Risultati delle analisi microbiologiche condotte sulla soppressata

I risultati di un durability test per Listeria monocyotgenes effettuato in precedenza dal laboratorio su un lotto di soppressata avevano mostrato che alla fine della shelf life, su 165 unità campionarie analizzate nessuna superava il limite di 100 ufc/g di Listeria monocyotgenes. Nello stesso tempo, la valutazione della concentrazione di

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batteri lattici effettuata in tre diversi tempi mostrava una carica di LAB pari a circa 7 log 10 ufc/g.

L'elevata presenza di LAB aveva portato a ipotizzare un loro potenziale ruolo contenitivo nei confronti della crescita di L. monocytogenes.

Per questo motivo il conteggio dei LAB era stato effettuato in un successivo challenge test condotto su un ulteriore lotto di soppressata. Il challenge test è stato condotto inoculando nella matrice due ceppi di Listeria monocytogenes e due ceppi di Listeria innocua. I risultati ottenuti, mostrati nel grafico sottostante, confermano la crescita dei batteri lattici che raggiungono una concentrazione massima > 8 log10

ufc/g. In concomitanza con la crescita dei batteri lattici si osserva da prima un arresto della crescita della Listeria e successivamente una piccola ripresa della crescita con successiva stabilizzazione di quest'ultima.

Grafico1 Grafico relativo al challenge test condotto su campioni di soppressata. Nel grafico sono indicati gli andamenti delle concentrazioni relative ai LAB, L. innocua ed L. monocytogenes registrate durante lo studio.

Queste osservazioni hanno fatto ipotizzare un'eventuale azione inibitrice esercitata dalla flora lattica nei confronti di Listeria. L'azione antagonista esercitata dai batteri

2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 L o g u fc /g Giorni L.monocytogenes L. innocua LAB

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lattici nei confronti della Listeria è stata dimostrata in molti studi e in diverse matrici alimentari come prodotti ittici, salumi e prodotti lattiero caseari. L' inibizione della crescita di questo patogeno avviene secondo diversi meccanismi riconducibili alle proprietà antagoniste dei batteri lattici. Il primo è l'effetto Jameson secondo il quale la popolazione batterica che per prima raggiunge la fase stazionaria blocca la crescita della popolazione competitor secondo un meccanismo non specifico dovuto alla carenza di nutrienti causata dalla specie numericamente dominante (Delignette- Muller et al., 2006; Giménez and Dalgaard, 2004; Coleman et al., 2003; Jameson 1962; Buchanan e Bagi, 1997). Il secondo meccanismo di inibizione è dovuto all'attività metabolica dei batteri lattici; infatti la produzione di acidi organici (lattico ed acetico) con conseguente riduzione del pH, la produzione di perossido d'idrogeno, di CO2,

diacetile, di enzimi ad attività antimicrobica e batteriocine rendono l'ecosistema alimentare non favorevole per la maggior parte dei microrganismi. La capacità dei batteri lattici di produrre batteriocine, metaboliti secondari di natura proteica con attività antimicrobica nei confronti di batteri tassonomicamente correlati con il ceppo produttore, ha ricevuto particolare attenzione negli ultimi anni in quanto queste molecole sono in grado di inibire la crescita non solo della Listeria, ma di diversi altri patogeni quali: Staphilococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium botulinum; ciò rende possibile l'impiego dei batteri lattici nell'industria alimentare come colture bioprotettive. ( Lucy H. et al., 2006; Chen et Hoover., 2003; Tagg et al., 1976).

Sulla base di questa ipotesi si è proceduto al conteggio e alla determinazione della composizione della flora lattica presente nei campioni di soppressata oggetto di tesi. Allo scopo di completare lo studio inoltre, sono stati rilevati i dati di pH, Aw, carica batterica mesofila totale, Micrococcaceae e coliformi per ogni campione analizzato. I risultati delle analisi microbiologiche sono riportati nella tabella 3.

52 Tabella 5 Risultati delle analisi microbiologiche condotte sui campioni di soppressata.

Legenda: T0: 2 giorni dopo la roduzione; T2: 10 giorni dopo la produzione; T3: 22 giorni dopo la produzione; T4: 29 giorni dopo la produzione; T5: 37 giorni dopo la produzione; T6: 50 giorni dopo la produzione; T7: 63 giorni dopo la produzione (alla scadenza); T8: 71 giorni dopo la produzione.

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Dall'analisi dei risultati si evidenzia, cosi come osservato per il biroldo, che la carica relativa alle popolazioni microbiche Gram-negative (Coliformi ed E.coli) è decisamente più bassa rispetto alla carica in batteri lattici.

Anche in questo caso ciò può essere attribuito al confezionamento sottovuoto dei campioni analizzati e alle proprietà antagoniste dei batteri lattici che, come spiegato in precedenza, ne determinano la dominanza sulle altre specie presenti. Dai risultati indicati in tabella è possibile notare che la carica dei LAB aumenta durante il periodo di conservazione del prodotto di circa 5 log10 ufc/g . Inoltre, in ciascuna sessione di

analisi, essa risulta maggiore rispetto alle cariche raggiunte dalle altre popolazioni microbiche in accordo con quanto osservato da Mellefont et al (2008).

