DISCUSSIONE
DISCUSSIONE
DISCUSSIONE
Stress da radiazione ultravioletta
In questa tesi vengono presentati solamente i risultati degli esperimenti compiuti su piante esposte giornalmente a dosi di UV-B pari a 12 KJ m-2, perché gli effetti di dosi più basse di UV-B sono trascurabili rispetto alle condizioni ambientali delle regioni del Sud America dove questi genotipi di fagiolo sono cresciuti
Parametri di crescita
Le piante cresciute sotto luce bianca (WL) per 16 ore al giorno sono risultate essere dalle 2 alle 4 volte più corte di quelle cresciute sotto luce gialla (LPS) per 16 ore al giorno o sotto luce gialla continua (cLPS), (fig. 20). La lunghezza del primo internodo è stata influenzata significativamente in tutti i genotipi da dosi giornaliere di UV pari a 12 KJ m-2, si è avuto un effetto maggiore con la luce gialla che con la bianca I quattro genotipi hanno mostrato una lunghezza del primo internodo simile quando sono stati sottoposti a trattamento con UV in presenza o di 16 h di luce bianca o di 16 h di luce gialla questi dati rendono improbabile che il fotoriparo dipendente dalla luce blu-UV-A possa influenzare gli effetti degli UV-B sull’allungamento dello stelo. Perciò sembra che l’azione del fotorecettore degli UV-B sia sufficiente per il pieno controllo sull’allungamento dello stelo. L’area
fogliare di tutti i genotipi cresciuti sotto luce bianca è risultata più grande di quella sotto luce gialla o sotto luce gialla continua. Il trattamento con UV-B ha ridotto significativamente l’area fogliare di tutti i genotipi rispetto a le condizioni di luce visibile (Fig. 21). In Tortola ed Orfeo la sensibilità all’energia dell’UV, non è stata influenzata dalla qualità della luce, infatti gli UV-B hanno indotto rispettivamente una riduzione dell’area fogliare del 30-35% e del 20- 23% rispetto a 16 h di WL o 16 h di LPS. Al contrario in Arroz e Pinto la sensibilità agli UV è stata raddoppiata in piante cresciute sotto luce LPS per 16 h (48% della riduzione dell’ area sotto luce LPS e 24% sotto luce WL per Pinto e 30% e 16% per Arroz). L’area fogliare raggiunta alla fine dell’esperimento è il risultato di azioni contrastanti di diversi fotosensori: gli UV-B provocano il decremento dell’area fogliare e promuovono l’effetto dei fotosensori della luce visibile.
Arroz tuscola 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 5 10 15 20 25 controllo UVB n.s. *** *** c m Tortola 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 5 10 15 20 25 n.s. *** * c m Orfeo 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 5 10 15 20 25 n.s. *** *** c m Pinto 114 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 5 10 15 20 25 *** *** n.s. c m
Fig. .20.- Effetti del trattamento con radiazione UVB (12KJm-2/day)
per 16 h al giorno sulla lunghezza del primo internodo di genotipi di fagiolo, cresciuti con un fotoperiodo di 16 h di luce bianca (WL) e 8h di buio, 16 h di luce gialla (LPS) e 8 h di buio, luce gialla continua (cLPS). Valori medi ± 95% CI. Il significato dell’effetto degli UV-B per ognuna delle condizioni di luce è così indicato: *** per P valori<0.001, ** per P valori compresi tra 0.001 e 0.01, * per P valori compresi tra 0.01 e 0.05, n.s. per valori >0.05.(Bonferroni Test)
Arroz tuscola 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 15 30 45 60 75 90 control UVB n.s. * ** c m 2 Tortola 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 50 100 n.s. * * c m 2 Orfeo 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 15 30 45 60 75 90 n.s. n.s. *** c m 2 Pinto 114 16 h WL 16 h LPS cLPS 0 15 30 45 60 75 90 *** ** n.s. c m 2
Fig. 21 - Effetti del trattamento con radiazione UVB (12KJm-2/day)
per 16 h al giorno sull’area fogliare di genotipi di fagiolo, cresciuti con un fotoperiodo di 16 h di luce bianca (WL) e 8h di buio, 16 h di luce gialla (LPS) e 8 h di buio, luce gialla continua (cLPS). Valori medi ± 95% CI. Il significato dell’effetto degli UV-B per ognuna delle condizioni di luce è così indicato: *** per P valori<0.001, ** per P valori compresi tra 0.001 e 0.01, * per P valori compresi tra 0.01 e 0.05, n.s. per valori >0.05. (Bonferroni Test)
contenuto idrico relativo (RWC) e perdita di elettroliti (leakage)
Sia il contenuto idrico relativo che la perdita di elettroliti, sono influenzati significativamente dai trattamenti con UV-B, dai genotipi, e dall’interazione di questi due fattori.
