Il MPM è un tumore aggressivo, indotto dall’asbesto, che mostra una forte resistenza al trattamento e con una prognosi infausta. Nonostante siano stati condotti numerosi studi nel tentativo di trovare potenziali biomarcatori possibili bersagli di nuove terapie, non sono ancora stati fatti progressi nel migliorare la sopravvivenza media che è di un anno dal momento della diagnosi. Purtroppo non sono ancora disponibili biomarcatori sierici che possano identificare la neoplasia in uno stadio precoce e in grado di aiutare in una diagnosi differenziale. Utilizzando un approccio di tipo proteomico nel laboratorio dove ho condotto il mio lavoro di tesi, sono stati condotti diversi studi atti a ricercare a partire da biopsie tissutali e successivamente nel siero, potenziali biomarcatori di MPM. Utili informazioni possono essere ottenute anche da linee cellulari e dal secretoma ottenuto dal mezzo di coltura non condizionato. Nel mio lavoro di tesi, utilizzando un approccio proteomico, ho condotto un’analisi comparativa del proteoma di due linee cellulari una di MPM (NCI-H2052) e una di controllo (Met-5A) e dei rispettivi secretomi. Gli estratti proteici ottenuti sia dai lisati cellulari che dai corrispondenti mezzi di coltura non condizionati, sono stati separati tramite elettroforesi bidimensionale ad ottenere la mappa proteomica. In Figura 1 è riportata un’immagine rappresentativa del proteoma di proteine cellulari di Met-5A e di NCI-H2052, mentre in Figura 2 i profili proteici ottenuti dai corrispondenti secretomi.
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FIGURA 1. IMMAGINE DEI PROFILI PROTEICI OTTENUTI DALL’ANALISI DEL PROTEOMA DELLE LINEE CELLULARI
MET-5A E NCI-H2052.
FIGURA 2. IMMAGINE DEI PROFILI PROTEICI OTTENUTI DALL’ANALISI DEL SECRETOMA DELLE LINEE CELLULARI
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Le immagini sono state sottoposte ad analisi comparativa utilizzando il programma Samespots, e dal confronto tra controllo e MPM sono emerse differenze di espressione significative per alcuni spots. In Tabella 1 sono riportati il numero degli spots trovati differenzialmente espressi dal confronto dei proteomi cellulari, il livello di significatività indicato dal valore di p (test ANOVA), l’entità di variazione (ratio NCI-H2052/Met-5A) e il valore medio delle densità ottiche ottenuto da tre osservazioni ciascuna condotta in doppio. Analogamente, in Tabella 2 sono riportati i risultati ottenuti dall’analisi comparativa dei secretomi.
TABELLA 1
# ANOVA
(p value) Met-5A (Volume)
NCI-H2052 (Volume) Ratio NCI-H2052/Met-5A 1687 0,00 457600,00 4260000,00 9,31 312 0,01 106200,00 711300,00 6,70 1585 0,00 637500,00 3888000,00 6,10 1603 0,02 296400,00 1737000,00 5,86 532 0,00 102600,00 565100,00 5,51 1184 0,00 1333000,00 7340000,00 5,51 553 0,00 101900,00 545800,00 5,36 1840 0,00 155900,00 810000,00 5,20 1591 0,02 374900,00 1846000,00 4,92 1797 0,00 111200,00 491000,00 4,42 493 0,03 97040,00 352300,00 3,63 658 0,00 139600,00 474300,00 3,40 657 0,00 253500,00 856600,00 3,38 742 0,00 106500,00 358700,00 3,37
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# ANOVA
(p value) Met-5A (Volume)
NCI-H2052 (Volume) Ratio NCI-H2052/Met-5A 497 0,00 270100,00 844100,00 3,13 593 0,00 5197000,00 16230000,00 3,12 647 0,00 114400,00 346900,00 3,03 599 0,00 145600,00 435000,00 2,99 952 0,00 2711000,00 7785000,00 2,87 3441 0,01 366400,00 846200,00 2,31 1484 0,03 708900,00 1608000,00 2,27 507 0,00 2198000,00 4919000,00 2,24 754 0,01 441200,00 983500,00 2,23 TABELLA 2
# Met-5A NCI-H2052 Anova (p)
Ratio NCI-H2052/Met5A 4083 1,87E+05 1,39E+06 0,021441526 7,44 1026 2,78E+04 2,04E+05 0,017131129 7,33 4162 4,66E+04 2,88E+05 0,00658679 6,18 2631 2,58E+04 1,21E+05 0,035405405 4,67 1067 6,65E+04 3,02E+05 0,005179094 4,53 218 1,96E+04 7,49E+04 0,023020171 3,83 267 2,11E+04 8,00E+04 0,029422677 3,79 175 5,85E+04 2,16E+05 0,012736915 3,68 155 7,03E+04 2,58E+05 0,028655048 3,68 1093 3,77E+04 1,38E+05 0,000329863 3,66
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# Met-5A NCI-H2052 Anova (p)
Ratio NCI-H2052/Met5A 891 5,81E+04 2,06E+05 0,020540344 3,54 841 3,71E+05 1,27E+06 0,034379413 3,42 512 8,43E+05 2,87E+06 0,002846293 3,41 100 5,03E+05 1,56E+06 0,018762439 3,09 840 5,07E+05 1,45E+06 0,005435225 2,86 1552 3,53E+06 8,57E+06 0,03493688 2,43 861 3,40E+05 7,47E+05 0,047267987 2,20 944 1,94E+05 4,13E+05 0,000482183 2,13 1058 1,15E+05 2,33E+05 0,009350438 2,03
Sono stati presi in considerazione spots che presentassero fold di incremento o riduzione maggiori o uguali a 2. Con questi valori sono stati riscontrati 23 spots differenzialmente espressi nel proteoma e 19 nel secretoma. Tutti gli spots risultano over espressi nei campioni tumorali rispetto al controllo.
