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Ad Aston
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Indice
Introduzione………4
Capitolo 1: Misfolding e meccanismi biochimici
1.1 Malattie PMD………...71.2 Amilina e tossicita' indotta………...8
1.3 Le proprieta' biologiche, biochimiche di aggregazione di IAPP………..9
1.4 Sintesi IAPP, lavorazione e clearence………....11
1.5 Meccanismi di tossicita' indotta IAPP………13
1.6 Rimozione proteine malripiegate………...16
1.7 Aggregazioni IAPP in tessuti non pancreatici………....19
1.8 Osservazioni…...………...19
Capitolo 2: Sintesi dell'insulina e stress reticolare
2.1 Biosintesi della proinsulina………212.2 Ossidoreduttasi PDI………....24
2.3 Piegatura e dimerizzazione………...26
2.4 Proinsulina misfolding………...………....27
2.5 Stress lipotossico………..………..29
2.6 RE stress e rilascio di insulina difettosa………...………..30
2.7 Analisi di rilevazione dell'insulina misfolding………...………32
2.8 Prospettive………...……...33
Capitolo 3: Stress lipotossico del reticolo endoplasmatico
3.1 Cellule beta e l'UPR………...353.2 Il classico UPR………...35
3.3 Stress e omeostasi endoreticolare………...36
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3.5 Meccanismi che collegano lo stress RE all'apoptosi delle cell.beta………..….45
3.6 Lo stress di RE e ubiquitinazione………..….48
3.7 Lo stress di RE e l'autofagia………..….48
3.8 Osservazioni conclusive e prospettive future………...48
Capitolo 4: Mutazioni legate al misfolding
4.1 Mutazioni e sintesi insulina………504.2 Folding insulinico……….…..51
4.3 Meccanismo disulfide paring……….52
4.4 Mutazioni associate al diabete……….…………...55
4.5 Osservazioni conclusive……….………57
Capitolo 5: Selenio prevenzione
5.1 Selenio ficocianina……….…....595.2 Materiali e metodi………...60
5.3 Risultati……….…...64
5.4 Conclusioni………..…...72
Capitolo 6: Il ruolo degli chaperoni
6.1 Caratteristiche patologiche………..………...73 6.2 Materiali e metodi………...74 6.3 Risultati………..………77 6.4 Discussione………..………….…..84 Conclusioni……….…………..88 Elenco abbreviazioni………90 Bibliografia………...………91 Ringraziamenti……….934
Introduzione
Il diabete mellito è una malattia metabolica cronica caratterizzata da livelli di zucchero (glucosio) nel sangue più elevati rispetto alla norma, a causa di
un’inadeguata o assente produzione dell'ormone insulina, cosa che caratterizza le due forme: Diabete di tipo 1 o DM1 e Diabete di tipo 2 o DM2. Il diabete è
costituito da un gruppo di disturbi metabolici accomunati dal fatto di presentare una persistente instabilità del livello glicemico del sangue, passando da condizioni di iperglicemia, più frequente, a condizioni di ipoglicemia. La percentuale di
popolazione mondiale affetta viene stimata intorno al 5%. Circa il 90% della
popolazione diabetica è affetta da DM di tipo 2. In Italia la percentuale di individui affetti da tale patologia è mediamente del 3%. L'OMS stima che ci sarà un
fortissimo incremento di prevalenza di DM, nel 2030 si prevedono piu' di 360 milioni di persone malate. Mentre nel diabete di tipo 1 si ha una predispodizione genetica e una inefficienza cellulare pancreatica fin dalla nascita, nel diabete di tipo 2 si ha una eziologia multifattoriale, in quanto è causato dal concorso di più fattori, sia genetici che ambientali. Il riscontro di DM di tipo 2 è molto spesso casuale nel corso di esami di laboratorio a cui il paziente si sottopone per altri motivi, questo perché la patologia si instaura molto lentamente e occorre molto tempo prima che la sintomatologia possa divenire clinicamente manifesta; d'altro canto in molti pazienti i sintomi di iperglicemia e glicosuria non compaiono mai. Si pensa pertanto che il diabete Tipo 2 sia preceduto da una fase prediabetica, in cui la resistenza dei tessuti periferici all'azione dell'insulina sia compensata da un aumento della secrezione pancreatica di insulina (iperinsulinemia). Soltanto quando si aggravano sia i difetti di secrezione insulinica sia l'insulino-resistenza, per esempio in seguito
all'invecchiamento, alla obesità, all'inattività fisica o alla gravidanza, si renderebbe manifesta prima l'iperglicemia post-prandiale e poi l'iperglicemia a digiuno.
L'insulina è il principale ormone che regola l'ingresso del glucosio dal sangue nelle cellule , il deficit di secrezione insulinica o l'insensibilità alla sua azione sono proprio i due meccanismi principali attraverso cui si espleta la malattia.
