CAPITOLO 2: SCOPO DELLA
CAPITOLO 2: SCOPO DELLA
CAPITOLO 2: SCOPO DELLA
TESI
TESI
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"Poor men’s meat" (la carne degli uomini poveri) è cosi che viene chiamato il comunissimo fagiolo (Phaseolus vulgaris L) dalle popolazioni in via di sviluppo. Per i territori più poveri, infatti, questa coltura, rappresenta un’importante fonte proteica e sono proprio il suo alto contributo nutritivo e il suo breve ciclo di crescita a fare di questa leguminosa la coltura più importante di questi paesi.
II Sud America ha cominciato la coltivazione del fagiolo (Phaseolus vulgaris L.) 7000 anni fa ed oggi fornisce circa la metà della produzione mondiale. Tuttavia tale coltura risulta molto suscettibile agli stress abiotici ed in particolar modo essa manifesta una forte sensibilità alle alte concentrazioni di raggi ultravioletti e alle basse temperature. Tale problema si accentua considerando che nell’America meridionale la coltivazione del fagiolo viene effettuata su altopiani dove ovviamente l’incidenza della radiazione ultravioletta è elevata e dove si ha normalmente una forte escursione termica associata a lunghi periodi caratterizzati da basse temperature. Per ciò la genetica si è adoperata, negli ultimi anni, per selezionare genotipi sempre più resistenti. Il proposito è, quindi, oltre quello di individuare varietà che abbiano alte produzioni nonostante vari stress ambientali, quello di far sì che, in paesi come Cile, Colombia e Bolivia, dove sempre più frequentemente vengono abbandonate colture storicamente importanti come il fagiolo per sostituirle con piantagioni poco utili dal punto di vista nutrizionale e talvolta addirittura illegali, si diffonda la coltivazione di questi genotipi che assicurano una maggiore resa.
Le prove svolte in questa tesi sono, infatti, rivolte a caratterizzare quattro differenti genotipi, provenienti da selezioni genetiche attuate presso il CIAT (Centro International de Agricoltura Tropical) in Colombia, studiando le loro risposte alle condizioni di chilling e di alta concentrazione di raggi UV-B.
I quattro genotipi presi in esame sono Arroz Tuscola, Tortola, Pinto 114 ed Orfeo.
Per valutare i meccanismi di risposta al chilling dei quattro genotipi e per evidenziare eventuali differenze è stata studiata la variazione del, del contenuto idrico relativo, del potenziale osmotico, e della perdita di elettroliti (leakage) dai tessuti fogliari. Inoltre , sotto condizioni di stress da basse temperature è stata valutata la produzione di acido abscissico per ciascun genotipo.
Nelle piante stressate si registra, infatti, un aumento dell’ormone che è prodotto sia dai germogli, come risposta alla disidratazione, sia nelle radici in seguito ad un mancato assorbimento di acqua dal terreno. L’ABA è il messaggero chimico che induce moltissime delle espressioni di risposta allo stress, quali la chiusura degli stomi, l’arresto della crescita della parte aerea della pianta, la sintesi di proteine da stress
Per mettere in evidenza le differenze nelle risposte ad un eccesso di irradiazione di luce ultravioletta nei genotipi sono state analizzate la variazione del contenuto idrico relativo, del potenziale osmotico, la perdita di elettroliti e la produzione di ABA. Inoltre, per valutare l’effetto morfologico dei raggi ultravioletti sulle piantine, sono state misurate anche la lunghezza dello stelo tra il primo ed il secondo internodo e l’area fogliare.
Poiché le prove di questa tesi fanno parte di un progetto finanziato dalla comunità europea cui partecipano, oltre all’Università di Pisa,
Università europee (Inghilterra e Germania) e sudamericane (Cile, Bolivia e Colombia) i risultati sono stati confrontati con quelli degli altri membri. Essi hanno proceduto a caratterizzare i diversi genotipi sotto altri aspetti (risposta alle forti intensità luminose, risposta alle alte temperature, capacità produttiva in condizioni di stress, etc), ma hanno, comunque, riscontrato analogie nell’esposizione dei nostri lavori nelle risposte delle piante in considerazione.
