55 Lo stress è una condizione fisiologica in cui l’equilibrio psicofisico viene alterato e l’organismo reagisce per adattarsi e ripristinare una situazione bilanciata. Tale adattamento avviene attraverso l’attivazione di diverse vie neuronali tra cui l’asse ipotalamo-ipofisario oppure la stimolazione dei neuroni del sistema autonomo. Questo tipo di attività causa una variazione nella composizione dei vari fluidi biologici. E’ stato visto infatti ad esempio che la stimolazione di neuroni appartenenti al sistema simpatico, causa un cambiamento nella secrezione della proteina α-amilasi da parte delle ghiandole salivari. Scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di studiare tramite l’analisi proteomica come variava la composizione in proteine della saliva in soggetti di età compresa tra 18-30 anni sottoposti ad un potenziale stress conseguente all’aver ricreato una situazione più simile possibile a quella di un esame universitario, spesso caratterizzato da uno stato di ansia da performance, e osservare quali fossero gli effetti della diffusione di odori piacevoli sui livelli di stress.
L’analisi proteomica salivare è stata condotta su campioni di saliva di 21 studenti suddivisi in due gruppi che differivano per la condizione sperimentale. Tutti i soggetti venivano sottoposti ad una fase di rilassamento caratterizzata da una stimolazione uditiva piacevole, che nel caso del gruppo sperimentale (gruppo P) era unita ad una stimolazione olfattiva attraverso diffusione di un odore gradevole nella stanza (arancio, menta etc..), mentre per i soggetti appartenenti al gruppo di controllo (gruppo N) l’ambiente rimaneva neutro, limitato alla sola stimolazione uditiva.
Tutti i soggetti entrati a far parte dello studio sono stati selezionati come descritto in metodi, e venivano sottoposti durante la sperimentazione anche alla registrazione della conduttività cutanea per verificare l’effettiva attivazione del sistema simpatico in seguito allo stimolo stressante che ha permesso di valutare diversi parametri fisiologici. In figura 19 è riportato il grafico della registrazione di questa attività mentre tabella 4 riporta l’analisi univariata. E’ possibile vedere come ci sia una risposta significativa (task*) all’interno di ogni gruppo nelle tre fasi del test, riposo, studio e presentazione sia per quanto riguarda il sistema simpatico (attivato) che quello parasimpatico (inibito) mentre non ci sia differenza significativa nel task tra i due gruppi P ed N in queste risposte al test.
56 Figura 19- Registrazione della risposta del sistema autonomo dei soggetti durante la sperimentazione. Blu: Gruppo P; Arancione: Gruppo N. Fattore tra soggetti GRUPPO (Task*) (Profumo (P), No-Profumo (N)). Fattore Entro soggetti (Task) (Riposo, Studio, Presentazione).
Tabella 3- Analisi della varianza per misure ripetute (IBM SPSS 20) separatamente per la variabile PNS (Sistema parasimpatico) e SNS (Sistema simpatico) Nota: lo zero rappresenta il valore medio normalizzato di PNS e SNS a riposo nella popolazione generale; le unità (1,2,3 ecc) sono deviazioni standard nella popolazione generale. -2 -1 0 1 2 3 4
riposo studio presentazione
PNS P PNS N SNS P SNS N
Gruppo Riposo Studio Presentazione PNS Parasimpatico P 0,35 -0,97 -1,35 PNS Parasimpatico N 0,57 -0,48 -1,07 SNS Simpatico P -0,08 1,78 2,64 SNS Simpatico N -0,38 0,87 1,69 SEM PNS N 0,34 0,37 0,24 SEM PNS P 0,26 0,63 1,10 SEM SNS N 0,21 0,37 0,42 SEM SNS P 0,63 1,48 2,34 Gruppo P Gruppo N
57
Test univariati
Sorgente Misura Somma dei quadrati Tipo III
df Media dei quadrati F Significatività Task PNS 18,201 2 9,101 12,691 0,000 SNS 36,247 2 18,123 10,239 0,001 Task * gruppo PNS 0,129 2 0,065 0,090 0,914 SNS 0,809 2 0,405 0,229 0,798 Errore(task) PNS 15,777 22 0,717 SNS 38,940 22 1,770
Tabella 4-PNS effetto task significativo F (2,22)= 12,69, p<0,000 (riposo>studio>presentazione). Interazione task*gruppo non significativa. Effetto gruppo non significativo.