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La gran parte dei carboidrati nel cibo viene convertita entro un paio di ore in glucosio. L'insulina è prodotta dalle cellule β del pancreas come esatta risposta all'innalzamento dei livelli di glucosio nel sangue,per esempio dopo un pasto, le cellule β del pancreas sono infatti stimolate dagli alti valori di glicemia e inibite dai valori bassi. Se la disponibilità di insulina è insufficiente, o se le cellule rispondono inadeguatamente ad essa (insulinoresistenza) oppure se l'insulina prodotta è
difettosa, il glucosio non può essere efficacemente utilizzato dal nostro organismo: la conseguenza di ciò è uno stato di carenza di glucosio nei tessuti con elevati valori nel torrente sanguigno. Quando la glicemia a digiuno supera i 126 mg/dl si parla di DM, mentre per valori compresi tra 101 e 125 mg/dl si parla di "alterata glicemia a digiuno", fattore di rischio per la futura comparsa di DM. Il glucosio compare nelle urine (glicosuria) per valori di glicemia maggiori di 180/200 mg/dl. La ridotta capacità dell'insulina di agire in maniera efficace sui tessuti bersaglio (muscoli e fegato) viene chiamata insulinoresistenza. Si tratta di una resistenza "relativa" in quanto livelli sovrafisiologici di insulinemia provocano una normalizzazione della glicemia. Nel momento in cui si instaura una insulino-resistenza si ha inizialmente un aumento compensatorio di secrezione di insulina da parte delle cellule β
pancreatiche, tuttavia la patologia ha un decorso ingravescente che porta a una vera e propria insufficienza dei meccanismi di compenso. Nella patogenesi del
progressivo deficit della secrezione insulinica ha un ruolo determinante il processo di sintesi delle proteine e le eventuali mutazioni dovute al "misfolding", cioè al malripiegamento proteico che fa si che si creino proteine mutanti, le quali
porteranno alla formazione di un ormone deficitario e inutilizzabile, in questo caso di un'insulina difettosa. Altri meccanismi come l'apoptosi della cellule beta, la dislipidemia (lipotossicità) e la iperglicemia cronica (glucotossicità), attraverso meccanismi biochimici complessi, provocano un aumento della produzione di radicali liberi, stress ossidativo, un disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa mitocondriale e alterazioni del reticolo endoplasmatico con stress reticolare. Il DM provoca un aumento di corpi chetonici in circolo, ciò metabolicamente equivale allo sviluppo di una ingannevole condizione di "digiuno cronico": in condizioni di
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digiuno si assiste quindi a un aumento della glicogenolisi (liberazione di riserve glucidiche) e gluconeogenesi (sintesi ex novo di glucosio). Tutto ciò provoca un ulteriore peggioramento dello stato di iperglicemia e del quadro clinico del malato. Cercheremo di analizzare in questo studio le caratteristiche e i meccanismi
biochimici in grado di spiegare l'avanzamento della malattia e eventuali percorsi di prevenzione farmacologica.
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※ Capitolo 1: Misfolding e meccanismi biochimici
1.1 Malattie DMP
La funzione biologica di una proteina dipende dalla sua struttura tridimensionale, che è determinata dalla sua sequenza aminoacidica durante il processo di folding proteico. Il folding proteico nella cellula è un processo strettamente regolato che coinvolge una serie di proteine, dai chaperon molecolari alle proteasi, che assistono il processo di folding e monitorano la qualita' del prodotto finale. Molte malattie hanno mostrato di derivare da misfolding e sono raggruppate sotto il nome di Disordini Conformazionali Proteici o Disturbi di Mal- ripiegamento delle Proteine (DMP). L'evento distintivo nelle DMP è un cambiamento nella struttura secondaria e/o terziaria di una proteina normale senza alterazione della struttura primaria. Il cambiamento conformazionale puo' promuovere la malattia aumentando l'attivita' tossica o causando la mancanza di funzione biologica della proteina nativa. Le DMP comprendono il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) il morbo di
Huntington (HD), la fibrosi cistica, il diabete mellito di tipo 2 (DM2), il morbo di
Parkinson (PD), e molte altre malattie. La prima linea di evidenza che collegava proteine mal-ripiegamente e aggregazioni con la malattia, viene da studi istopatologici postmortem che dimostrano che una tipica caratteristica di queste malattie è l'accumulo di proteine, depositi comprendenti una diversa proteina, come amiloide beta (Ab) e tau nell'Alzheimer, alfa-sinucleina nel Parkinson, poli-Q esteso nella malattia di Huntington, IAPP nel diabete di tipo 2 e proteina prionica (PrP) nelle encefalopatie spongiformi. Forse la prova più convincente per il ruolo chiave delle proteine mal ripiegate proveniva da studi genetici. Mutazioni nei geni che codificano le proteine che prevalentemente comprendono gli aggregati sono stati geneticamente associate a trasmissione ereditaria di molti malripiegamenti proteici. L’eredità di queste mutazioni ha provocato in precedenza l'insorgenza e l’aumento della malattia in casi sporadici e sono stati associati con un più ampio onere agli aggregati proteici. Inoltre, l'espressione transgenica di malattie specifiche nei geni umani che ospitano mutazioni associate ai modelli animali, riprodotti in diverse caratteristiche fenotipiche e patologiche delle malattie da malripiegamento, sostiene che sia fondamentale il contributo degli aggregati proteici in questi malattie. Nel caso delle
8 ripiegati è ben supportato dal fatto che queste malattie possono essere trasmesse da
individuo a individuo da un’unica somministrazione di prione mal-ripiegato di aggregati proteici. Sebbene T2D è spesso considerato una malattia da mal ripiegamento, pochi studi hanno analizzato il coinvolgimento di proteine malripiegate nella patogenesi della malattia. Il tema è stato per lo più trascurato nel campo del diabete, nonostante il fatto che le prove dell'implicazione dell'accumulo di proteine malripiegate in aggregati nella patogenesi del diabete sono comparabili con altri malattie come Alzheimer o Parkinson.