CAPITOLO 3: MATERIALI E
CAPITOLO 3: MATERIALI E CAPITOLO 3: MATERIALI E
CAPITOLO 3: MATERIALI E
METODI
METODI
METODI
METODI
Chilling: materiale vegetale
I semi sono stati fatti germinare in vaschette riempite di un mix commerciale di torba/perlite in una camera di crescita a 25°C con un intensità di luce costante (200 µmol*m-2*sec-1 PPFD). Quando le foglie primarie hanno cominciato ad espandersi (8-10 giorni dopo l’emergenza), le piantine sono state trapiantate in vasi riempiti con substrato commerciale (Hawita Flor Spezialsubstrate, Hawita Gruppe GmbH, Vechta, Germany) di 8×8 cm e sono state mantenute in una serra con una temperatura di 28°C di giorno e 16°C di notte, un’illuminazione ed un fotoperido da ambiente naturale, fino a che le foglie primarie si sono sviluppate completamente (4-6 giorni).
Trattamenti di stress: chilling
I trattamenti di stress sono stati effettuati su piantine allo stadio di prime foglie.
Il trattamento di stress da basse temperature è stato effettuato trasferendo le piante in una camera di crescita a 5°C, 60-65% UR, 400 µmol*m-2*sec-1 PPTF per 60 ore con seguente recupero a 25°C, 75% UR, 400 µmol*m-2*sec-1 PPTF per 72 ore. Le piante usate come controllo sono state tenute in camera di crescita alle stesse condizioni delle piante recuperate.
Lo stress osmotico è stato effettuato su dischi fogliari del diametro di 14 mm prelevati da foglie turgide scelte casualmente e tenute per 12 h su carta da filtro umida, in atmosfera satura d’acqua in modo da assicurare la massima idratazione. Successivamente sono stati somministrati due tipi di trattamento:
i dischi sono stati fatti galleggiare in una soluzione di mannitolo (potenziale osmotico = -1,6 MPa) a 5°, 15°, 25° e 35°C e prelevati per l’analisi del contenuto di ABA dopo 2 e 4 ore.
I dischi sono stati incubati in una soluzione di mannitolo (potenziale osmotico = -1,6 MPa) e raccolti per l’analisi dell’ABA in tempi differenti, 0, 30, 60, 120, 180, 240, 360 minuti, dopo l’inizio dello stress
Stress da radiazione UV: Materiale vegetale utilizzato
Giovani piantine di fagiolo comune (Phaseolus vulgaris L., cvs. Arroz Tuscola, Tortola, Orfeo, Pinto 114) sono state cresciute in vasetti riempiti con un substrato commerciale (Hawita Flor Spezialsubstrate, Hawita Gruppe GmbH, Vechta, Germany) in una camera di crescita dove la temperatura è stata regolata a 25°C, l’umidità relativa al 60%, con un fotoperido di 16 ore di luce e 8 di buio e con una radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) di circa 200 µmol m-2 s-1. L’intensità di 200 µmol m-2 s-1 di PAR è stata ottenuta sia grazie ad una sorgente di luce bianca proveniente da tubi fluorescenti Philips 40W/33RS che grazie ad una sorgente di luce gialla monocromatica proveniente da lampade al sodio a bassa pressione (LPS), Philips SOX 180 W. In alcuni esperimenti le piante sono state cresciute sotto luce gialla
monocromatica (cLPS) continua ad una fluenza di circa 200 µmol m-2 s-1.