Per ogni soggetto abbiamo effettuato due prelievi di saliva uno al tempo 0 al termine della fase di rilassamento ed uno al tempo 1 successivo alla prova d’esame. I campioni di saliva prelevati venivano immediatamente processati e conservati a -80°C per poi essere analizzati tramite 2DE.
In figura 20 è riportata un’immagine rappresentativa di un pattern salivare bidimensionale ottenuto da una separazione delle proteine su gradiente di pH 3-10 lineare seguito da una separazione SDS-PAGE al 12%. Tutte le immagini ottenute dai campioni di saliva dei soggetti ai tempi T0 e T1 sono state analizzate tramite SameSpot utilizzando un’analisi statistica t Student per dati appaiati.
Abbiamo condotto diverse analisi comparative: nella prima abbiamo valutato esclusivamente l’effetto dello stress, a prescindere dalla tipologia di fase di rilassamento, confrontando i patterns salivari di tutti i soggetti ottenuti al tempo T1 con tutti quelli
58 corrispondenti ottenuti al tempo T0. Nella seconda abbiamo tenuto separati i due gruppi P ed N per vedere se l’aggiunta di uno stimolo olfattivo nella fase di rilassamento producesse una risposta diversa dopo la fase di stress.
Figura 20-Immagine rappresentativa di un profilo di proteine salivari. I numeri indicano tutti gli spots che sono stati trovati differenzialmente espressi in modo significativo a seguito delle diverse analisi comparative
pH 3
Linear
10
MW
(Kda)
90
12
56 6 579 98 2 91 0 92 3 105 5 139 1 142 3 63 8 42 1 47 2 39 1 39 7 46 8 45 1 20 2 21 0 25 2 30 8 35 8 31 9 57 3 94 6 93 8 90 1 21 6 94 9 87 7 34 059 In Figura 21 è riportata il diagramma di Venn che permette di avere una visione d’insieme dei risultati ottenuti dalle tre analisi comparative effettuate. Un totale di 29 spots risultano differenzialmente espressi in modo significativo, a seguito dei tre confronti. La numerazione e la posizione degli spots è riportata in figura 20.
Per tutti i confronti effettuati abbiamo preso in considerazione tutti gli spots risultati differenzialmente espressi in modo significativo con p<0.05 senza tenere conto del fold di espressione che è risultato variare da un minimo di 1.1 ad un massimo di 2. Questo in considerazione del tipo di stimolo psicofisico e della sua durata che ci aspettiamo portare a variazioni di espressione delle proteine di piccola entità.
Figura 21-Diagramma di Venn degli spots trovati differenzialmente espressi nei tre confronti.
In Figura 22 sono riportati gli spots trovati differenzialmente espressi a seguito del confronto dei pattern salivari al tempo T1 verso T0 di tutti i soggetti sottoposti alla sperimentazione, e in figura 23 l’istogramma ottenuto riportando la densità di espressione media ± SD di ogni spot. In tabella 5 sono riportati il numero degli spots, il nome della
(A) T0 (N+P) Vs T1 (B) T0 (P) Vs T1 (C) T0 (N) Vs T1
T0 (N+P) Vs T1
T0 (P) Vs T1
60 proteina, la variazione di espressione (fold) e il valore medio di intensità dello spot ai tempi T1 e T0. 15 spots risultavano differenzialmente espressi, di questi 8 erano aumentati e i rimanenti 7 ridotti al tempo T1. Per la maggior parte di questi spots è stato possibile attribuire un’identificazione come proteina grazie ad una consolidata conoscenza del proteoma salivare da parte del gruppo di ricerca del Laboratorio dove ho svolto la tesi [75; 108-116]. Ben sei di questi spots sono attribuibili a isoforme dell’alfa-amilasi e tutti risultano incrementati di espressione con entità di variazione ≥ 1.3 in risposta alla condizione di stress, a conferma dei dati riportati in letteratura [78;80-82].
Successivamente il nostro interesse è stato quello di vedere se l’aggiunta nella fase di rilassamento di uno stimolo olfattivo creasse una situazione di partenza diversa tale da generare una risposta analoga o differente allo stress indotto. Per questo motivo abbiamo condotto due analisi comparative separate per i campioni di saliva del gruppo P e del gruppo N.