1.2 Amilina e tossicita' indotta
L'amilina umana, o Human Islet Amyloid Precursor Polypeptide (hIAPP), è una proteina altamente conservata costituita da 37 residui aminoacidici e secreta nelle cellule beta del pancreas insieme all'insulina. Prove recenti suggeriscono che la formazione di aggregati tossici dell' amilina potrebbero contribuire alla disfunzione delle cellule beta e alla malattia. L'amilina è prodotta insieme all'insulina e la sua glicazione crea un deposito di sostanza amiloide a livello pancreatico. Essa svolge numerose funzioni:ormonale, controllo esogeno e endogeno del carico dei nutrienti, inibisce la sintesi del glucagone; nel processo di
assorbimento dei carboidrati stimola la sazieta' ed è utile nella regolazione dell'apporto calorico nell'obesita' e in altri disordini alimentari. Sia DM2 che AD sono caratterizzati da aggregati proteici insolubili con conformazione fibrillare. L'aggregazione dell'amilina è associata alla perdita delle cellule beta del pancreas. Anche fattori microambientali quali ioni metallici sono noti interagire con queste molecole amiloidogeniche, rendendole tossiche. Il fenomeno di accumulo IAPP associato con T2D, particolarmente noto negli anziani, è stato descritto nel 1901 come ' isolotto di ialinizzazione'. Tuttavia, il significato clinico di questa osservazione non è stato inteso come isolotto amiloide, non è stato trovato in molti pazienti diabetici e alcuni individui non diabetici manifestavano isolotti amiloidi anche se in quantità molto basse. Recentemente, è stato stabilito che i depositi dell’isolotto amiloide sono presenti in oltre il 90% dei pazienti con T2D. Il fatto che gli aggregati IAPP possono essere osservati negli individui non diabetici è sorprendente se si considera che negli studi di altre malattie di misfolding (come AD o PD) appare chiaro che individui anziani liberi dai sintomi della malattia, che sono nel processo di sviluppare la malattia, possono mostrare una quantità sostanziale di questi aggregati. Diversi studi hanno
9 collegato l'aggregazione IAPP con la perdita e la progressione di beta cell. nel diabete di tipo 2. Studi post-mortem hanno suggerito che gli aggregati IAPP sono associati a perdita di massa a cellule beta. L'aggregazione di IAPP è stato appurato essere una causa
importante di declino della funzione delle cellule beta in isole trapiantate clinicamente. Una mutazione nel gene IAPP che aumenta la propensione dell'aggregazione è associata ad insorgenza precoce di T2D. Studi longitudinali in modelli animali che spontaneamente sviluppano T2D (primati non umani e il gatto domestico) hanno dimostrato che la
formazione di aggregati IAPP precede la disfunzione delle cellule B e i segni clinici della malattia. Infine, topi e ratti transgenici con iperespressione di IAPP umano (hIAPP) hanno spontaneamente sviluppato caratteristiche patologiche di diabete tipo 2. Anche se il collegamento tra aggregazione IAPP e la perdita di cellule B è convincente, la causa e l'origine di aggregazione IAPP e il meccanismo di tossicità è sconosciuto.
1.3 Le proprietà biologiche, biochimiche e di aggregazione di IAPP
La sequenza dell'aminoacido IAPP, soprattutto amino e carbossi terminale, è altamente conservata, suggerendo un ruolo fisiologico importante. Le funzioni che sono state proposte per IAPP includono l'inibizione della secrezione di insulina, ritardo dello
svuotamento gastrico, diminuzione dell'appetito, soppressione del rilascio di glucagone, e la soppressione della genesi dei tumori. Tuttavia, il ruolo esatto della funzione di IAPP e di disfunzione nel diabete non è pienamente compreso. Le proteine amiiloidogeniche / peptidi formano aggregati multimerici secondo un meccanismo di semina-nucleazione. Questo modello può essere suddiviso in due diverse fasi cinetiche: la prima fase è la fase di latenza, in cui il monomero della proteina acquisisce una struttura malripiegata in grado di
associarsi, formando piccoli oligomeri conosciuti come semi o nuclei. La formazione dei semi iniziali è termodinamicamente sfavorevole ed è cineticamente lenta (fattore limitante). I semi formati durante la fase di latenza come modello per il reclutamento di altre proteine monomeriche nella seconda fase, risultano in conseguente crescita esponenziale degli oligomeri, formando un continuo di aggregati più grandi. La propensione di una data proteina a formare aggregati amiloidi dipende dalla sua sequenza, dalla stabilità della conformazione ripiegata, dalla concentrazione di proteine, e dall'interazione con i vari fattori, tra cui altre proteine, membrane, elementi di matrice extracellulare, e altri cofattori. Nel caso di IAPP ci sono alcune evidenze che l'interazione con le membrane intracellulari
10 possono giocare un ruolo nella formazione di oligomeri tossici. Sequenze proteiche
altamente a rischio di formazione amiloide presentano una breve fase di latenza e una grande quantità del monomero incorporata nell'aggregato. Nella nostra esperienza di studio la cinetica di formazione amiloide di molte diverse proteine amiloidi, hIAPP è una delle proteine più amiloidogeniche. Rispetto ad altre proteine associate a PMD come AB o a-sinucleina, gli aggregati IAPP sono molto più veloci a concentrazioni simili, presentando una significativa fase di latenza più breve. Sebbene la sequenza IAPP è generalmente conservata, ci sono alcune differenze critiche interspecie, in particolare nei residui 20-29, che è considerato il dominio responsabile per amiloidogenesi. È interessante notare che, alcune specie note per esprimere una sequenza-amiloide incline di IAPP (compreso l'uomo, primati non umani, e gatti) sono anche le specie conosciute che sviluppano
