Ricerca di Salmonella spp

La ricerca delle salmonelle negli alimenti prevede le seguenti fasi:

Pre-arricchimento non selettivo in terreno liquido con Acqua peptonata tamponata a pH 7 - a tale scopo 225 mL di Acqua peptonata tamponata vengono aggiunti a 25 g di campione così da ottenere la diluizione 1:10. Dopo omogeneizzazione per 30 secondi, il sacchetto viene posto ad incubare a 37 ° C per 24 ore.

Questo terreno colturale viene preventivamente tamponato con tampone di Sorensen, portando il pH a 7.0 ± 0,1 a 25° C. Si usa la soluzione tampone per mantenere costante il pH visto che dal metabolismo batterico può generarsi un’acidificazione.

Arricchimento selettivo in terreni liquidi – a tale scopo 1 mL di pre-arricchimento è inoculato in 10 mL di Selenite Cystine Broth (di colore giallo-arancione) con pH 7.0 ± 0,2 a 25 ° C, posto ad incubare a 37° C per 24 ore; 0,1 mL di pre-arricchimento è inoculato in

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10 mL di Rappaport Vassiliadis Soy Broth (di colore blu metallico) con pH 5,2 ± 0,2, posto ad incubare a 42° C per 24 ore. (Fig. 9).

Fig. 9: Terreni liquidi per l’arricchimento selettivo. Selenite Cystine Broth (colore giallo-arancione) e Rappaport Vassiliadis Soy Broth (colore blu metallico) (Foto personale).

Semina su terreni solidi selettivi e differenziali – a tale scopo, partendo da ciascun arricchimento, un’ansata di brodocoltura viene deposta e poi strisciata mediante spatola sterile su due piastre di terreno solido selettivo, una di Salmonella-Shigella Agar (SS Agar), di colore arancio – marrone con pH 7.0 ± 0,2, e una di Verde Brillante Agar (BGA), di colore giallo – bruno con pH 6.9 ± 0,1. Le piastre così seminate sono poste ad incubare a 37° C per 24 ore.

SS agar contiene sali biliari e citrato di sodio, che rendono il terreno selettivo perché inibiscono la crescita dei batteri Gram + e dei Gram – più esigenti, lattosio, con il rosso neutro come indicatore di pH, che rende il terreno differenziale poiché Salmonella e

Shigella non fermentano il lattosio a differenza di altri Gram – e tiosolfato di sodio e

citrato di ferro che rendono possibile l’evidenziazione dei produttori di idrogeno solforato.

Il terreno BGA contiene verde brillante che inibisce i Gram-positivi e gran parte dei Gram- negativi e due carboidrati, lattosio e saccarosio; la fermentazione di uno di questi zuccheri provoca una diminuzione del pH che, in presenza dell'indicatore di pH rosso fenolo, provoca la comparsa di colonie giallo-verdi (ad esempio E. coli).

Le salmonelle non producono acido a partire da questi zuccheri e formano colonie da incolori a rosastre .

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Riconoscimento colonie sospette: su SS Agar le specie di Salmonella che non fermentano il lattosio formano colonie trasparenti, incolori, con o senza centro nero; la colorazione nera è dovuta alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di idrogeno solforato a partire dal sodio tiosolfato presente nel terreno (Fig. 10).

Fig. 10: Colonia di Salmonella spp. su SS Agar (https://s-media-cache-ak0.pinimg.com)

Su BGA le colonie di Salmonella (a parte S. ser. Typhi e S. ser. Paratyphi) appaiono piccole, da bianche a rosse, circondate da zone rosse, poiché il terreno ha virato verso il rosso/fucsia. (Fig.11).

Fig. 11: Colonie di Salmonella spp. su BGA. (http://atlas.sund.ku.dk)

Conferma mediante test biochimici - per completare l'identificazione si ricorre alla semina su TSI (Triple Sugar Iron Agar), terreno differenziale utilizzato per l’identificazione degli enterobatteri, mediante l’evidenziazione rapida della fermentazione di lattosio, glucosio (con o senza produzione di gas) e saccarosio e, della produzione di idrogeno solforato. Il TSI Agar fornisce quattro tipi di informazioni:

(1) Fermentazione del glucosio:

45  Fondo giallo: glucosio fermentato, (2) Fermentazione del lattosio e/o saccarosio

 Becco di clarino rosso: lattosio e saccarosio non fermentati,  Becco di clarino giallo: lattosio e saccarosio fermentati, (3) Produzione di gas

 Produzione di bolle di gas sul fondo della provetta, (4) Formazione di H2S

 Formazione di un colore nero tra il fondo e il becco di clarino o lungo la sede d’infissione.

