Risultati dell'identificazione fenotipica e molecolare dei ceppi isolati

Capitolo 5 Risultati e discussione

5.4 Risultati dell'identificazione fenotipica e molecolare dei ceppi isolati

Al fine di ottenere un risultato quanto più accurato circa le specie che compongono la flora lattica dei campioni di soppressata analizzati è stata eseguita un'analisi molecolare mediante RAPD-PCR; i ceppi che hanno fornito fingerprinting differenti sono stati successivamente identificati mediante API 50 CH®_{(BioMerieux) e}

sequenziamento. Infatti, seppur l'analisi morfologica e biochimica forniscano dei risultati ragionevoli, non sono tecniche sempre affidabili in quanto l'esistenza di alcune sovrapposizioni nelle caratteristiche metaboliche, soprattutto tra i lattobacilli eterofermentanti ed i generi Leuconostoc e Weissella, ne rende difficile la differenziazione (Daneysa et al., 2015).

I risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella.

Ceppo Risultato API Risultato sequenziamento

4 Lb. buchneri 99,9 % Lactobacillus parabuchneri

5 Lactococcus lactis 77,8 % Identificazione in corso

7 Lb. buchneri 99,9 % Lactobacillus parabuchneri

9 Lb. buchneri 99,9 % Lactobacillus parabuchneri

L. mesenteroides spp mesenteroides/

dextranicum 94% Lactobacillus sakei

11 A Weissella viridans 95% Weissella viridans

11 B

L. mesenteroides spp mesenteroides/

dextranicum 94% Lactobacillus sakei

12 L. mesenteroides 94% Lactobacillus sakei

18 Lb. curvatus 97,5 % -

20 L. mesenteroides 99,9% L. mesenteroides

31 L. mesenteroides 94% Lactobacillus sakei

35 Lb. delbrueckii spp. delbrueckii 97,4% Weissella viridans 80 Lb. delbrueckii spp. delbrueckii 93,4% Lactobacillus sakei

81 L. mesenteroides 94% Lactobacillus sakei

L. mesenteroides spp mesenteroides/

dextranicum 94% Lactobacillus sakei

83 L. mesenteroides 94,5 % Lactobacillus sakei

85 L. mesenteroides 99,9% L. mesenteroides 86 L. mesenteroides spp mesenteroides/ dextranicum 99,9% L. mesenteroides 92 L. mesenteroides 99,9% L. mesenteroides 95 L. mesenteroides 99,9% L. mesenteroides

101 L. mesenteroides 99,7% Identificazione in corso

103 L.mesenteroides 99,9% L. mesenteroides

106 Lb. salivarius 99,6% Identificazione in corso

108 Brochothrix thermosphacta 98,2% Identificazione in corso 109 Brochothrix thermosphacta 98,2% Identificazione in corso

113 L. mesenteroides 94% Lactobacillus sakei

121 Lb. salivarius 99,9% -

Tabella 10Risultati dell'identificazione fenotipica e molecolare dei ceppi che mostravano diverso profilo RAPD-PCR.

Figura 5Corsa elettroforetica dei ceppi amplificati mediante RAPD-PCR in gel di agarosio al 2%. Sono evidenti due diversi profili.

In alcuni casi si è avuta discordanza tra i risultati dei test API e i risultati del sequenziamento. Tale discordanza è dovuta ad un limite del software utilizzato per l'analisi dei profili biochimici (APIweb™) il quale non permette l'identificazione di Lactobacillus sakei che viene identificato come Leuconostoc mesenteroides (Vermeiren et al., 2004). Al fine di verificare l'appartenenza di questi ceppi ad una delle due specie è stata valutata la fermentazione dei carboidrati la quale ha permesso di identificare i ceppi dubbi come Lactobacillus sakei in accordo a quanto osservato da McLeod et al (2008).

La prevalenza delle diverse specie isolate nelle tre diverse fasi del periodo di conservazione del prodotto (fase iniziale, fase stazionaria e in corrispondenza della data di scadenza) sono riassunte nei grafici sottostanti.