spontaneamente il DM2. L'isolotto amiloide è stato trovato presente nel 80% dei gatti diabetici e il 100% di macaco mulatto diabetico. Le tre sostituzioni di prolina (la prolina è un noto aminoacido che provoca rottura del foglietto beta) entro la regione amiloidogenica 20-29 nella IAPP del roditore, sostanzialmente riduce la propensione di IAPP a mal-ripiegamenti e aggregati rispetto al hIAPP. DM2 spontaneo non è segnalato nei roditori e nei modelli di roditori che sono spesso usati per riprodurre DM2, con alta percentuale di grassi indotta dalla dieta per indurre a topi diabetici o topi ob / ob, non producono isolotti amiloide. Diversi gruppi hanno sviluppato topi e ratti che esprimono hIAPP (di seguito denominati topi o ratti tg-hIAPP). Anche se alcuni di questi modelli richiedono una condizione prediabetica o una dieta ricca di grassi, sovraesponendo hIAPP portano a formare aggregati tossici conseguenti a perdita b-cell e portando così alla patologia del diabete. Il processo di formazione amiloide produce un equilibrio dinamico di un continuo di aggregati di diverse dimensioni e le proprietà, che vanno dai piccoli oligomeri (dimeri, trimeri, tetrameri, esameri, etc.), a oligormeri piu’grandi ma ancora solubili (contenenti 12-50 unità) a protofibre e a grandi fibrille amiloidi. La natura della struttura più tossica di aggregati IAPP, nonché gli aggregati implicati in altri PMD, non sono del tutto chiari. Qui ci si riferisce a aggregati proteici come miscela eterogenea di polimeri di diverse
dimensioni che probabilmente comprendono le strutture presenti nel tessuto del paziente. Inizialmente si pensava che grandi aggregati fossero strutture piu pertinenti
patologicamente, ma studi recenti hanno fornito una prova convincente per gli oligomeri più piccoli e solubili come l'innesco della malattia da parte di questi agenti.
11 Alcuni ricercatori hanno proposto che la formazione e la deposizione di grandi fibrille amiloidi potrebbe essere un meccanismo di protezione per sequestrare e isolare oligomeri tossici. Anche se questa è un'ipotesi allettante, è probabile che entrambi siano solubili, oligomeri malripiegati e aggregati più grandi; anche quelli depositati nei tessuti possono essere tossici, forse con meccanismi diversi. Inoltre, poiché aggregati proteici sembrano essere strutture dinamiche in equilibrio fra loro, è possibile che i grandi depositi di
amiloide possano servire come un serbatoio per oligomeri tossici più piccoli. Infine, questa volta non possiamo escludere che le strutture più importanti possano essere fuori dal processo della formazione amiloide , come il foglietto beta antiparallelo che identifica oligomeri conosciuti come cylindrins.
[Fig.1]
1.4 Sintesi IAPP, lavorazione e clearence
IAPP è prevalentemente espressa dalle cellule beta come 89-aminoacidi pre-pro-IAPP. Il peptide formato da 22 aminoacidi è scisso fuori nel reticolo endoplasmatico (RE), producendo pro-IAPP, che viene ulteriormente elaborato dall’endoproteasi pro-ormone
12 convertasi (PC) 2, PC1 / 3, e carbossipeptidasi; e arriva alla fine del Golgi e nei granuli secretori in maniera dipendente dal pH. Questi enzimi sono anche responsabili della laborazione della proinsulina. Modificazioni post-traduzionali, compreso ammidazione del terminale COOH e formazione di ponti disolfuro tra residui di 2 e 7, sono i presupposti per la piena attività biologica. L'IAPP trattato rimane immagazzinato con l’insulina secretoria in granuli in un 1-2: rapporto di 50 molare (IAPP: insulina). Insulina e proinsulina
inibiscono l'aggregazione di IAPP. Questi effetti inibitori, insieme con il basso pH nei granuli secretori, mantengono IAPP in uno stato solubile. IAPP è coespresso e conservato con l'insulina da parte delle cellule beta in risposta agli stimoli del glucosio. Tuttavia, in uno stato di elevata richiesta di insulina come la resistenza all'insulina, l'espressione di IAPP aumenta rispetto all' insulina, aumentando la probabilità di formazione di aggregati. A favore di questo punto di vista, topi trasgenici che esprimono livelli relativamente bassi di hIAPP richiedono induzione farmacologica di insulino-resistenza per sviluppare il diabete e isolotti amiloidi. L'evidenza suggerisce che l'oligomerizzazione di IAPP inizia intracellularmente, ma grandi depositi di amiloide vengono accumulate extracellularmente, come in molti altre malattie amiloidi. Oltre alla elevata espressione, l'alterata degradazione può anche contribuire a livelli elevati di IAPP, promuovendo aggregazione. L'enzima della degradazione dell'insulina IDE (insulin degradation enzime), un Zn2 + metalloproteasi coinvolto nella clearance di insulina, puo' anche degradare IAPP. IDE puo' essere identificato come gene di suscettibilità del diabete. L'inibizione farmacologica di IDE ridotta con la degradazione di IAPP nelle cellule RIN-m5F,porta ad una maggiore formazione di aggregati IAPP tossici e citotossicità. Un recente rapporto suggerisce che l'inibizione farmacologica di IDE può ripristinare la tolleranza al glucosio, l'aumento di insulina plasmatica e dei livelli di IAPP in topi obesi. Però, questo modello di topo non esprime l’amiloidogenico IAPP. L'effetto di riduzione genetica o farmacologica di IDE nell'aggregazione di IAPP nei modelli a tg-hIAPP non è stato ancora studiato. Neprilysin (NEP) è un enzima contenente metalloproteasi presente sulla superficie di vari tipi di cellule, comprese le cell beta; esso degrada IAPP e può prevenire la formazione di amiloide. Elevati livelli di NEP sono riscontrati nei topi sovraespressi hIAPP rispetto ai pari età controllati di tipo selvaggio. I risultati accertano che l'aumento prolungato di NEP fa parte di un meccanismo di compensazione finalizzato alla degradazione della IAPP extracellulare e riduce il suo l'accumulo di depositi di amiloide.
