Inibizione della fibrillazione hIAPP da parte di Se-PC
Il Thioflavin T (ThT) è il colorante più comunemente usato per la diagnosi di formazione di fibrille amiloidi e l'intensità della fluorescenza potrebbe essere ThT proporzionale al grado di formazione di fibrille amiloidi. Il test della fluorescenza dopo incubazione di 20 hIAPP mm con Se-PC ha dimostrato drasticamente una ridotta intensità di fluorescenza del 58% e 85% alla concentrazione di 2,5 mM e 5 mM Se-PC, rispettivamente, il che implica che Se-PC esercita un inibizione in maniera significativa di hIAPP con formazione fibrille amiloidi in modo dose-dipendente (fig 1A). L'analisi granulometrica ha mostrato che la distribuzione dimensionale in ambito di hIAPP è diminuita da scala micron a scala nanometrica dopo l'incubazione con diverse concentrazioni di Se-PC e maggiore
concentrazione di Se-PC corrisponde alla portata distribuzione delle dimensioni inferiori (fig 1B). Le dimensioni sono distribuitie principalmente tra 300 nm e 900 nm a hIAPP: Se- PC ¼ 2: 1 (hIAPP 10 mm, Se-PC 5 mm) e 150e400 nm a hIAPP: Se ¼ 1: 1 (hIAPP 10 mm, Se-PC 10 mm) picchi a rispettivamente circa 500 nm e 250 nm. Il test ThT della
65 hIAPP per formare particelle su scala nanometrica. Lo spettro del dicroismo circolare (CD) è stato analizzato per verificare la conformazione influenzata da Se-PC hIAPP.
[Fig.1]
Lo spettro del dicroismo circolare (CD) è stato analizzato per verificare la conformazione influenzata da Se-PC hIAPP. Come mostrato, hIAPP esisteva con la struttura b-sheet dopo 48 ore di incubazione la struttura secondaria di hIAPP è stata appena mutata come co- trattamento con Se-PC, il che implica che Se-PC non cambia la conformazione di hIAPP (fig 1C). In considerazione della capacità di inibizione della fibrillazione Se-PC su hIAPP, possiamo dedurre che Se-PC può influenzare l'aggregazione di hIAPP interferendo con la combinazione tra peptide piuttosto che alterare la struttura secondaria.
Inoltre, per visualizzare intuitivamente l'effetto di Se-PC sulla morfologia di hIAPP, sono state eseguite la microscopie a forza atomica (AFM) e la trasmissione microscopia
elettronica (TEM). Come mostrato nelle immagini AFM, hIAPP tendevano a formare fibrille su solo incubazione (fig. 1D). Mentre oligomeri nanoscala si sono formati dopo l'interferenza di Se-PC. 1AD digitalmente ha confrontato i profili insieme a Linea I, II e III di fibrille lineari e granulari oligomeri hIAPP con diversi livelli di aggregazione.
Le hIAPP incubate hanno una formato fibrilla lineare relativamente liscia in linea I, mentre su scala nanometrica gli oligomeri sono stati generati con la dimensione di circa 500 nm quando trattati con 5 mM Se-PC (linea II), che era coerente con il risultato di un'analisi granulometrica. Inoltre, oligomeri hIAPP erano inclini a assemblarsi in aggregati più
66 grandi (Linea III). Le immagini TEM di approfondimento rivelano un processo di
aggregazione dipendente al tempo con grado di aggregazione incrementale. La dimensione degli aggregati hIAPP crescono con il tempo e con il formato nanoparticelle in presenza di Se-PC. Secondo il processo di aggregazione, esposto il processo di interazione ipotetica di hIAPP e Se-PC hIAPP il processo è interrotto da Se-PC. Questi risultati suggeriscono che la formazione di fibrille hIAPP è trattenuto da Se-PC a formare nanoparticelle.