Nessun cambiamento apprezzabile nella perdita di elettroliti e nel contenuto idrico relativo è stato riscontrato rispetto a piante cresciute sotto WL per 16 h al giorno quando le plantule di Tortola, Orfeo e Pinto sono state sottoposte ad un trattamento combinato di WL (16 h) ed UV-B.(Fig. 22).
Arroz Tortola Orfeo Pinto
0 25 50 75 100 16 h WL UV, 12 KJ/d n.s. n.s. n.s. *** L e a k a g e ( % )
Arroz Tortola Orfeo Pinto
0 25 50 75 100 *** n.s. n.s. n.s. R W C ( % )
Fig. 22 - Effetti del trattamento con radiazione UVB (12KJm-2/day)
per 16 h al giorno sul contenuto idrico relativo e sulla perdita di elettroliti da parte delle membrane (Leakage) della lamina fogliare di genotipi di fagiolo, cresciuti con un fotoperiodo di 16 h di luce bianca (WL) e 8h di buio, 16 h di luce gialla (LPS) e 8 h di buio, luce gialla continua (cLPS). Valori medi ± 95% CI. Il significato dell’effetto degli UV-B per ognuna delle condizioni di luce è così indicato: *** per P valori<0.001, ** per P valori compresi tra 0.001 e 0.01, * per P valori compresi tra 0.01 e 0.05, n.s. per valori >0.05. (Bonferroni Test)
Al contrario, in Arroz, la perdita di elettroliti mostra un drammatico aumento di quattro volte (a 97%) ed l’RWC decresce fino ad arrivare a meno del 50%. E’ quindi evidente che Arroz è l'unico genotipo sensibile ai danni cellulari indotti dagli UV-B.
Siccome il danno è stato trovato quando le piante sono state irradiate in presenza di luce bianca, che stimola il fotoriparo, il coinvolgimento dei danni provocati al DNA dagli UV-B è improbabile. Piuttosto i nostri risultati suggeriscono la presenza di stress fotoossidativo al livello delle membrane cellulari
Contenuto di acido abscissico (ABA)
Quando le plantule di fagiolo sono state esposte a luce bianca per 16 ore al giorno integrata da radiazione UV-B, il contenuto fogliare di ABA è aumentato di 2 volte in tutte le varietà (Fig. 23).
Arroz Tortola Orfeo Pinto 0 1000 2000 16 h WL UV, 12 KJ/d n.s. n.s. * *** n g A B A / g D W
Fig. 23 - Effetti del trattamento con radiazione UVB (12KJm-2/day)
per 16 h al giorno sul contenuto di acido abscissico (ABA) della lamina fogliare di genotipi di fagiolo, cresciuti con un fotoperiodo di 16 h di luce bianca (WL) e 8h di buio, 16 h di luce gialla (LPS) e 8 h di buio, luce gialla continua (cLPS). Valori medi ±95% CI. Il significato dell’effetto degli UV-B per ognuna delle condizioni di luce è così indicato: *** per P valori<0.001, ** per P valori compresi tra 0.001 e 0.01, * per P valori compresi tra 0.01 e 0.05, n.s. per valori >0.05 Bonferroni Test)
Orfeo mostra il maggior incremento (+206%) nel livello di ABA mentre Tortola mostra l’incremento più basso (+74%).