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1.5 Meccanismi di tossicità indotta IAPP
[Fig.2]
Parecchi meccanismi sono stati proposti per l'aggregazione mediata IAPP, per la disfunzione delle cellule B e la morte in T2D: la membrana di
permeabilizzazione ,l’iperattivazione di calpaina, l’induzione di stress di RE, la
disregolazione dei processi di clearance, e l’induzione dell’infiammazione. È interessante notare che gli stessi deficit cellulari sono stati descritti in altre patologie PMD, soprattutto quelle che riguardano SNC. Queste prove dimostrano la presenza di aggregati di proteine cellulari nelle disfunzioni del T2D e nelle malattie cerebrali PMD riassunte nella Tabella 1. La disfunzione neuronale e la morte dovuta a malattie specifiche da aggregati proteici sono stati studiate nel particolare. Nelle sezioni seguenti si discute il nostro attuale studio dei meccanismi putativi con cui gli aggregati IAPP possono indurre disfunzione b-cellulare e fornire un confronto con altre proteine mal ripiegate oligomeriche responsabili per la morte neuronale nelle PMD che interessano il sistema nervoso centrale.
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Permeabilizzazione della membrana
È stato suggerito che gli aggregati IAPP potrebbero produrre citotossicità formando pori che permeabilizzano le membrane cellulari, in particolare quelle che comprendono la sintesi proteica e percorsi di secrezione (cioè, il reticolo endoplasmatico, vescicole secretorie, e membrane plasmatiche). È stato riportato che oligomeri IAPP formano strutture porose nella membrana con conseguente fuoriuscita, seguito da disregolazione di Ca2 +,portando a citotossicità. Meccanismi analoghi hanno riportato per Ab, un-sinucleina, e oligomeri PrP. Dati raccolti suggeriscono che gli strati lipidici possono favorire
l'aggregazione IAPP da interazione diretta con fosfolipidi carichi negativamente, come fosfatidil serina, promuovendo l'interazione tra la carica positiva IAPP del monomero con la membrana. Il legame negativamente carico degli eparan-solfato-proteoglicani, presenti sulla superficiale, al terminale N di carica positiva e IAPP pro-IAPP promuove
l'aggregazione del peptide. È interessante notare che un'alta concentrazione di
non-amiloidogenica ratto IAPP ha mostrato di indurre perdite in doppi strati lipidici artificiali. Tuttavia, simili concentrazioni nel ratto IAPP non hanno prodotto tossicità cellulare, ciò indica che il rapporto tra le perdite della membrana e la tossicità non puo’ essere diretto. Da notare che gli studi che utilizzano il doppio strato lipidico potrebbero differire in composizione intracellulare rilevante e nelle membrane plasmatiche, quindi
potenzialmente forniscono intuizioni meccanicistiche ma non imitano l’ambiente complesso intracellulare (ad esempio, le concentrazioni di ioni, altre proteine, cofattori come glicosaminoglicani, pH, accompagnatori, ubiquitinazione). Inoltre, il percorso degli oligomeri tossici su come arrivare a (o come sono formati) vari siti intracellulari è
scarsamente compreso. Forse la cosa più importante nell’ambito dell’insulino-resistenza, è che alcuni individui sono inclini alla formazione di oligomeri nelle beta-cellule,
all’insufficienza b-cellule, e al diabete, mentre altri esprimono con successo piegatura e degrado di IAPP.
Danno mitocondriale
La disfunzione mitocondriale è un evento patogeno cruciale sia in T2D sia nelle PMD del sistema nervoso centrale. Gli aggregati di Ab e a-sinucleina hanno precedentemente dimostrato di disturbare la funzione mitocondriale formando pori nella membrana mitocondriale. Recentemente, gli oligomeri tossici IAPP sono stati osservati per aver
15 distrutto membrane mitocondriali nei topi Tg-hIAPP. Inoltre, studi in cellule esposte agli aggregati IAPP indicano perdita di potenziale di membrana mitocondriale, deplezione di ATP, e altri danni mitocondriali associati. L’instabilità del potenziale di membrana mitocondriale conduce alla sovrapproduzione della fibrilla IAPP in specie reattive
dell'ossigeno, che è stato recentemente dimostrato essere un iniziatore di tossicità da parte di aggregati IAPP.