Il TSI ha un pH di 7.3 e colore rosso; fintanto che è liquido occorre metterlo in provetta sterile e raffreddarlo in posizione inclinata in modo da conferirgli la forma a becco di clarino, così da ottenere una volta solido una parte inferiore cilindrica ed una superiore inclinata.

La semina della colonia sospetta, morfologicamente riconducibile a Salmonella e sviluppata su SS Agar e su BGA, viene eseguita per infissione nel cilindro (tramite un ago sterile da inoculo) e per strisciamento sulla superficie inclinata. In questo modo i batteri seminati per strisciamento saranno a contatto con l'aria, mentre quelli seminati per infissione disporranno di condizioni anaerobiche. Dopo incubazione a 37°C per 24 ore si assiste ad una variazione cromatica del TSI (Fig.12), la cui interpretazione può avere le seguenti diverse chiavi di lettura:

 nella porzione superiore slant alcalino (rosso) (il batterio inoculato non ha fermentato il lattosio) e presenza di alone nero dato dalla formazione di solfuro di ferro (reazione H2S positiva); nella porzione inferiore fondo acido (giallo) (fermentazione del glucosio) senza produzione di CO2. In questo caso è molto probabile che si tratti di Salmonella;

 slant che vira al rosso e cilindretto terminale nero. Potrebbe trattarsi di Proteus o di alcune salmonelle forti produttrici di idrogeno solforato (H2S);

 slant che diventa giallo e cilindretto terminale giallo con bolle per produzione di CO2. Il batterio inoculato respira e fermenta il lattosio e quindi può essere ricondotto ai coliformi (Enterobacteriaceae lattosio fermentanti ).

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Fig. 12: Salmonella in TSI. 1) Terreno non inoculato; 2) Salmonella dopo 18 ore; 3) Salmonella dopo 48 ore. La porzione terminale inizialmente gialla si annerisce totalmente per la produzione di idrogeno solforato; 4) Proteus dopo 18 ore; 5)

Proteus dopo 48 ore (http://atlas.sund.ku.dk).

Sia nel primo che nel secondo caso si procede effettuando il Test dell’ ureasi (o test di Christensen) e il Test dell’ONPG, ai quali Salmonella risulterà negativa.

Test dell’ureasi - si valuta se è presente l’enzima idrolitico ureasi mediante il viraggio dell’indicatore a rosso-ciclamino, causato dall’alcalinizzazione del terreno in seguito alla idrolisi dell’urea in NH3 e CO2. L’enzima ureasi è prodotto da alcuni enterobatteri come quelli appartenenti al genere Proteus. Per effettuare questo test si preleva un’ansata dalla patina formatasi sullo slant del TSI e si stempera in 1 mL di Urea Broth, inizialmente di color arancione chiaro. Dopo incubazione a 37° C per 24 ore, se il terreno mantiene la sua colorazione iniziale, si può supporre di essere di fronte a Salmonella, che è ureasi negativa; se viceversa il terreno vira verso il colore rosa, si tratta di Proteus (Fig.13).

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Fig. 13: Test dell’ureasi. 1) Reazione negativa per Salmonella; 2) Reazione positiva per Proteus (http://atlas.sund.ku.dk).

Test dell’ ONPG o di determinazione dell’attività β-galattosidasica. - la β – galattosidasi è un enzima intracellulare che idrolizza il legame β – glicosidico che unisce glucosio e galattosio in una molecola di lattosio, che può entrare nella cellula batterica grazie alla galattosio permeasi. I batteri che fermentano il lattosio possiedono entrambi gli enzimi. I batteri lenti-fermentanti il lattosio, invece, mancano della permeasi, ma posseggono la β- galattosidasi, che può essere svelata addizionando al terreno di coltura un substrato analogo al lattosio come l’ONPG (o- nitrofenil-β-galattopiranoside).

Se il microrganismo ha attività β-galattosidica, l’ONPG, incolore, una volta passato nella cellula per diffusione osmotica, viene idrolizzato e libera un composto di colore giallo. Per effettuare questo test viene prelevata un’ansata dalla patina batterica dello slant del TSI, che è poi stemperata in una provetta contenente ONPG. Dopo incubazione a 37° C per 24 ore, si può osservare un viraggio di colore attribuibile a Salmonella arizona (lenta fermentante del lattosio) o a Citrobacter, altro microrganismo appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae (Fig.14).

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Fig. 14: Test dell’ONPG. 1) Reazione negativa; 2) Reazione positiva, Salmonella arizona o Citrobacter (http://atlas.sund.ku.dk).

Per ulteriore conferma della presenza delle salmonelle è necessario ricorrere al test di sierotipizzazione, grazie al quale è possibile identificare il sierotipo di Salmonella.