Trattamenti di stress: UV
I trattamenti con i raggi ultravioletti sono stati iniziati undici giorni dopo la semina quando le plantule hanno iniziato ad espandere le foglie primarie e sono durati sei giorni. La radiazione ultravioletta (un miscuglio di UVA e UVB) è stata irradiata da una serie di tubi fluorescenti Philips TL 12 40 W posizionati a circa 0,5 metri sopra le piante. La sorgente di UV è stata avvolta con un film di cellulosa diacetato presolarizzato per 24 ore con la funzione di filtrare gli UVC. Il filtro di cellulosa diacetato è stato cambiato ad intervalli di 2 giorni. I trattamenti UVB hanno incluso varie dosi di UV quotidiane nell’intervallo compreso tra 0 (controllo), 4 e 12 KJm-2. La radiazione ultravioletta è stata contemporaneamente integrata con radiazione fotosinteticamente attiva per 16 ore al giorno. La PAR è stata misurata per mezzo di un quantum sensor (LI-190S) connesso ad un data logger (LI-1000, Licor Inc., Lincoln, NE).
Parametri di crescita
Alla fine del periodo sperimentale sono state misurate la lunghezza del primo internodo con un righello e l’area fogliare per mezzo di un misuratore di area fogliare (∆T AreaMeter MK2).
Contenuto idrico relativo
Lo stato idrico della pianta è stato stimato tramite misurazioni del contenuto idrico relativo (RWC) di dischi fogliari di 14 mm di diametro prelevati da giovani piante intatte. L’RWC è calcolato in accordo con l’equazione:
RWC = 100 (FW - DW)/(TW – DW),
dove FW è il peso fresco, TW il peso turgido, determinati dopo che i dischi fogliari sono stati fatti galleggiare su acqua distillata a 20°C sotto luce fioca, DW è il peso secco misurato dopo 48 ore di essiccamento in stufa a 75°C.
Fig. 18 –Schema per la procedura della misura del contenuto idrico
relativo della pianta (Da www.plantstress.com)
Misura della perdita di elettroliti (Electrolyte leakage)
La perdita di elettroliti da tessuti fogliari è determinata tramite la misurazione della conducibilità elettrica di acqua distillata (5 ml) in
cui sono stati immersi per un’ora a temperatura ambiente i dischi fogliari.
L’electrolyte leakage è stata espressa come percentuale rispetto agli elettroliti totali misurati dagli stessi dischetti dopo averli congelati, messi in stufa ed agitati di nuovo per un’ora.
Misura del rilascio di elettroliti dai tessuti
Prelievo del tessuto
Immersione in H2O per 1 ora - 20°C Congelamento 1° Misura di EC scongelamento 2° Misura di EC Il valore di rilascio di elettroliti al prelievo è espresso in % sul valore totale dopo congelamento/scongelamento
Immersione in H2O per 1 ora (valore al prelievo)
(valore totale)
Fig. 19 –Schema della procedura per la misura del rilascio di elettroliti
dai tessuti
Contenuto in acido abscissico (ABA)
I dischi fogliari sono stati tagliati, pesati ed immediatamente congelati in azoto liquido, dopo di che sono stati scongelati ed immersi in acqua distillata (rapporto acqua: tessuto 40:1 volume/peso) per 16 ore a 4°C al buio. Il volume di acqua da utilizzare per l’estrazione dei campioni
dipende ovviamente dal contenuto endogeno di ABA ed in genere si usa un rapporto acqua:tessuto da 20:1 a 200:1 (volume:peso). L’obiettivo è quello di ottenere una concentrazione di ABA nell’estratto che sia compreso nel range della curva di taratura (20- 1000 pg ABA/50 µl). Le analisi quantitative sono state effettuate su estratti grezzi acquosi usando la tecnica del radioimmunoassay in fase solida (RIA) basato su un anticorpo monoclonale (DPBA 1) contro (S)-ABA libero(16), la cui accuratezza ed affidabilità con estratti grezzi di tessuti di fagiolo stressati e non stressati sono state preventivamente testate (Vernieri et al., 1989). Ogni campione replicato è stato saggiato in duplicato.
10.1.8 Analisi statistica
E’ stato adottato un modello completamente randomizzato. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte ottenendo risultati simili. Sono stati riportati i dati ottenuti da esperimenti rappresentativi. I dati sono la media (± SE) di 5 repliche. Ogni pianta rappresenta una replica.