Al fine di avere un quadro più completo della composizione della flora lattica nella fase iniziale del periodo di conservazione è stata effettuata l'identificazione dei ceppi isolati nei primi 22 giorni di conservazione (tempo 0, tempo 2 e tempo 3). Le cariche microbiche rilevate nei 3 diversi tempi di analisi sono state sommate in modo da poter calcolare la prevalenza di ciascuna specie isolata sul totale della flora lattica iniziale. L'identificazione ha permesso di individuare tre principali specie quali Lactobacillus sakei (61%), Weissella viridescens (34%) e Leuconostoc mesenteroides (5%); è stata inoltre rilevata la presenza di Lactobacillus parabuchneri e Lactococcus lactis in cariche non significative (< 0,02%). Raggiunta la fase stazionaria la popolazione di LAB è risultata essere costituita prevalentemente da due sole specie: Lactobacillus sakei (57,4%) e Leuconostoc mesenteroides (42,6 %). Infine, al termine del periodo di conservazione, Leuconostoc mesenteroides risultava la specie predominante (69,2%) rispetto alle altre due specie identificate: Lactobacillus sakei (17, 9%) e Lactobacillus salivarius (10,6%). In questa fase, a causa della mancata

concordanza tra i risultati dell'analisi fenotipica e quelli dell'analisi genotipica non è stato possibile identificare il 2,3% della flora lattica restante.

Le specie isolate rientrano tra quelle spesso responsabili di alterazione dei prodotti carnei cotti secondo quanto dimostrato in molti studi (Deneysa et al., 2015; Hu et al.,2009; Yoshikatsu 2003; Barakat et al., 2000; Björkroth et al., 1998; Björkroth et al., 1997; Korkeala et al., 1997; Borch et al., 1996; Nerbrink et al., 1993; Blickstad et al., 1983;). Infatti, nonostante i LAB siano ampiamente utilizzati nei prodotti fermentati in relazione al loro ruolo protecnologico, possono essere causa di alterazioni in altri prodotti. La prevalenza di un'attività, protecnologica o alterante, sull'altra è determinata da una serie di fattori ecofisiologici. In particolare: condizioni di microaerofilia, elevata disponibilità di nutrienti e basse temperature di conservazione favoriscono la prevalenza del ruolo alterante (Villani 2011).

Lactobacillus sakei è un batterio eterofermentante facoltativo normalmente presente all'interno della microflora caratterizzante molti prodotti carnei. Insieme a Leuconostoc mesenteroides, è considerato la principale causa di spoilage nei prodotti carnei cotti confezionati sottovuoto (Hu et al., 2009). Essi contribuiscono, infatti, alla formazione dello slime superficiale poiché sono in grado di produrre EPS (esopolisaccaridi) (Cantoni 2008) e, attraverso la fermentazione degli zuccheri e la degradazione degli aminoacidi, producono composti volatili responsabili di off- flavour (Landgraf, 2008; Silva et al., 2010). Lactobacillus sakei non è un batterio termotollerante per cui ciò conferma che la sua presenza è dovuta ad una ricontaminazione ambientale del prodotto post trattamento termico in accordo a quanto osservato da Lacanin et al (2014), Duskova et al (2015), Duskova et al (2016). Weissella viridescens si riscontra frequentemente nei prodotti carnei cotti nei quali può contribuire al deterioramento a causa del suo metabolismo eterofermentante. Oltre allo slime è causa di inverdimento in quanto produce perossido di idrogeno che

provoca l'ossidazione del nitrosomiocromogeno, pigmento responsabile del colore rosato della carne cotta, conferendo al prodotto a contatto con l'ossigeno colorazione verdastra. Diversi autori hanno osservato una buona tolleranza di questo microrganismo ai processi di cottura dei prodotti carnei (Santos et al., 2005; Peirson et al 2003; Korkeala et al., 1987; Borch et al., 1988) tuttavia, Duskova (2016) ha individuato la presenza di Weissella viridescens sul prodotto in seguito al trattamento termico sebbene risultasse assente nelle materie prime. L'origine di questo microrganismo nei prodotti carnei cotti può quindi essere rappresentata sia dalle materie prime che dall'ambiente di lavorazione. Nei campioni oggetto del presente studio Weissella viridescens è stata isolata solo nella fase iniziale del periodo di conservazione, ciò in accordo alla mancata capacità di crescita di questo microrganismo a temperature inferiori a 15°C che favoriscono invece la selezione di Leuconostoc e L. sakei (Comi e Iacumin 2012) le quali risultano, infatti, le due specie predominanti in fase stazionaria.