RE stress
In generale, il reticolo endoplasmatico è ben fornito per soddisfare l'elevata domanda secretoria delle cellule beta (circa 10 000 molecole di proinsulina per cellula per minuto). Però, alterazioni genetiche o ambientali, nonché l'accumulo di aggregati proteici, sono noti per produrre stress cronico oltre la capacità del RE, portando a conseguenze deleterie. Diversi gruppi hanno segnalato cambiamenti morfologici legati allo stress RE, come distensione del RE, e l'induzione di RE di marcatori associati allo stress di risposta di morte, come la C / EBP omologa proteine (CHOP) e l'attivazione delle caspasi nell’ isolotto delle cellule beta di pazienti T2D. Nei controlli, gli isolotti diabetici di tipo 1 non manifestano queste modifiche, suggerendo che lo stress di RE potrebbe essere una caratteristica patologica molto specifico di T2D. Utilizzando linee cellulari, isolotti e modelli primari roditori (tg-hIAPP), è stato dimostrato che l'induzione di stress del RE è specificamente associata con l'espressione della sequenza amiloidogenica hIAPP. La citotossicità inoltre, IAPP-mediata è stata impedita, almeno in parte, da una riduzione di CHOP o dall'aumento dello chaperone endogeno BIP. X-box-binding protein-1 (XBP1) è un membro cruciale della cascata di segnali di stress del RE e un polimorfismo in XBP-1 è stato associato a tratti prediabetici in una popolazione cinese. L’attivazione di XBP1, da un aumento evidente dei livelli di XBP1 impiombato (SXBP1),ed è stato osservato nel cervello di pazienti di SLA, HD, e TSE; la riduzione genetica di XPB1 fornisce
neuroprotezione in modelli topi di SLA, PD, e HD. Un elevata sXBP-1 è stata osservata solo nei topi che iperesprimono hIAPP. Risultati simili sono stati ottenuti da colture primarie di cellule umane pancreatiche con esposizione agli aggregati IAPP. Sebbene la carenza XBP1 nei topi ha portato alla riduzione di secrezione di insulina seguita da intolleranza leggera al glucosio, l'effetto degli aggregati di IAPP non è stato riscontrato in questo modello.
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Infiammazione
Gli aggregati IAPP potrebbero anche indurre l'infiammazione nelle isole di Langerhans. Questi aggregati sono stati osservati in macrofagi presenti nei tessuti pancreatici di
campioni bioptici da pazienti T2D, nelle scimmie diabetiche e nei topi tg-hIAPP. Anche se questi macrofagi potrebbero non rimuovere in modo efficiente gli aggregati,
l’interiorizzazione degli aggregati IAPP porta alla secrezione infiammatoria multipla di citochine tra cui l'IL-1b su colture cellulari. È interessante notare che, è stato riportato un triplice aumento del rischio di sviluppare T2D in soggetti con livelli elevati di entrambi IL-1b e IL-6, ma non IL-6 da sola.Utilizzando cellule dendritiche del midollo osseo come modello, è stato dimostrato che gli oligomeri hIAPP attivano l’infiammazione NLRP3, portando alla secrezione di IL-1b. Inoltre, un recente studio ha indicato che gli oligomeri hIAPP inducono una risposta proinfiammatoria nei macrofagi residenti negli isolotti, tra cui la secrezione di IL-1b portando a disfunzione l’isolotto in un modello di topo tg-hIAPP. È interessante notare che, studi di vari PMD hanno dimostrato che l'attivazione di
inflammasome e conseguente secrezione di IL-1b sembra sia un meccanismo comune attraverso il quale gli aggregati proteici producono danni ai tessuti.
1.6 Rimozione delle proteine malripigate
Nelle cellule longeve come i neuroni e le cellule beta, è cruciale avere un efficiente apparato di degradazione delle proteine per evitare tossicità derivante dall’accumulo sostenuto di proteine danneggiate. Le cellule hanno principalmente tre meccanismi per rimuovere le proteine mal ripiegate: il sistema ubiquitina proteasoma (UPS), l'autofagia, e la formazione di aggregati. Difetti in questi meccanismi possono causare l'accumulo di aggregati di proteine malripiegate.
L'UPS è il membro predominante del macchinario della clearence cellulare per la
degradazione di proteine di breve durata, danneggiate o anomale. Prove schiaccianti hanno dimostrato una compromessa funzione UPS con conseguente accumulo di proteine
polyubiquitinate in patologie neurodegenerative associate a misfolding. Le proteine aggiunte con catene di ubiquitina sono mirate al proteasoma 26S. Gli enzimi deubiquinati idrolizzano catene di ubiquitina, che è necessaria per l'ingresso substrato nella serbatoio proteolitica del proteasoma. L’ubiquitina idrolasi carbossi-terminale L1 (UCH-L1), un membro dell'enzima della famiglia deubiquinati, è abbondantemente espressa in cellule
17 beta. Mutazioni in UCH-L1 sono state collegate a insorgenza precoce PD e
sottoregolazione di UCH-L1 è stata associata con idiopatico Alzheimer e Parkinson. Inoltre, la somministrazione esogena di UCH-L1 restaura il deficit della memoria nei modelli di Alzheimer. Ridotti livelli di UCH-L1 sono stati osservati anche in isolotti di pazienti TD2 confrontati con controlli con indice di massa corporea-abbinato. Questa carenza ha
determinato l'accumulo di proteine ubiquitinate nelle cellule beta, che porta all'apoptosi. Ulteriori studi in isolotti umani hanno rivelato che elevati livelli di hIAPP sottoregolano l'espressione di UCH-L1 con un meccanismo sconosciuto. Topi UCH-L1 hanno
manifestato intolleranza al glucosio mite quando hanno cambiato dieta con un alto contenuto di grassi. Tuttavia, anche la deficienza emizigote di UCH-L1 in topi che esprimono hIAPP, in un altro tollerabile livello, si manifesta come un aumento significativo dell'apoptosi delle cellule beta, perdita di massa beta-cellule e grave iperglicemia su una dieta standard. Così, sembra che i livelli elevati di IAPP, causati da condizioni come l'insulino-resistenza, possano ridurre l'efficienza del sistema UPS. L’inefficiente funzione diUPS potrebbe eventualmente promuovere la formazione di aggregati portando alla tossicità, che ha dimostrato di verificarsi nelle malattie dovute a misfolding nel SNC.