In figura 3 A e B sono riportati gli istogrammi per gli spots di interesse ottenuti dai confronti.
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FIGURA 3A.ISTOGRAMMI PER GLI SPOTS DI INTERESSE OTTENUTI DAL CONFRONTO DEI PROFILI PROTEICI DEL PROTEOMA DELLA LINEA CELLULARE DI MPM E DELLA LINEA DI CONTROLLO.
FIGURA 3B.ISTOGRAMMI PER GLI SPOTS DI INTERESSE OTTENUTI DAL CONFRONTO DEI PROFILI PROTEICI DEL SECRETOMA DELLA LINEA CELLULARE DI MPM E DELLA LINEA DI CONTROLLO.
Gli spots sono stati quindi tagliati, tripsinizzati e inviati all’analisi di spettrometria di massa presso la Fondazione Santa Lucia, IRCSS, Roma al laboratorio di Proteomica e Metabolomica condotto dal Prof. Andrea Urbani. In Tabella 3 sono riportate le identificazioni per alcuni degli spots inviati all’analisi. In Tabella sono indicati anche il PM della proteina, e alcuni parametri di massa tra cui lo score, il numero di peptidi identificati, che ci danno un’indicazione dell’affidabilità dell’identificazione ottenuta. Al momento, come indicato in Tabella, sette spots proteici sono stati identificati per il proteoma e tre per il secretoma.
73 TABELLA 3 # Protein name Accession Number Mascot score sequence coverage (%) N° matched peptides PM (KDa) Ratio NCI-H2052/ Met-5A PROTEOMA 507 Elongation factor 2 P13639 84 28 6/55 95 2.2 599 NAD-depend ent protein deacetylase sirtuin-1 Q96EB6 120 54 12/52 81 3.0 952 Cytochrome P450 1B1 Q16678 78 46 16/52 60 2.9 1184 Transformin g growth factor beta-1-induc ed transcript 1 protein O43294 64 32 8/32 49 5.5 1484 LDH A chain P00338 142 60 11/31 36 2.3 1687 PRDX-3 mitochondri al P30048 78 27 4/22 27 9.3 1840 Caspase-3 P42574 64 24 5/18 31 5.2 SECRETOMA 4083 Prosaposin P07602 80 26 6/30 58 7.4 512 Sulfhydryl oxidase 1 O00391 82 32 8/36 82 3.4 1552 LDH A chain P00338 92 52 8/31 36 2.4
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Dalle identificazioni ottenute si nota che molte delle proteine che risultano differenzialmente espresse sono coinvolte nella regolazione dello stress ossidativo cellulare. Questo sia per quanto riguarda il proteoma cellulare come peroxiredoxin-3, citocromo P450 1B1, sirtuina 1, che per il secretoma, come sulfidril ossidasi 1 e prosaposina.
Nelle cellule tumorali un alterato bilancio redox, caratterizzato da un incremento nella produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e cambiamenti nella espressione genica dei fattori antiossidanti, sostiene uno stato pro-proliferativo e consente alle cellule tumorali di sfuggire all’apoptosi. L’incremento della produzione di ossidanti origina da molte fonti, tra cui un’alterata struttura e funzione mitocondriale che porta a perdite di elettroni che reagiscono con l'ossigeno molecolare formando radicali superossido. Il principale ossidante mitocondriale coinvolto nel segnale redox è il perossido di idrogeno (H2O2) che
reagisce con accessibili e strutturalmente distinti solventi ad abbassare il pKa dei residui di cisteina sulle proteine bersaglio. È stato visto che l’ossidazione reversibile di cisteine specifiche è in grado di modificare la struttura, la funzione e la distribuzione subcellulare di numerose proteine. Molte proteine che sono regolate attraverso questa via appartengono a chinasi, fosfatasi e fattori di trascrizione che controllano la proliferazione e la sopravvivenza cellulare. Le cellule tumorali sfuggono dalle risposte citotossiche conseguenti a questo stato redox tramite la perdita di geni oncosoppressori e/o up-regulation di enzimi antiossidanti e fattori di risposta allo stress, riuscendo a prosperare in uno stato
pro-ossidante.
