Gli isolamenti dei lieviti dai mosti/vini in fermentazione sono stati l’occasio- ne per un’analisi della popolazione di lieviti presente. Già nei campio- namenti fatti pochi giorni dopo la pigiatura si evidenzia raramente una popolazione di lieviti non-Saccha-
romyces. Dunque lieviti appartenenti
alla specie S. cerevisiae dominano la popolazione microbica nelle prime fasi della fermentazione alcolica con concentrazioni elevate, nell’ordine delle 107 cellule/mL. L’analisi moleco-
lare degli isolati di lievito ha permes- so l’identificazione di 12 differenti biotipi, appartenenti alla specie S.
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
12% alcol 14% alcol 16% alcol
V max (g C O2 L- 1Gio rno -1)
C1 (media Vmax) C2 (media Vmax)
Fase Tecniche impiegate Scopo
Prelievo campioni da mosto/vino in fermentazione
Prelievo con contenitori sterili e trasporto refrigerato al laboratorio
Raccogliere e preservare il maggior numero di lieviti appartenenti alla specie S.
cerevisiae già adattati alle
condizioni proprie di vinificazione di ciascuna cantina Analisi microbiologica, isolamento
lieviti appartenenti al genere S.
cerevisiae
Conta su Piastra Petri utilizzando terreni selettivi per diversi gruppo
di microrganismi
Identificazione biotipi di lievito
appartenenti al genere S. cerevisiae PCR interdelta
Identificare i ceppi di S. cerevisiae ottenendo un profilo caratteristico
per evitare doppioni e per garantire la successiva tracciabilità
dei microrganismi
Test fisiologici in terreno sintetico Misura della densità o del peso dei
campioni, analisi citofluorimetrica, analisi dei parametri chimici
mediante FT-IR
Caratterizzare i ceppi di lievito per saggiarne il potenziale enologico, la resistenza a fattori limitanti ed
escludere effetti alterativi Test fisiologici in vino
Conservazione dei ceppi di lievito e produzione
Congelamento a -80°C, moltiplicazione i terreni sintetici in
condizioni controllati
Mantenere le caratteristiche dei ceppi di lievito e produrre biomasse pure e con alta vitalità
Tabella 1
Protocollo di isolamento e selezione di ceppi di lievito messo a punto dal Laboratorio di Microbiologia
Figura 1
Andamento della Velocità Massima di Fermentazione in funzione del grado alcolico potenziale in una popolazione di ceppi di S. cerevisiae isolati nel com- prensorio di Montalcino V max (gC O2 L -1Gior no -1)
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 V max (g C O2 L- 1Gio rno -1)
C1 (media Vmax) C2 (media Vmax)
pH 3,00 pH 3,30 pH 3,50
Figura 2
Andamento della Velocità Massima di Fermentazione in funzione del pH del mezzo di sviluppo in una popolazione di ceppi di S. cerevisiae isolati
nel comprensorio di Montalcino
Figura 3
Test di fermentazione su ceppi indigeni di S. cerevisiae isolati nel comprensorio di Montalcino. Effetto di diverse gradazioni alcoliche potenziali sull’andamento della fermentazione
Figura 4
Andamento della Velocità Massima di Fermentazione in funzione della temperatura di incubazione
in una popolazione di ceppi di S. cerevisiae isolati nel comprensorio di Montalcino
cerevisiae. Più nel dettaglio, dalla can-
tina C_1 sono stati isolati 5 biotipi e 7 dalla C_2, una buona biodiversità se si considera l’areale ristretto ed ome- ogeno di provenienza delle uve e le analogie del processo di vinificazione. Durante i test di fermentazione si è ritenuto opportuno focalizzare l’at- tenzione sulla velocità massima di
fermentazione raggiunta da ciascun ceppo. L’intera popolazione di lieviti è caratterizzata da buona attitudine fer- mentativa anche a gradazioni elevate (fino a 16% v/v) (Fig. 1). L’aumentare della concentrazione zuccherina, e dunque del grado alcolico potenzia- le, rappresenta una fonte di stress per i lieviti. La velocità massima di
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 30 Giorni di fermentazione C1 18°C (media) C2 18°C (media) C1 28°C (media) C2 28°C (media) C1 30°C (media) C2 30°C (media) C1 35°C (media) C2 35°C (media) 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 18°C 28°C 30°C 35°C V max (g C O2 L- 1Gio rno -1)
C1 (media Vmax) C2 (media Vmax)
V max (gC O2 L -1Gior no -1) Consumo zucc heri (g C O2 L -1) V max (gC O2 L -1Gior no -1)
Figura 5
Andamento della Velocità Massima di Fermentazione in funzione
