un’attenta analisi dei dati in letteratura, relativi al coinvolgimento di SIRT1 in numerosi stati fisiopatologici, è emersa la necessità di identificare nuove molecole in grado di modulare l’attività dell’enzima attraverso una sua attivazione o inibizione, entrambe interessanti farmacologicamente, nel tentativo di aprire la strada verso future strategie terapeutiche.

Alla luce di quanto detto, l’obiettivo di questa tesi di Laurea è stato quello di individuare delle molecole che potessero essere utilizzate come attivatrici di SIRT1 per scongiurare i danni a carico del muscolo cardiaco, che più frequentemente sopraggiungono con l’età. A tal proposito un noto attivatore di SIRT1 è Res, un polifenolo naturale sintetizzato in numerose piante a scopo protettivo in risposta a situazioni di stress e presente nell’uva e nel vino rosso.

Questo lavoro di tesi si è allora svolto in due tappe successive. La prima fase è stata definita "esplorativa": è stato sottoposto ad uno screening in vitro un vasto numero di molecole, naturali e sintetiche, in origine sviluppate a partire dalla struttura di Res ma poi modificate al fine di ottenere una eterogeneità strutturale

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che potesse consentire di sviluppare meglio il farmacoforo per un composto che agisse come ottimale attivatore SIRT1. Dalla fase esplorativa è poi stato selezionato un numero più limitato di composti che sono successivamente stati presi come punto di partenza per la seconda fase di ricerca. Su queste molecole è stata verificata l'ipotesi iniziale secondo cui l'attività su SIRT1 potesse risultare vantaggiosa nel trattamento del danno da I/R, utilizzando un modello in vivo di infarto del miocardio.

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Capitolo 2

Materiali e metodi