La presenza di Lactobacillus parabuchneri e Lactococcus lactis all'inizio del periodo di conservazione non assume significato rilevante nei prodotti carnei. Lactococcus lactis ha un ruolo tecnologico importante nel settore lattiero caseario, ma il suo isolamento in prodotti carnei cotti è esclusivamente indice di contaminazione ambientale (Barakat et al. 2000; Rodriguez et al., 1995).

Leuconostoc mesenteroides è un batterio eterofermentante in grado di crescere anche a temperature di refrigerazione (4°C). E' causa di fenomeni alterativi in diversi prodotti carnei cotti confezionati sotto vuoto quali: bombaggio delle confezioni, dovuto alla produzione di CO2, alterazioni dell'aroma, del colore e formazione di

slime (Chenoll et al., 2003; Samelis et al 2000).

La carica iniziale di Leuconostoc mesenteroides risulta bassa (5%) mentre in fase stazionaria rappresenta il 42 % della popolazione lattica conteggiata e risulta la

specie dominante al termine del periodo di conservazione (70%) in accordo a quanto osservato da Chenoll et al., (2006).

La dominanza di Leuconostoc mesenteroides all'interno dei prodotti carnei confezionati sottovuoto può essere spiegata dalla maggiore rapida crescita di questa specie (Vasilopoulos et al.,2010; Audenaert et al., 2010; Leroy et al., 2009; Vermeiren et al., 2005; Hamasaki et al., 2003) e dalla capacità di produrre sostanze antagoniste nei confronti di altri LAB (Yost e Nattress; 2002).

Leuconostoc mesenteroides presenta bassa resistenza ai trattamenti termici per cui, anche in questo caso, la sua presenza è indice di contaminazione ambientale (Franz e Holy 1998; Samelis et al., 1998).

In conclusione, sebbene i microrganismi identificati presentino un ruolo alterante nei prodotti carnei cotti e le concentrazioni di LAB rilevate siano tali da poter determinare un grave deterioramento del prodotto contaminato, (Duskova et al., 2016; Kreyenschmidt et al., 2010; Korkeala 1987) al termine della shelf-life dei campioni oggetto di studio non è stata osservata nessuna alterazione visibile. La mancata osservazione di un deterioramento visibile dei campioni potrebbe essere dovuta al ritardo nella comparsa di tali alterazioni sensoriali nel prodotto contaminato rispetto alla fase di crescita stazionaria dei LAB presenti (Korkeala et al 1996).

64 Conclusioni

I prodotti oggetto di studio sono prodotti carnei cotti per cui la presenza di alcune popolazioni batteriche, non termoresistenti, deve essere attribuita ad una ricontaminazione ambientale del prodotto che avviene durante le operazioni di manipolazione post-cottura.

In accordo a quanto osservato in diversi studi (Holley 1997; Samelis et al., 2000) l'entità della carica contaminante varia tra 0,5 e 2 log 10 ufc/g ed essa è rappresentata principalmente da LAB la cui crescita nei campioni oggetto di studio è favorita, nel corso della shelf-life, dalle condizioni di conservazione ed infatti aumenta di circa 5 log10 ufc/g.

L'analisi della flora lattica ha permesso di individuare la presenza di 2 principali specie quali Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus sakei e di Weissella viriscens presente soltanto nella fase iniziale di conservazione. Tra le specie isolate Leuconostoc mesenteroides risulta essere la specie predominante nel corso della conservazione dei campioni in accordo a quanto osservato da Vasilopoulos et al.,2010; Audenaert et al., 2010; Leroy et al., 2009; Hu et al., 2009; Vermeiren et al., 2005; Hamasaki et al., 2003.