Sia gli UV-B che i diversi genotipi influiscono significativamente sul contenuto di ABA nelle foglie di tutti i genotipi.
Discussione
Le risposte morfogeniche delle piante superiori alla radiazione UV-B possono essere il risultato dell’attivazione di vie di segnale fotosensoriali degli UV-B così come la conseguenza di danni al DNA o di stress fotoossidativi (Jansen, 2002). Il ruolo relativo di ciascuna di queste risposte può influenzare fortemente la crescita della pianta, l’architettura e perciò la produttività
In particolare, sono trovate grandi differenze nella sensibilità alla radiazione ultravioletta fra genotipi di fagiolo comunemente coltivati in Sud America (Pinto M.E. et al., 1999))
Per scoprire se le diverse sensibilità alla radiazione UV-B fra genotipi di fagioli sono dovute al fotoriparo indotto dalla luce blu o alle risposte fotomorfogeniche, anch’esse indotte dalla luce, sono state comparate le risposte agli UV-B di piante di fagiolo cresciute sotto luce bianca o sotto luce gialla monocromatica (LPS), in assenza di luce blu.
I nostri risultati dimostrano che la presenza o assenza della luce blu induce un cambiamento della sensibilità alla luce UV solo riguardo all’area fogliare.
Così sembra che l'esposizione alla radiazione UV in presenza di diverse condizioni e qualità di luce influisca in modo diverso sulle caratteristiche morfologiche e biochimiche delle quattro cultivar di fagiolo, suggerendo il coinvolgimento di diverse vie di segnale
Nel caso dell’accumulo di ABA, la risposta agli UV-B è grande ed uniforme in tutte le varietà. La lunghezza del primo internodo arriva ad un valore simile indipendentemente dalla qualità della luce, in tutte le cultivar, quando le piante sono irradiate con radiazione UV-B, mentre gli UV-B inducono una minima espansione fogliare sotto luce gialla continua, in assenza di luce blu. Rilevanti differenze sono trovate fra le varietà in relazione agli effetti degli UV-B sulla permeabilità della membrana.
Il contenuto idrico relativo e la perdita di elettroliti sono significativi solamente in Arroz. Questi risultati suggeriscono che gli UV causano danni marcati solamente alle membrane cellulari nel genotipo Arroz. L'aumento dei livelli di ABA dopo i trattamenti con gli UV-B è proporzionalmente lo stesso in Arroz come le altre varietà.
Anche se, la capacità di sintetizzare rapidamente ABA in risposta allo stress è stata identificata come una caratteristica di resistenza in molti sistemi di pianta (Wilkinson and Davies, 2002) sembra che questo non sia sufficiente per evitare danno alle membrane in Arroz. In conclusione la più grande sensibilità agli UV-B mostrata dalla cv Arroz, può essere attribuita ad un danno fotoossidativi alle membrane.
Chilling
I livelli di ABA fogliare sono rimasti quasi inalterati in tutti i genotipi durante le prime 15 ore di trattamento da freddo, nonostante cominciasse subito a verificarsi una leggera disidratazione in Arroz Tuscola, Orfeo e Tortola e una più marcata in Pinto.
Dopo 15 ore di trattamento Pinto mostrava una riduzione significativa del contenuto idrico relativo (RWC), raggiungendo valori inferiori al 75%, mentre gli altri tre genotipi rimanevano ancora a valori di RWC intorno all’80% (Fig. 24). Pinto ha confermato, così, la sua propensione alla disidratazione, come già ha mostrato durante esperimenti da stress idrico.
Fig. 24 – Contenuto idrico relativo in piantine di fagiolo sottoposte a
60 ore di chilling (4°C) e seguente recupero a 25°C. . I valori sono le medie (±SE) di cinque repliche.