In merito alla CMT si osserva un costante aumento della carica batterica fino al tempo 6 e successivamente una lieve flessione. Alcune colonie isolate dalla CMT sono state sottoposte ad analisi biochimica mediante API 50 CH® _{(BioMerieux) e API STREP}®

(BioMerieux) la quale ha permesso di individuare al tempo 0 la presenza di Bacillus subtilis (4 log10 ufc/g) ed Enterococcus durans (3 log10 ufc/g). Le stesse specie

batteriche insieme a Bacillus pumilis ed Enterococcus faecalis (5 log10 ufc/g) sono

state isolate al termine della shelf-life (tempo 7). La presenza di batteri appartenenti al genere Bacillus può essere ricondotta alla resistenza delle spore al trattamento termico.

In seguito all'isolamento di enterococchi dalla CMT si è deciso, a partire dal tempo 3, di procedere al loro conteggio in ciascuna seduta di analisi. Le cariche ad essi relative si sono rivelate piuttosto altalenanti nel corso della shelf-life. Gli enterococchi sono, tra i batteri non sporigeni, quelli che sopravvivono con più facilità alla cottura dei salumi (Pedrazzini et al., 1995). La loro presenza in numero maggiore di 105 _{ufc/g è}

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l'inacidimento in mortadella, prosciutti cotti e prodotti simili (Vasilopoulos et al., 2010; Chenoll et al., 2007).

Per quanto riguarda le Micrococcaceae si osserva costante crescita della popolazione batterica nel corso della shelf-life le cui concentrazioni variano da circa 1,5 log10 ufc/g

a 6,5 log10 ufc/g. Alcune colonie isolate da terreno Baird-Parker Agar sono state

identificate, mediante kit API STAPH® _{(BioMerieux), come Staphylococcus xylosus in}

concentrazione di 3 log10 ufc/g al tempo 0, Staphylococcus xylosus (6 log10 ufc/g) e

Staphylococcus sciuri (5 log10 ufc/g) al tempo 7. Le specie isolate appartengono alla

categoria dei cocchi coagulasi negativi (CNC) di cui fanno parte specie generalmente non patogene, alcune delle quali comunemente presenti nei prodotti carnei. Tra queste Staphylococcus xylosus (Zdolec et al., 2009) ed in cariche inferiori Staphylococcus sciuri (Ravyts et al., 2012) si riscontrano nei prodotti carnei fermentati nei quali contribuiscono alla formazione del sapore e dell' aroma.

Poiché il prodotto oggetto di studio è un insaccato cotto sono necessarie alcune considerazioni. Come già indicato nel capitolo 1 il trattamento termico delle materie prime, che nel caso della soppressata avviene per bollitura, insieme agli additivi utilizzati ed all'ambiente di produzione, gioca un ruolo importante nella selezione delle specie batteriche presenti nel prodotto finito (Comi e Iacumin, 2012).

Inoltre, in seguito al trattamento termico, può verificarsi una contaminazione secondaria dovuta alla manipolazione del prodotto in un ambiente di produzione non sterile (Vasilopoulos et al., 2010). All'uscita dal bollitore, infatti, le materie prime sono triturate manualmente, si procede successivamente all'aggiunta delle spezie all'impasto , all' insaccatura e alla legatura manuale. Queste fasi rappresentano la principale causa di contaminazione del prodotto. Infine la successiva fase di scottatura non garantisce il raggiungimento a cuore del prodotto di una temperatura

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tale da determinare la disattivazione dei microbi contaminanti. Inoltre, i valori dei principali fattori di contenimento microbico (aw e pH) riscontrati nei campioni

oggetto di studio non sono mai tali da impedirne la crescita all'interno del prodotto.

Grafico 2. Valori di pH relativi ai campioni di soppressata rilevati in ciascuna sessione di analisi.

Grafico 3Valori di Aw relativi ai campioni di soppressata rilevati in ciascuna sessione di analisi.

Diversi studi hanno dimostrato che la principale categoria di batteri contaminanti i prodotti carnei cotti è rappresentata dai batteri lattici (Chenoli et al., 2007; Hu et al.,

6,23 6,4 6,19 6,22 6,15 5,94 6,02 5,9 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 2 10 22 29 37 50 63 71

Giorni dalla data di produzione pH pH 0,956 0,959 0,951 0,947 0,949 0,974 0,949 0,956 0,93 0,94 0,95 0,96 0,97 0,98 2 10 22 29 37 50 63 71 aw Aw

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2009 Korkeala et al., 1997; Vasilopoulos et al., 2009; Bjorkroth et al., 1998; Samelis et al., 1998). I risultati delle analisi microbiologiche effettuate sui campioni oggetto del presente studio concordano con essi.