Le specie isolate rientrano tra quelle che più di frequente sono causa di spoilage nei prodotti carnei cotti in relazione alla loro capacità di produrre EPS, composti volatili responsabili di off-flavour, slime, alterazioni del colore e bombaggio delle confezioni. Tuttavia, sebbene i microrganismi isolati presentino un ruolo alterante e le concentrazioni rilevate siano tali da poter determinare un grave deterioramento del prodotto, al termine del periodo di conservazione non è stata rilevata nessuna alterazione visibile. La mancata osservazione di alterazione visibile può però essere

dovuta al fatto che esse compaiono in ritardo rispetto alla fase di crescita stazionaria dei LAB (Korkeala et al., 1996).

Le informazioni relative alla composizione della flora lattica presente possono rivelarsi utili nell'ottica della realizzazione di colture bioprotettive da impiegare nei prodotti carnei cotti in alternativa agli additivi tradizionali. Negli ultimi anni, infatti, ha acquisito sempre maggior affermazione l'impiego dei LAB e/o metaboliti da essi prodotti come bioconservanti in diversi alimenti. Il ruolo bioprotettivo dei LAB è attribuito, in particolare, alla capacità di alcuni ceppi di produrre batteriocine; per esempio diversi studi hanno evidenziato la capacità di Leuconostoc carnosus ceppo 4010 di produrre leucocina A e leucocina C, molecole con attività anti-Listeria (Budde et al., 2003; Jacobsen et al.,2003) per cui, futuri studi sui ceppi isolati potrebbero essere mirati a valutarne la produzione di queste sostanze ad azione antimicrobica. Il ruolo bioprotettivo dei LAB non è però attribuito esclusivamente alla produzione di batteriocine, infatti, alcuni studi hanno dimostrato che ceppi non produttori sono comunque in grado di controllare la crescita microbica nei prodotti alimentari, in particolare nei prodotti carnei cotti, confezionati in condizioni di anaerobiosi e conservati a temperatura di refrigerazione (Vermeiren et., 2006a; Vermeiren et al ., 2006b; Amezquita e Brashears, 2002; Bredholt et al., 2001; Bredholt et al., 1999; Kotzekidou e Bloukas, 1998; Kotzekidou e Bloukas, 1996). Gli studi relativi all'azione di inibizione dei ceppi non produttori di batteriocine sono rivolti soprattutto a valutarne il ruolo di contenimento nei confronti di Listeria monocytogenes, mentre sono ancora limitati gli studi volti alla produzione di colture di LAB in grado di controllare la flora microbica contaminante (Metaxopoulos et al., 2002; Leisner et al.,1996).

La valutazione dell'attività anti-Listeria di ceppi isolati potrebbe essere effettuata mediante agar spot test. L'agar spot test permetterebbe infatti di individuare i ceppi

aventi attività inibente che potrebbero essere testati singolarmente o in combinazione tra loro, al fine di verificare, mediante inoculo in una matrice alimentare, l'effetto inibente sul prodotto in condizioni di conservazione reali. Inoltre, ulteriori indagini potrebbero essere condotte al fine di individuare i meccanismi attraverso i quali si esplica l'attività inibente dei ceppi isolati che, come detto in precedenza, oltre alla produzione di batteriocine può essere dovuta alla competizione per i nutrienti e alla produzione di metaboliti con effetto antibatterico quali acidi organici, perossido di idrogeno e diacetile come dimostrato in diversi studi (Vermeiren et., 2006a; Vermeiren et al., 2006b; Amezquita e Brashears, 2002; Bredholt et al., 2001; Bredholt et al., 1999; Kotzekidou e Bloukas, 1998; Villegas et al., 1998; Kotzekidou e Bloukas, 1996 ;Holzapfel et al., 1995; Tagg e Ray, 1995; Price e Lee, 1970; Dahiya e Speck, 1967; Whittenbury, 1964).

Infine, nella produzione di una coltura bioprotettiva da impiegare in prodotti carnei cotti deve essere considerato anche che la crescita di LAB potrebbe comportare il deterioramento del prodotto alimentare per cui è necessario valutare anche l'effetto alterante dei ceppi isolati (Vermeiren et al., 2006; Amezquita e Brashears, 2002).

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Nel documento Valutazione di alcuni aspetti microbiologici in prodotti carnei cotti tradizionali (pagine 56-78)