Il trattamento in cronico è stato condotto su topi di sesso maschile, di 6 mesi di età, di peso compreso tra 25-35 grammi, in conformità alla normativa comunitaria (Direttiva CEE 2010/63) ed italiana (D.L. 4 Marzo 2014 n.26). I topi erano esposti a cicli di buio/luce di 12 ore, ad una temperatura di 22°C e sono stati allevati in gabbie dove avevano libero accesso a cibo e ad acqua.
Gli animali sono stati suddivisi in quattro gruppi di cinque topi ciascuno: due gruppi sono stati trattati per tre mesi (fino a 9 mesi di età), rispettivamente con DMSO disciolto in acqua (veicolo) e con Nar, disciolta in DMSO e successivamente diluite in acqua da bere, alla dose finale di 100 mg/Kg. Altri due gruppi, trattati in maniera del tutto analoga, sono stati invece seguiti per un tempo complessivo di sei mesi, raggiungendo un’età di 12 mesi.
2.4.1 Sacrifici
Prima di procedere con l’anestesia, è stata analizzata la glicemia dei topi praticando un piccolo taglietto all’estremità della coda, utilizzando l’apposito strumento (Glucocard™ Gmeter, MENARANI). Quindi i topi sono stati anestetizzati con una dose i.p. di uretano (100 µL ogni 10 grammi dfi peso). Attraverso toracotomia è stato esposto il cuore dei topi, dal quale è stato eseguito un prelievo intracardiaco. Il panel lipidico e il valore di emoglobina aglicata sono stati misurati con l’apposito strumento (cobas b 101, Roche). Quindi i cuori sono stati prelevati e
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posti in una soluzione costituita da un buffer salino di fosfato (PBS) 1X, pH 7.4, dentro a piccole petri mantenute in ghiaccio. I cuori sono allora stati divisi in più frammenti, destinati in un secondo momento ad analisi diverse, in particolare: • Una porzione è stata utilizzata per lo svolgimento di un’analisi istologica e la successiva acquisizione di immagini qualitative. I ventricoli sinistri dei topi sono stati isolati e inclusi in OCT (Optimal Cutting Temperature, Sakura, Japan). Usando un criostato manuale (l) sono state ottenute delle criosezioni di ventricolo, di 20 µm di spessore, e raccolte in dei vetrini. Le sezioni ventricolari sono poi state incubate in una soluzione di DHE 10 µM per 30 minuti alla temperatura di 37°C. Successivamente le sezioni sono state sottoposte a tre lavaggi da 5 minuti in PBS e allestite per l’imaging confocale con Vectashield (Vector, Burlingame). Le immagini confocali sono state ottenute per ogni sezione, usando un microscopio confocale TCS-SP2 (Leica, Germany). Con lo scopo di valutare la produzione di ROS nei differenti gruppi sperimentali, sono stati acquisiti sei campoi per ogni sezione del ventricolo sinistro analizzato e sono state campionate tre sezioni per ogni ventricolo sinistro di tre animali per gruppo.
• Una parte di cuore è stata destinata all’analisi Western Blotting (WB). Sono stati analizzati due campioni differenti:
1) Ventricoli sinistri di cuori di topo di 9 e 12 mesi di età, dai quali sono stati ottenuti lisati tissutali totali. Inizialmente è stato preparato l’omogenato cardiaco. Sono stati incubati i campioni in RIPA buffer (Tris-HCl 20 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, TRITON X-100 1%, Na-deossicolato 1%, SDS 0,1%, PMSF 1 mM) e sono stati sminuzzati finemente. In seguito, rimosso il RIPA, i vari frammenti sono stati trasferiti in un tubo da centrifuga e addizionati a 250 µL di altro RIPA. I campioni sono quindi stati omogenizzati attraverso l’utilizzo del turrax tenendo il tubo in ghiaccio. 100 µL dell’omogenato cardiaco ottenuto sono stati trasferiti in un apposito criotubo e conservati a -80°C. Per ottenere il lisato totale i 100 µL di omogenato cardiaco sono stati trattati con 20 µL di KCl 2,5 M, 5 µL di TRITON X-100 e 1 µL di inibitori delle proteasi, è stato messo in incubazione a RT e centrifugato a 10000 RPM per 5 minuti a 4°C.
2) Ventricoli sinistri di cuore di topo di 9 e 12 mesi di età, dai quali è stato ottenuto un lisato mitocondriale. A partire dal volume rimanente di omogenato cardiaco (circa 150 µL) è stata fatta una prima centrifuga a
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3300 giri per 3 minuti a 4°C. Il surnatante è poi stato prelevato e trasferito in una nuova eppendorf e centrifugato a 11950 giri per 10 minuti a 4°C. Il surnatante rappresenta la porzione citosolica, mentre il precipitato rappresenta la frazione di membrana; quindi è stato risospeso il precipitato in 150 µL di RIPA buffer. La soluzione così ottenuta è stata nuovamente sottoposta a centrifugazione a 11950 giri per 10 minuti a 4°C. Il surnatante è stato eliminato e il pellet conservato a -80°C in un criotubo, tale pellet rappresenta il “pellet mitocondriale”. Per ottenere un lisato mitocondriale i 100 µL di pellet sono stati trattati con 20 µL di KCl 2,5 M, 5 µL di TRITON X-100 e 1 µL di inibitori delle proteasi, è stato messo in incubazione a RT e centrifugato a 10000 RPM per 5 minuti a 4°C.