L'autofagia è un importante meccanismo di eliminazione lisosomiale, che porta alla degradazione delle proteine e organelli danneggiati. La macroautofagia (di seguito
denominato autofagia) coinvolge il sequestro di organelli danneggiati o grandi aggregati di proteine in vescicole di membrana note come autofagosomi che trasportano i contenuti al lisosoma per la proteolisi. Anche se l'autofagia è considerata un processo adattativo, studi attuali suggeriscono che un livello basale di autofagia è sempre attivo e si occupa del controllo di qualità delle proteine. L’autofagia anomala nelle PMDs tende ad accumulare aggregati proteici che risultano citotossici. Questo può essere invertito farmacologicamente con l'attivazione dell'autofagia. Un significativo ed elevato volume di vacuoli autofagici e autofagosomi è stato rilevato nelle cellule beta pancreatiche dei pazienti diabetici a confronto con pazienti sani, indicando alterazioni del processo autofagico. Gli studi in cellule beta dei topi tg-hIAPP ha suggerito che queste aggregazioni hIAPP mettono in pericolo il degrado lisosomiale del carico del autofagosoma, con conseguente accumulo di vacuoli autofagici. Tuttavia, il meccanismo di riduzione di valore resta ancora da
18 le cellule dalla tossicità IAPP-mediata. Per contro, la downregulation farmacologica dell'autofagia aumenta la vulnerabilità delle cellule di IAPP inerti, suggerendo un circolo vizioso per cui gli aggregati IAPP riducono il flusso autofagico, promuovendo
ulteriormente l'aggregazione IAPP, che porta alla tossicità beta-specifica delle cellule knockout di Atg7 (un iniziatore cruciale di autofagia) che induce la formazione di aggregati tossici di IAPP, portando disfunzione delle cellule beta e induzione precoce di T2D nei topi tg-hIAPP. È importante notare che l'autofagia è importante per il
mantenimento dell'omeostasi beta cellulare. L’isolotto beta-cell-specifico causa riduzione genetica di autofagia (da carenza Atg7), anche in assenza di espressione hIAPP, ha portato a lievi intolleranze al glucosio e livelli di glicemia elevati. Tuttavia, in presenza di
aggregati di IAPP questa riduzione di autofagia ha provocato diabete grave anche su una dieta standard. È stato inoltre dimostrato che l'obesità associata all'insulino-resistenza ha comportato un maggiore flusso autofagico nelle cellule beta per rispondere alla crescente domanda di insulina. Tuttavia, in presenza di aggregati IAPP la riduzione della
degradazione lisosomiale ha impedito questo compensazione, aumentando il flusso autofagico.
Le proteine che sfuggono ai canonici processi di degrado possono essere sequestrate temporaneamente per diminuire la citotossicità, previa formazione di inclusioni
citosoliche all'organizzazione del microtubulo conosciuto come aggresoma. Recentemente p62 / SQSTM1 è stato segnalato per funzionare in formazione di inclusioni proteiche citosoliche e la loro liquidazione da parte di un processo di autofagia specifico per la proteina aggregata è definito aggrephagia. Le prove indicano che p62-positivi aggresomi possono essere eventualmente digeriti dal gruppo di continuità e macchine lisosomiale. L'accumulo di p62-positivi in aggregati proteici è stato osservato nelle cellule beta che esprimono hIAPP e una maggiore formazione di inclusione p62-positivi corpi sono stati associati con una ridotta apoptosi delle cellule beta IAPP-indotte. Inoltre, è stato
dimostrato che p62 può specificamente legarsi a aggregazione inclini hIAPP e sequestrarle temporaneamente in una forma meno tossica. Però, queste inclusioni p62 devono essere degradate dall’ autofagia / lisosomiale con percorso per protezione a lungo termine delle cellule beta, come descritto per un-synuclein- o-huntingtina contenente p62 inclusioni in neuroni.
19
1.7 Aggregazioni IAPP in tessuti non-pancreatici
Il diabete danneggia gravemente e in maniera incontrollata numerosi tessuti non
pancreatici, tra cui rene (nefropatia diabetica), neuroni sensoriali (neuropatia diabetica), e il cuore (cardiomiopatia diabetica). Sono stati osservati depositi IAPP in molti di questi tessuti nei pazienti T2D. In un studio condotto su biopsia nefropatica di pazienti TD2, il 48,3% ha esposti depositi IAPP nei reni. L'incidenza di lesioni renali come glomeruli nodulari e glomerulosclerosi e lesioni interstiziali tubolari sono state più gravi nei pazienti con deposizione IAPP rispetto ai pazienti senza deposizione di IAPP, suggerendo un ruolo patologico dei depositi IAPP. Questo studio ha anche suggerito che elevati livelli IAPP nel plasma possono indurre la deposizione, ma sono l'unico fattore determinante. La
deposizone di IAPP si osserva anche nella materia grigia del lobo temporale del cervello di pazienti T2D. Depositi di IAPP sono stati trovati sia nel sangue negli spazi perivascolari, diminuendo afflusso dalla circolazione periferica. Infine, gli elevati livelli di oligomeri IAPP sono stati segnalati nei pazienti T2D deboli di cuore. È interessante notare che,i cuori di individui obesi prediabetici sono esposti a oligomeri IAPP, cio’ suggerisce che questo processo di accumulo può avvenire decenni prima della comparsa di T2D conclamata. Cuori normali di pazienti senza diabete non hanno mostrato presenza di aggregati IAPP. Utilizzando un modello di topo transgenico esprimendo hIAPP, si è ulteriormente dimostrato che ratti prediabetici e diabetici manifestano ipertrofia cardiaca associata con accumulo IAPP e che aggregati IAPP inducono difetti strutturali e funzionali in
cardiomiociti. Questi risultati certamente meritano ulteriori ricerche per esplorare un ruolo ancora da scoprire per le aggregazioni IAPP a danno tissutale non pancreatico associato con T2D. È anche possibile che gli aggregati IAPP possano interagire con altri aggregati che causano malattie attraverso un processo di semina eterologa.