[Fig.2] Riduzione dell'apoptosi delle cellulegrazie aSe-PC
67 Con Se-PC si inibisce la fibrillazione di hIAPP e si induce la formazione di particelle nanometriche, per studiare questi effetti sono stati condotti esperimenti in vitro di Se-PC che induce un cambio morfologico di hIAPP su INS-1 le cellule. Dal saggio MTT, abbiamo scoperto che la citotossicità hIAPP-indotta è stata attenuata dalla Se-PC dose- dipendente (fig 3A). In accordo con i risultati MTT, il diminuito rilascio di LDH a causa dell'aggiunta di Se-PC ha ulteriormente convalidato la debole citotossicita' di Hiapp. Questi risultati indicano che Se-PC ha efficacemente inibito la morte delle cellule beta indotta da hIAPP. L'apoptosi, un modo attivo di morte cellulare, svolge un ruolo essenziale nello sviluppo degli organismi pluricellulari. Per studiare il meccanismo protettivo di Se- PC hIAPP che induce citotossicità,è stato impiegato il flusso citometrico per esaminare l'apoptosi delle cellule. Nella frammentazione del DNA, una delle caratteristiche di
apoptosi, è stata valutata analizzando sub-G1 DNA nelle cellule ioduro marcate di propidio. Come illustrata in Fig. 3C, la popolazione di cellule sub-G1 significativamente aumentata dal 5,1% al 27,5% come INS-1 le cellule sono state trattate con hIAPP per 24 h. I picchi sub-G1 sono diminuiti al 10,4% entro la co-incubazione di hIAPP e Se-PC, il che implica che Se-PC ha inibito nelle cellule hIAPP l'apoptosi indotta. La morte cellulare per apoptosi è stata ulteriormente confermata dalla frammentazione del DNA, il nucleo di
condensazione e la distribuzione del filamento di actina alterato utilizzando TUNEL, DAPI e test falloidina co-colorazione. I nuclei TUNEL-positivi a causa della frammentazione del DNA (verde fluorescenza) sono cresciuti dopo incubazione con hIAPP, che era soppressa dall'esistenza simultanea di Se-PC. La fluorescenza blu di DAPI espone il nucleo di condensazione del ins-1 le cellule trattate con hIAPP. I filamenti di actina sono stati etichettati con falloidina che ha mostrato la morfologica cambiamenti di struttura del citoscheletro (fluorescenza rossa). Le cellule si contraggono bruscamente e disintegrano il citoscheletro a causa della co-coltura con hIAPP, che è stata inibita dalla comparsa di Se- PC. Questi risultati hanno dimostrato che hIAPP causa apoptosi delle cellule e interferisce con la fibrillazione di hIAPP, mentre Se-PC ha mostrato un effetto protettivo nei confronti di l'apoptosi. La Caspasi-3 è un mediatore chiave nella risposta all'apoptosi tra i membri della famiglia caspasi che possono essere attivate e separate durante apoptosi. Poli (ADP- ribosio) polimerasi (PARP) è un downstream enzimatico di caspasi-3 per la riparazione del DNA in risposta allo stress ambientale e la scissione di PARP facilita la separazione cellulare e serve come marcatore biochimico di cellule in fase di apoptosi. Per chiarire i
68 meccanismi molecolari alla base dell'apoptosi delle cellule innescata da hIAPP, abbiamo quindi esaminato l'implicazione di caspasi-3 e PARP nel processo.
[Fig.4]
69 Mediante immunofluorescenza, il dosaggio con anticorpo specifico per c-caspasi-3, la comparsa di fluorescenza verde in cellule trattate indica la notevole attivazione della caspasi-3 suggerendo che caspasi-3 da un contributo all'apoptosi cellulare.
Coerentemente con questo, la determinazione dell'attivita' di caspasi-3 manifesta un significativo aumento di attivazione hIAPP-mediata della caspasi-3, che era inibita da Se- PC. La scissione di PARP sale al 260% (% del controllo) dopo il trattamento con hIAPP per 24 ore, che era dose-dipendente, alleggerito con l'aggiunta di Se-PC. Questi risultati suggeriscono che, la morte cellulare indotta da hIAPP è causata principalmente da apoptosi, e caspasi-3 e PARP svolgono un ruolo importante nel processo di apoptosi.