In seguito i livelli di ABA fogliare hanno cominciato ad aumentare e le differenze tra i genotipi sono diventate evidenti. Orfeo e Pinto sembravano in grado di sintetizzare ABA più rapidamente e in modo maggiormente esteso di Arroz e Tortola. Dopo 60 ore di esposizione alle temperature da chilling il contenuto di ABA fogliare in Orfeo e Pinto ha mostrato un incremento di 10 volte maggiore rispetto all’inizio del trattamento di stress, contro un aumento di solo 5-6 volte
in Arroz e Tortola. Dopo 24 ore dal recupero, il contenuto di ABA è sceso velocemente ai livelli iniziali in tutti i genotipi (Fig. 25).
Fig. 25 – Contenuto in acido abscissico nelle foglie di piantine di
fagiolo sottoposte a 60 ore di chilling (4°C) e seguente recupero a 25°C. I valori sono le medie (±SE) di cinque repliche.
Dal momento che l’induzione del chilling ha provocato danni alla membrana cellulare, si è potuto riscontrare una chiara e forte fuoriuscita di elettroliti solo dopo 40 ore di esposizione allo stress da freddo, (Fig. 26), in associazione all’appassimento fogliare che indica un serio danno alla membrana della cellula. Comunque, nel genotipo Pinto, un significativo aumento di fuoriuscita di elettroliti e’ stato evidente dopo già 15 ore. In seguito, dopo 60 ore di chilling, le piante sembravano riprendere l’integrità della membrana cellulare, come indicato dalla diminuzione della perdita di elettroliti dalle foglie. Differenze significative nella perdita di elettroliti sono state riscontrate
solo per Tortola e Pinto, che hanno mostrato i livelli più alti per questo parametro durante il trattamento di stress da freddo dopo 40 e 60 ore.
Fig. 26 – Perdita di elettroliti in piantine di fagiolo sottoposte a 60 ore
di chilling (4°C) e seguente recupero a 25°C. I valori sono le medie (±SE) di cinque repliche.
Per verificare se i quattro genotipi agiscono diversamente in termini di rapida produzione di acido abscissico sotto serie condizioni di stress, i dischi fogliari sono stati sottoposti ad uno shock osmotico incubandoli in una soluzione di mannitolo (Ψπ=-1,6 MPa) per 6 ore a temperatura ambiente (Fig. 27) e a diverse temperature (5°, 15°, 25° e 35°C) per 4 ore (Fig. 28). Tale procedura ha consentito di raccogliere, ogni volta, tessuti fogliari sottoposti allo stesso grado di deficit idrico. I risultati riportati in fig. 24 confermano che Pinto ed Orfeo sono stati i primi e più veloci produttori di ABA e che hanno risposto prontamente allo stress accumulando più alte quantità dell’ormone in confronto ad Arroz Tuscola e Tortola, appena 180 minuti dopo.