della dotazione nutrizionale in composti azotati in una popolazione di ceppi di S. cerevisiae isolati nel comprensorio di Montalcino
Figura 6
Principal Component Analysis (PCA) delle velocità massima di fermentazione di ceppi di S. cerevisiae isolati
nel comprensorio di Montalcino, i n presenza di fattori limitanti. Proiezione dei casi (ceppi di lievito) nel piano fattoriale 1 X 2. Si noti la diversa segregazione dei ceppi di lievito appartenenti alle due cantine
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
APA1 APA2 APA3
V max (g C O2 L- 1Gio rno -1)
C1 (media Vmax) C2 (media Vmax)
fermentazione è raggiunta a 12 gradi alcolici potenziali, con una riduzio- ne ai due livelli successivi. Le prove a differenti livelli di pH confermano il ruolo di questa variabile nel con- dizionare l’attività cellulare. Pur non osservando arresti di fermentazione, il calo del pH riduce la velocità mas- sima di consumo degli zuccheri con un trend più sensibile del precedente esperimento (Fig. 2). I test di fermen- tazione condotti a differenti livelli di temperatura mostrano risultati più complessi (Fig. 3). Incrementando la temperatura da 18 a 30°C si osserva un aumento della velocità fermenta- tiva (Fig. 4). In ogni caso tutte e 3 le prove hanno dato esisto soddisfacen- te con un completo consumo degli zuccheri. Invece, a 35°C si osserva un
rallentamento della fermentazione e, dopo 12 giorni, un blocco completo dell’attività fermentativa. La tempera- tura di 35°C è, nelle condizioni date, l’unico fattore limitante in grado di causare un arresto di fermentazio- ne. Questa evenienza non è del tut- to inattesa considerando il carattere mesofilo dei lieviti. Tuttavia un blocco così repentino segnala la necessità di un monitoraggio puntale delle tem- perature di fermentazione evitando picchi eccessivi che potrebbero inter- ferire con attività metaboliche dei lie- viti di rilievo enologico. Nei test votati a verificare il fabbisogno in frazioni azotate si sono considerati tre livelli: il livello nativo del mosto sintetico (APA 3) e due livelli aventi rispettivamen- te lo 0,25 (APA 1) e lo 0,50 % (APA 2) V max (gC O2 L -1Gior no -1)
del contenuto nativo. La più elevata dotazione in APA garantisce la mas- sima velocità di fermentazione e non vi sono differenze significative tra le due prove condotte in carenza (Fig. 5). Questi risultati confermano l’im- portanza di una corretta nutrizione nel favorire il decorso fermentativo. Dall’analisi PCA dei dati ottenuti nei test di fermentazione (Fig. 6) emer- ge che il pH e la temperatura sono i fattori ai quali i ceppi risultano mag- giormente resistenti. Vi sono tuttavia differenze significative con alcuni mi- crorganismi presentano buona tolle- ranza a bassi livelli di azoto. Un'altra osservazione interessante riguarda la segregazione dei ceppi in funzione della cantina. I ceppi della cantina C2 risultano raggruppati tra loro, dun- que con caratteristiche comuni men- tre i ceppi della cantina C1 risultano dispersi e dunque con caratteri dif- ferenti. Questa diversa segregazione rappresenta efficacemente le due re- altà considerate. Entrambe vinificano uve di Sangiovese del comprensorio di Montalcino ma C2 presenta dimen-
sioni ridotte, circa 10 ettari, raggrup- pati in un unico corpo. C1 ha un par- co vigneti più ampio, circa 30 ettari, raggruppati in 4 poderi distinti per caratteri agronomici e dunque anche per le caratteristiche dei vini ottenuti. Anche il processo di vinificazione, che privilegia fermentazioni in grandi tini di legno senza forzature e controllo della temperatura, e mira a produzio- ne di vini longevi, caratterizzati dun- que da una viva acidità, sembra ben corrispondere alle caratteristiche dei ceppi di lievito isolati.
In conclusione le indagini svolte han- no permesso di rilevare una popola- zione di biotipi di Saccharomyces cere-
visiae ben adattati alle peculiarità del
comprensorio di Montalcino pur con significative differenze tra le due can- tine considerate. Si conferma dunque la capacità di questo microrganismo di evolvere adattandosi allo specifico contesto nel quale si trova a svilup- parsi, rappresentando uno dei fattori che contribuiscono a determinare le caratteristiche proprie di un sistema complesso come quello vitienologico.