Abbiamo dimostrato l'effetto protettivo di Se-PC hIAPP in ins- 1 sulle cellule e dedotto che la nanocristallizzazione di hIAPP potrebbe essere responsabile per alleviare la citotossicità. La destabilizzazione della membrana, lo stress ossidativo e l'oligomero solubile interpretano i ruoli chiave. Come mostrato in fig 6A, le cellule di controllo appaiono in buona salute con forma regolare rispetto alle cellule trattate con hIAPP ,in cui il numero di cellule è ridotto e la morfologia cellulare è anormala. Tuttavia, i cambiamenti morfologici e la morte cellulare hIAPP-mediata sono stati rimossi da co-trattamento con Se-PC. Immagini AFM di INS-1 delle cellule espongono chiaramente i dettagli
morfologici sotto l'influenza di hIAPP e Se-PC. Rispetto al controllo cellulare sano e normale, le cellule trattate con hIAPP erano collassate e contratte. Mentre hIAPP provoca danni cellulari, cio è stato impedito da Se-PC. Come mostrato in fig.6Bd, i profili cellulari insieme con linea I, II e III rivelano che la superficie della membrana è avvizzita
dall'aggiunta di hIAPP, ma Se-PC sopprime l'effetto di svalutazione hIAPP e cellule beta sembrano avere una superficie della membrana liscia. Ad ulteriore conferma del danno effetto sulla membrana cellulare,viene preparato un modello lipidosome contenente calceina. La perdita di calceina è stata sospesa a tempo determinato su trattamento con hIAPP al fine di raggiungere un equilibrio e la perdita è stata mitigata da Se-PC. Questi risultati indicano che hIAPP potrebbe danneggiare la membrana e Se-PC potrebbe inibire l’effetto dannoso di hIAPP cambiando la struttura delle fibrille hIAPP.
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L'effetto protettivo di Se-PC riguardo l'apoptosi indotta dai ROS
In generale, l'apoptosi può avvenire attraverso un percorso recettoriale (estrinseca) o per via mitocondriale (intrinseca). I mitocondri svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi delle cellule. Percorsi apoptotici estrinseci e intrinseci possono convergere a livello mitocondriale e innescare la permeabilizzazione della membrana mitocondriale. I mitocondri sono la fonte principale di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la cui sovrapproduzione puo'compromettere ulteriormente il trasporto mitocontriale degli elettroni a causare maggior rilascio di ROS. Per approfondire la comprensione della base biochimica e degli effetti distruttivi di hIAPP che suscitano l'apoptosi delle cellule: fino al 49,5% INS-1 le cellule con mitocondri depolarizzate sono state controllate nei campioni con hIAPP incubata, mentre la percentuale di esaurimento diminuita DJ è al 13,7% con co- trattamento di hIAPP e Se-PC, suggerendo che Se-PC represso mitocondriale hIAPP causato erettile. Nel frattempo, ROS intracellulare è stata misurata mediante marcato con fluoresceina dye, DCFH-DA. Il trattamento con hIAPP aumentata il livello di ROS al 195% delle cellule di controllo, come mostrato da una maggiore intensità di fluorescenza. Co- trattamento con Se-PC abbassato intracellulare ROS dose-dipendente. I risultati sono stati
71 graficamente convalidati dal microscopio a fluorescenza con DCF. In linea con il risultato dell'esame intracellulare, la misurazione extracellulare di generazione di ROS è stato anche comprovato che Se-PC inibito dose dipendentemente la formazione di ROS prodotto durante il processo di hIAPP fibrillazione. Questi risultati connotano che hIAPP da apoptosi e cio'può essere attribuito alla generazione di ROS, che ha causato danni
mitocondri. Inversamente la disfunzione mitocondrialeè aggravata da eccessivo numero di ROS.
[Fig.7a]
Il danno della membrana e la generazione di ROS apparivano essere i possibili fattori di hIAPP citotossicità. Per confermare la ragione per i danni della membrana, sono stati applicati diversi metodi di trattamento nel saggio MTT.
Come mostrato in Fig. 8B, hIAPP e Se-PC sono stati direttamente aggiunti nelle INS-1 le cellule preparate nel gruppo A, ma i campioni di gruppo B sono stati pretrattati nel 37°C per 48 ore hIAPP incubate con INS-1 le cellule visualizzati direttamente in modo
significativo citotossicità. Considerando che, in hIAPP gruppo B ci sono già formate alcune fibrille prima dell'incubazione con INS-1 le cellule e non hanno mostrato citotossicità, questo indica che la specie tossiche erano generate durante il processo di modifica di struttura piuttosto che dalle fibrille stesse. Poi, possiamo dedurre che i ROS prodotta durante hIAPP fibrillazione potrebbero servire come il fattore chiave per il danno cellulare e Se-PC interrotto hIAPP fibrillazione per formare nanoparticelle e prevenire il generazione di ROS, così si è raggiunto l'effetto di protezione cellulare.
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[Fig.7b]
[Fig. 8]