Fig. 27 – Produzione di acido abscissico misurata da dischi fogliari
incubati in una soluzione di mannitolo (Ψπ=-1,6 MPa) per 6 ore a temperatura ambiente I dati sono presentati come media ±SD (n=5). Sono state riportate differenze significative per P<0.05 (*), quando la media è stata separata tramite LSD test (n=5)
I risultati in fig. 25 mostrano come Pinto ed Orfeo sono produttori più veloci di ABA rispetto ad Arroz Tuscola e Tortola, si vede infatti come già dopo 2 ore a 35°C la produzione di ABA per queste due varietà sia circa il doppio rispetto alle altre due (valori medi: 371, 436 ng/ g DW per Arroz e Tortola rispettivamente e 790, 919 ng/ g DW per Orfeo e Pinto). Dopo 4 ore a 25°C Orfeo e Pinto hanno dei valori più alti rispetto alle altre due varietà. A 35°C dopo 4 ore la produzione di ABA arriva quasi a 2000 ng/ g DW per tutti i genotipi tranne che in Arroz che ha una produzione nettamente più bassa rispetto agli altri (700 ng/ g DW)
Fig. 28 – Variazioni nei livelli di ABA in dischi delle prime foglie di
piantine di fagiolo di quattro genotipi sudamericani, incubati in una soluzione di mannitolo (Ψπ=-1,6 MPa) a 5°, 15°, 25° e 35°C. I valori sono le medie (±SE) di cinque repliche
discussione
Nelle piante sensibili al chilling il fenomeno della disidratazione fogliare è uno dei primi sintomi di danno da freddo, è dovuto principalmente alla diminuzione dell’assorbimento di acqua alla radice (Vernieri et al., 2001) e alla conseguente perdita per traspirazione fogliare dovuta alla perdita di controllo stomatico (tomato, Bloom et al., 2004; fagiolo, Paradossi et al., 1992). In più la
risposta sembra essere genotipo-correlata all’interno della specie (Bloom et al., 2004; Cabuslay et al., 2002). I nostri dati hanno confermato una forte risposta genotipo-correlata al gelo nelle piantine di fagiolo, una specie sensibile al gelo, poiché solo un genotipo (Pinto) ha mostrato una marcata perdita di acqua dai tessuti fogliari dopo 15 ore di chilling, mentre gli altri tre (Arroz Tuscola, Orfeo e Tortola) hanno mantenuto contenuti d’acqua più alti per un periodo più lungo. Il trattamento con il freddo di alcune piante sensibili al chilling accelera anche l’efflusso di elettroliti in proporzione alla sensibilità al freddo della pianta, alla durata e alla temperatura del trattamento (Lukatkin, 2003). Il danno alla membrana cellulare è riscontarbile solo se il chilling è associato a deficit idrico (Pardossi et al., 1992) Tutti i genotipi di fagiolo hanno mostrato una massiccia fuoriuscita di elettroliti dopo 40 ore, proprio in seguito all’inizio della disidratazione, ma Pinto ha iniziato a mostrare danni da chilling alle membrane cellulari solo dopo 15 ore, denotando un livello più basso di tolleranza. In seguito (60 ore di chilling) le piante hanno recuperato l’integrità della membrana cellulare. Tale fatto era probabilmente dovuto ad un restaurato equilibrio idrico nei tessuti fogliari durante il periodo di chilling in seguito ad una aumentata biosintesi di ABA (Vernieri et al., 2001). Di fatto, nelle nostre condizioni, i livelli di ABA fogliare sono restati quasi inalterati in tutti i genotipi durante le prime 15 ore di chilling, nonostante cominciasse verificarsi una leggera (Arroz, Orfeo, Tortola) o seria disidratazione (Pinto), ma enormemente aumentata fino a 60 ore di chilling. Tale situazione pare essere in armonia con precedenti osservazioni su piantine di fagiolo esposte a basse temperature (Vernieri et al., 1991)ed è probabilmente dovuta all’effetto nocivo del freddo sulla sintesi di ABA, che di conseguenza interessa la chiusura stomatica ed il contenuto idrico
della foglia. I cambiamenti nel contenuto fogliare potrebbero indicare una diversa capacità a reagire agli stress ambientali che interessano lo stato idrico della pianta, come siccità a o basse temperature. Al momento, comunque dai nostri esperimenti non è risultata alcuna indicazione di differenze sostanziali di sensibilità allo stress tra i quattro genotipi. Nondimeno, la capacità di sintetizzare rapidamente ABA in risposta ad una situazione di stress è stata ritenuta una caratteristica di resistenza in molti sistemi di piante (Rigby et al., 1994). Nel nostro caso Pinto ed Orfeo mostravano una veloce produzione di ABA. Tale comportamento suggerisce che in Pinto, che sembra essere assai sensibile alla disidratazione fogliare, gli stomi potrebbero essere meno sensibili alla produzione di ABA che in altri genotipi.