Figura 22-Spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per i tutti i soggetti della sperimentazione.
pH 3
Linear
10
MW
(Kda)
90
12
56 6 579 98 2 91 0 923 105 5 139 1 142 3 63 8 42 1 47 2 39 1 39 7 46 8 45 161 In figura 24 e 25 sono riportati rispettivamente un’immagine rappresentativa del pattern salivare con indicati gli spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per il gruppo N e gli istogrammi dei valori medi ± SD della densità ottica degli spots , analogamente in figura 26 e 27 per gli spots ottenuti dall’analisi del gruppo P. Infine in tabella 6 e 7 l’elenco degli spots, il nome della proteina, la variazione di espressione (fold)
Figura 23-Istogramma confronto T1 vs T0 per tutti i soggetti della sperimentazione
Tabella 5- Elenco degli spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto di tutti i campioni entrati a far parte dello studio.
62 e il valore medio di intensità dello spot ai tempi T1 e T0. Dall’analisi comparativa della condizione sperimentale P, 16 spots risultano differenzialmente espressi e per 13 di questi è stato possibile risalire all’identificazione. Dall’analisi della condizione N, 12 spots risultano differenzialmente espressi e ai qual è stato possibile attribuire un’identificazione. Possiamo notare che ritroviamo un incremento di espressione dell’alfa amilasi in entrambe le condizioni anche se in entità minore sia per numero di spots (4 spots) che di intensità di variazione (max 1.3 fold) nella condizione P rispetto alla N dove le variazioni di espressione di questa proteina (t1 vs T0) sono comprese tra 1.7 e 2.9 volte
Figura 24-Spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per i soggetti appartenenti al gruppo N (stimolazione uditiva).
63
Gruppo N
Figura 25-Istogrammi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per i soggetti appartenenti al gruppo N (stimolazione uditiva).
Tabella 6- Elenco degli spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto dei campioni ottenuti da soggetti gruppo N.
64
Gruppo P
Figura 26-Spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per i soggetti appartenenti al gruppo P (stimolazione uditiva+olfattiva).
Figura 27-Istogrammi Spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto T1 vs T0 per i soggetti appartenenti al gruppo P (stimolazione uditiva+olfattiva).
65 Tabella 7-Elenco degli spots differenzialmente espressi ottenuti dal confronto dei campioni ottenuti da soggetti gruppo P
Controversi i risultati di espressione ottenuti per le immunoglobuline e per il Polymeric immunoglobulin receptor precursor all’interno dei due gruppi. Infatti si osserva una riduzione significativa sia delle immunoglobuline, probabilmente appartenenti alle classi A/K/ lambda, che del recettore polimerico di circa 1.4 volte nei campioni di soggetti che hanno avuto anche una stimolazione olfattiva, mentre si osserva un incremento di immunoglobuline A/J e recettore polimerico nei campioni di saliva dei soggetti appartenenti al gruppo N. Dati di letteratura suggeriscono una riduzione delle immunoglobuline in seguito a stress[117], i nostri risultati confermano in un caso questo aspetto ma suggeriscono anche una diversità di risposta allo stress da parte di queste proteine che è legata al tipo di rilassamento indotto e che varia non solo da un punto di vista quantitativo ma molto probabilmente anche da un punto di vista qualitativo. L’identificazione degli spots, suggeriti essere immunoglobuline, tramite analisi di spettrometria di massa potrà aiutarci a comprendere meglio quali classi di
66 immunoglobuline sono coinvolte e rispondono allo stress partendo da condizioni diverse di rilassamento.
Infine, un’altra differenza significativa osservata tra i due gruppi è la riduzione di calgranulina B o S100A9 e l’incremento di Cistatina S osservati per il gruppo N. In un lavoro recente condotto da Jonasson et al [118] è stato dimostrato che uno stress psicologico acuto induce una variazione dei livelli di calgranuline A e B, dette anche allarmine. Gli autori hanno ipotizzato che il rilascio di calgranuline A e B sia parte integrante di una risposta infiammatoria rapida allo stress e che questa risposta possa essere esacerbata quando la risposta del cortisolo è disregolata. La cistatina S è un inibitore delle cisteine proteasi, e recentemente è stata suggerita insieme alla alfa amilasi come potenziale biomarcatore nello stress acuto indotto in pazienti [119] e possiamo ipotizzare che la sua riduzione potrebbe essere spiegata dalla sua capacità di rispondere e controllare la risposta immunitaria.