I risultati ottenuti nel nostro studio e le alterazioni di espressione di alcune proteine riscontrate, ben si collocano come risultato di una risposta di questo tipo instaurata da parte delle cellule MPM. In particolare noi troviamo alte espressioni di PRX3 con incremento di 9 volte nella sua espressione rispetto al controllo.
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Questa proteina è coinvolta nella risposta adattativa delle cellule tumorali. PRX3, che si trova esclusivamente nella matrice mitocondriale, è un membro della famiglia delle 2-cis perossiredossine (PRX 1-4). 2-cis PRX metabolizzano idroperossidi in un processo a più fasi che coinvolge l'ossidazione di una cisteina perossidata ad acido solfonico (-SOH), formazione di ponti disolfuro con la formazione di PRX-SS-PRX, e successiva riduzione dall’ ossidoreduttasi TRX per rigenerare l’enzima attivo. Un’espressione elevata di PRX3 è legata alla resistenza all'apoptosi e ad una maggiore proliferazione cellulare. PRX3 è sovra-espresso in tumori multipli, e una maggiore espressione può essere correlato a risposte adattive necessarie per mantenere la funzione mitocondriale. Recentemente PRX3 è stato identificato come bersaglio redox-dipendente di chemioterapici in cellule di mesotelioma maligno (MM).
Anche l’elevata attività di enzimi come sirtuina 1 e citocromo P450 1B1 che ritroviamo dall’analisi del proteoma delle NCI-H2052 può essere vista come risposta adattativa per sopravvivere e beneficiare di uno stato pro-ossidativo da parte della cellula tumorale.
Sirtuina 1, ad esempio, è una deacetilasi che partecipa al coordinamento di diverse funzioni cellulari, come il ciclo cellulare, la risposta al danno al DNA, il metobolismo, l’apoptosi e l’autofagia. È in grado inoltre di modulare la funzione della cromatina attraverso la deacetilazione degli istoni e può promuovere alterazioni nella metilazione degli istoni e del DNA, che porta ad una repressione della trascrizione. È in grado di deacetilare una vasta gamma di fattori di trascrizione e co-regolatori, regolando così l'espressione del gene bersaglio positivamente e negativamente.
Questa risposta di adattamento delle cellule tumorali si rispecchia anche nel secretoma dove ritroviamo elevati livelli di due proteine quali sulfidril ossidasi 1 e prosaposina. In particolare quest’ultima presenta un incremento nel secretoma
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delle NCI-H2052 di ben 7 volte rispetto al controllo. Prosaposina, una proteina secreta, è un fattore di crescita pleiotropico. Alte concentrazioni di questa proteina sono state riscontrate in pazienti con cancro della mammella resistenti al trattamento con estrogeni. Da studi condotti su linee cellulari di cancro della mammella sono state ritrovate alte concentrazioni di questa proteina ed è stato visto che la prosaposina è in grado di up-regolare l’espressione del recettore degli estrogeni, la traslocazione nucleare e l'attività trascrizionale attraverso l’inibizione di MAP chinasi.
Infine, con lo scopo di visualizzare le interazioni possibili tra le diverse proteine ritrovate alterate sia nel secretoma che nel proteoma di MPM, abbiamo condotto un’analisi STRING per poter così evidenziare le potenziali vie di segnale coinvolte. In Figura 4 è riportato il network ottenuto che oltre alle nostre proteine coinvolge altri fattori quali FOXO1, FOXO3 e TP53.
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FIGURA 4. NETWORK OTTENUTO DALL’ANALISI STRING CONDOTTA PER EVIDENZIARE POTENZIALI VIE DI SEGNALE CHE COINVOLGANO LE PROTEINE DI INTERESSE.
In conclusione, i risultati ottenuti mostrano incrementi di espressione di proteine che se validati tramite analisi Western Blot utilizzando anticorpi specifici, potrebbero diventare potenziali biomarcatori di MPM (quali prosaponina) utili nella diagnosi e nella scelta della terapia, ma anche nella comprensione dei meccanismi fisiopatologici di questa neoplasia.
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