CAPITOLO 5: CONCLUSIONI
Il presente lavoro di tesi si inserisce in un progetto di ricerca finanziato dalla Comunità Europea, che si propone di studiare le risposte a stress idrici, termici e luminosi in genotipi di fagiolo di origine sudamericana. Il compito del partner italiano nell’ambito di tale progetto è quello di approfondire lo studio delle risposte allo stress idrico ed alle basse temperature ed alle loro combinazioni con alte dosi di UV.
Stress da radiazione ultravioletta
La radiazione ultravioletta sommata a 16 ore di luce bianca (WL) ha indotto in tutti i genotipi un modello di risposta simile per l’inibizione dell’allungamento del gambo, l’inibizione dell’espansione fogliare ed l’aumento dei livelli di ABA.
Il contenuto idrico relativo e la perdita di elettroliti sono significativi solamente in Arroz. L’RWC è diminuito e l’electrolyte leakage è fortemente aumentata Questi risultati suggeriscono che gli UV causano danni marcati solamente alle membrane cellulari nel genotipo Arroz.
D’altra parte i nostri risultati indicano che l’energia ultravioletta influisce in maniera diversa sulle caratteristiche morfologiche e biochimiche delle quattro cultivar di fagiolo, suggerendo il coinvolgimento di vie di segnale multiple. Per determinare se le diverse sensibilità dei quattro genotipi alla radiazione ultravioletta sono dovute a differenze nel fotoriparo indotto dalla luce blu o alle risposte fotomorfogeniche, anch’esse indotte dalla luce blu, le piante
sono state fatte crescere sotto 16 ore di luce bianca o sotto luce gialla monocromatica (LPS), in assenza di luce blu, e sono state sottoposte a radiazione UV
Chilling
I risultati ottenuti dimostrano che tra i genotipi esaminati, Tortola sembra quello più sensibile al chilling a livello di stabilità della membrana, come dimostrato dalla misurazione della perdita di elettroliti. Al contrario, Orfeo mostra la più alta resistenza, sia in termini di mantenimento del contenuto idrico, che di stabilità delle membrane (almeno fino alle 48 ore di trattamento). I livelli di ABA nelle foglie rimangono quasi invariati durante le prime 15 ore nonostante le piantine mostrino segni di disidratazione.
Successivamente, i livelli di ABA iniziano ad alzarsi e incominciano ad evidenziarsi differenze fra i genotipi: benché in Arroz Tuscola e in Tortola il contenuto ABA nei campioni aumenta notevolmente, in Orfeo e Pinto 114 l’incremento è meno accentuato. Questo comportamento appare in contrasto con la risposta avuta nell’esperimento con il mannitolo, dove Orfeo e Pinto 114 sono stati più efficienti nella sintesi di ABA rispetto ad Arroz Tuscola e Tortola, ciò può indicare che la capacità di sintetizzare prontamente ABA sia strettamente legata alla temperatura. D’altro canto Orfeo è il genotipo che subisce la minor disidratazione mostrando anche alla fine dell’esperimento un contenuto idrico maggiore. Il fatto che Orfeo risenta meno dello stress da basse temperature è confermato anche dal basso accumulo di ABA.
Pinto 114, in effetti, mostra i valori di RWC vicini a quelli di Arroz Tuscola e Tortola, nonostante abbia un aspetto più turgido rispetto alle
altre due varietà. In Pinto 114 la mancanza di un accumulo di ABA dopo 48 ore di chilling potrebbe essere dovuto per tanto ad un minore sbilancio nel contenuto idrico.
Orfeo e Pinto 114 sono più rapidi produttori di ABA rispetto ad Arroz Tuscola e Tortola a tutte le temperature analizzate; fra Arroz Tuscola e Tortola, quest’ultimo è comunque in grado di sintetizzare una quantità più elevata di ormone .
CAPITOLO 6: BIBLIOGRAFIA
CAPITOLO 6: BIBLIOGRAFIA
CAPITOLO 6: BIBLIOGRAFIA
CAPITOLO 6: BIBLIOGRAFIA
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