Un ultimo aspetto che ho curato durante il mio percorso di tesi ha riguardato un approccio metodologico. La colorazione delle immagini bidimensionali che ho finora descritto utilizza un complesso del rutenio determinando una colorazione in fluorescenza delle proteine. La colorazione in fluorescenza ha il grosso vantaggio di essere lineare nel tempo e direttamente proporzionale alla quantità di proteina presente, risultando così la più accettata dalla comunità scientifica. Tuttavia nel caso specifico della saliva abbiamo direttamente constatato che la colorazione in fluorescenza non riesce a visualizzare molte delle proteine presenti nel fluido salivare. Questo è confermato da dati di letteratura [120]. Infatti Hampel et al hanno dimostrato che si può assistere ad un abbattimento della fluorescenza o ad una assenza di colorazione di alcune proteine qualora siano presenti interferenti, come ad esempio ioni bivalenti quali calcio. Loro dimostrano infatti che alcune proteine leganti il calcio possono sfuggire alla colorazione al Rutenio su gel SDS. In questi casi è opportuno effettuare successivamente alla colorazione in fluorescenza un’altra colorazione per riuscire ad ottenere una stima corretta delle proteine presenti. Sicuramente dopo la colorazione in fluorescenza la colorazione all’argento è quella più sensibile. Abbiamo così deciso di condurre una seconda colorazione sui gel bidimensionali
67 di tutti i nostri campioni di saliva già colorati in fluorescenza. Abbiamo scelto di fare una colorazione all’Argento che fosse compatibile con la spettrometria di massa sostituendo la glutaraldeide utilizzata nella colorazione all’argento standard con la formaldeide. Questa modifica ci permetterà di poter tagliare e processare gli spots di interesse con la spettrometria di massa per ottenerne l’identificazione.
Figura 28-Immagine rappresentativa di un campione di saliva dopo aver effettuato una seconda colorazione all’argento
Dall’analisi con SameSpot è stato possibile apprezzare un incremento del numero di spots di circa un 10%. Abbiamo quindi condotto una prima analisi comparativa confrontando tutte le immagini ottenute dai campioni di saliva al tempo T1 con quelle al tempo T0 e
pH 3
Linear
10
MW
(Kda)
12
1180 3233 1368 1907 1586 1287 1184 852 872 745 673 821 891 650 716 1187 1181 3366 1442 2024 1230 1390 1400 1533 1500 686 650 3351 1189 1161 2513 3354 2296 2087 2086 1866 3364 1964 1977 2011 1505 1520 1529A
68 abbiamo ottenuto un maggior numero di spots differenzialmente espressi in modo significativo rispetto all’analisi condotta dopo colorazione al rutenio (RuBPS).
Questi risultati suggeriscono che la possibilità di colorare le proteine separate su SDS-PAGE con RuBPS e argento è vantaggiosa perché permette di non perdere informazioni su proteine potenzialmente di interesse che possono non essere rilevate qualora sia utilizzata una singola colorazione, aumentando così l’efficienza del rilevamento degli spots.
Conclusioni
La ricerca svolta durante la tesi suggerisce che l’analisi proteomica può essere un approccio utile per valutare le rapide risposte a livello molecolare indotte da uno stress acuto come quello psicosensoriale conseguente ad una prova di esame. L’analisi del proteoma salivare effettuato in questo studio suggerisce in particolare come la saliva sia specchio dei rapidi cambiamenti che possono avvenire a livello di composizione proteica in queste particolari situazioni sperimentali. La valutazione dei cambiamenti nell’espressione di alcune proteine salivari può così aiutare a comprendere meglio i meccanismi molecolari che si attivano a seguito di uno stress e come anche stimolazioni a livello sensoriale, sia a livello uditivo che olfattivo, siano in grado di variare la composizione delle proteine salivari. I risultati ottenuti, una volta validati e confermati potranno permettere di comprendere meglio a livello molecolare fenomeni legati all’area psico sensoriale che ad oggi vengono principalmente valutati tramite registrazione delle risposte del sistema nervoso autonomo e cardiovascolare.
69
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