2.4.2 Dosaggio proteico: Saggio di Bradford
Dopo aver ottenuto i campioni è stato effettuato il dosaggio proteico effettuando un’analisi colorimetrica mediante "Saggio di Bradford". Sono stati preparati i campioni contenenti 799 μL di acqua, 200 μL di colorante di Bradford e 1μL di campione; è stato inoltre preparato un altro campione contenente acqua che rappresenta il bianco. I campioni sono stati analizzati allo spettrofotometro per individuarne la concentrazione. A tutti i campioni verrà aggiunto in diluizione 1:1 il Sample Buffer (Sigma-Aldrich), necessario per la conservazione dei lisati.
2.4.3 Western Blotting
I campioni sono stati processati mediante l'utilizzo di un'analisi semi-quantitativa, come il WB. 50 μg di proteine totali sono state caricate su un gel pre-cast 4-20% di acrilammide (Bio-Rad) per la corsa elettroforetica SDS-PAGE, dove la separazione avviene per differenza fra pesi molecolari poiché il rapporto massa/carica di ogni proteina rimane costante grazie alla carica data dal Sodio Dodecil Solfato (SDS). Il gel è stato inserito nella camera di elettroforesi ed è stato aggiunto il tampone per la corsa formato da Tris-HCl 25 mM pH 8.3, Glicina 192
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mM e SDS allo 0,1%. Insieme ai campioni da analizzare è stato caricato un pozzetto con 6 μL di standard (Bio-Rad) in modo da poter seguire la corsa elettroforetica e per individuare il peso molecolare della proteina di interesse. Allo stesso modo i pozzetti inutilizzati sono stati caricati con circa 10 μL di sample buffer per evitare la distorsione delle bande durante la corsa. La corsa elettroforetica è stata eseguita fornendo una corrente costante pari a 120-150 mV. Una volta terminata la corsa, le proteine sono state trasferite su una membrana in PVDF, utilizzando Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) e alla fine del trasferimento la membrana è stata colorata con Amido Black (0,1% w/v Naftol Blue Black in 10% v/v di metanolo + 2% v/v di acido acetico) in modo da controllare che il trasferimento delle proteine fosse avvenuto correttamente. La membrana è stata poi decolorata con una soluzione acquosa di metanolo al 50% v/v + acido acetico al 7%. Sono allora stati fatti alcuni lavaggi veloci con TBS+TWEEN al 20% (TRIS Buffered Saline: 200 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.4, Tween 20%). Prima di procedere con il bloccaggio dei legami aspecifici in latte al 3% (sciolto in TBS+TWEEN al 20%) la membrana è stata tagliata in due parti, a seconda dei pesi molecolari delle proteine di interesse, riconoscibili grazie alla corsa dello standard:
• GAPDH (37 kDa) che rappresenta l’Housekeeping per la ricerca di SIRT1;
• ATP5A (53 kDa) che rappresenta l’Housekeeping per la ricerca delle subunità α • β dei mitoBK;
• SIRT1 (81 kDa), ricercato nei campioni 2); • MaxiKa (130 kDa), ricercato nei campioni 1); • Sloβ1 (32 kDa), ricercato nei campioni 1).
Dopo 60 minuti di blocking a RT, la membrana è stata incubata overnight a 4°C con l'anticorpo primario: Ab per GAPDH prodotto in rabbit (1:1000, Millipore) per i campioni 2), Ab per ATP5A prodotto in mouse (1:500, AbCam) per i campioni 1), Ab per SIRT1 prodotto in mouse (1:1000, AbCam) per i campioni 2), Ab per MaxiKa prodotto in goat (1:100, AbCam) per i campioni 1) e Ab per la subunità β prodotto in rabbit (1:200, AbCam) per i campioni 1), tutti diluiti in latte al 3%.
Il giorno seguente sono state lasciate le membrane 10 minuti a RT, sono stati fatti tre lavaggi da 10 minuti in latte al 3% e poi sono state incubate con il rispettivo anticorpo secondario: anti-rabbit (1:5000 Millipore), anti-mouse (1:5000 Millipore), anti-goat (1:7500, Santa-Cruz) per 120 minuti a RT. Prima dello sviluppo sono stati
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fatti tre lavaggi da 10 minuti in TBS+TWEEN al 20%. Le bande sono state rilevate utilizzando un kit chemioluminescente (Luminata Forte, Millipore) e quantificate utilizzando la densitometria ottica.
I dati ottenuti sono successivamente stati valutati in termini di incremento di espressione diSIRT1, MaxiKa e Sloβ1; in particolare risultano dalla differenza tra i valori ottenuti a seguito del trattamento e quelli dei corrispondenti veicoli (animali della stessa età, non trattati con Nar).
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