1.8 Osservazioni
La domanda cruciale è se questi aggregati sono inerti e astanti al risultato come
conseguenza del danno tissutale durante la malattia o se svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi. Il campo del diabete in gran parte ha ignorato la rilevanza degli aggregati IAPP. Questi aggregati hanno ruolo chiave nella patogenesi della malattia ed è simile a quello che ha accomunato aggregati proteici come la causa ampiamente accettata di varie malattie
20 neurodegenerative. Considerando T2D come PMD si aprirà un’ intera nuova area di ricerca per scoprire nuovi bersagli negli interventi terapeutici. Tuttavia, la suscettibilità genetica e fisiologica, e le modifiche cellulari durante l'invecchiamento, come la progressiva perdita di efficienza proteostasica, possono svolgere un ruolo cruciale. Tutti i casi sporadici di PMD che interessano il sistema nervoso centrale sono in gran parte associati
all'invecchiamento, il che suggerisce un legame tra la proteina misfolding e l'invecchiamento. Indipendentemente dalla causa di aggregazione, gli aggregati malripiegati, tra cui l’isolotto amiloide, sembrano condividere meccanismi comuni di formazione, intermedi, e prodotti finali , nonché percorsi di tossicità cellulare simili. Così, l’ inibizione della proteina misfolding e di aggregazione proteica potrebbero diventare una strategia terapeutica comune a prevenire alcuni delle malattie PMD, fino ad oggi non collegabili scientificamente.
21
※ Capitolo 2: Sintesi insulina e stress reticolare
2.1 Biosintesi della proinsulina
Per mantenere abbondanti le risorse di insulina nei granelli di fronte alla richiesta metabolica in corso, le cellule beta del pancreas devono produrre grandi quantità di
proinsulina, il precursore di insulina. La biosintesi della proinsulina può rappresentare fino al 30-50% della sintesi totale delle proteine cellulari delle cellule beta. Questo mette pressione sulla via secretoria delle cellule beta, soprattutto nel reticolo endoplasmatico (RE), dove la proinsulina subisce una relativa piegatura iniziale, compresa la formazione di tre legami disolfuro evolutivamente conservato. In cellule beta normali, fino al 20% di proinsulina di nuova sintesi potrebbe non riuscire a raggiungere la sua conformazione nativa, suggerendo che la proinsulina è incline a misfolding proteico.
L'insulina è uno degli ormoni piu importanti che regola e mantiene omeostasi metabolica nel corpo. Nelle ß-cellule del pancreas, l'insulina è inizialmente sintetizzata come molecola precursore, la preproinsulina, sequenza costituita dal segnale di peptide, l'insulina dominio B,di dominio C affiancata da scissione siti bibasica, e l'insulina di dominio A. Per rendere matura l'insulina bioattiva, la preproinsulina di nuova sintesi subisce cooperazione e traslocazione post-traduzionale attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico (RE), dove viene scissa dal segnale peptidasi per formare proinsulina. La proinsulina poi si piega, formando tre ponti di solfuro che si conservano tra l'intera superfamiglia insulina IGF.Le forme di proinsulina non covalente si associano a omodimeri che subiscono trasporto intracellulare dal RE al complesso di Golgi e in granuli secretori, durante il quale si forma proinsulina in esameri ed è proteoliticamente trasformata a C-peptide e insulina matura che è immagazzinata in granuli. Dopo stimolazione, i granelli di insulina attraverso esocitosi rapida, rilasciano insulina nel flusso sanguigno per abbassare il glucosio nel sangue. Anche se la biosintesi dell'insulina e la secrezione sono entrambe strettamente regolate, i limiti di concentrazione di glucosio necessaria per innescare il rilascio di insulina sono differenti da quelle per la biosintesi della proinsulina. La secrezione di insulina è innescata da
concentrazioni di glucosio superiori a 5 mg, mentre la sua biosintesi è più sensibile alle fluttuazioni di glucosio tra 2 e 4 mg. Così, la biosintesi dell'insulina è costantemente impegnata per ricostituire le riserve di insulina anche a normali concentrazioni di glucosio fisiologiche. L'analisi genetica dimostra che, in media, circa un terzo delle proteine
22 cellulari totali sono mirate al percorso secretorio. Tuttavia,nelle cellule beta, la biosintesi dell'insulina da sola rappresenta oltre il 10% della sintesi di proteine totali in condizioni basali, e tale percentuale può ulteriormente aumentare fino al 50% in condizioni stimolanti. A causa di questa grande richiesta, la proinsulina in versione pieghevole nelle beta cellule è molto sensibile ai cambiamenti dell'ambiente del RE, cresce la domanda per la sintesi di proinsulina e la piegatura rende le cellule beta uno dei tipi di cellule più suscettibile. Al momento della consegna al lume RE, il segnale della preproinsulina peptide viene rimosso immediatamente dal segnale peptidasi dal luminale del reticolo endoplasmatico. L'efficienza e la fedeltà del segnale peptide di scissione sembrano essere molto importanti per la successiva piegatura della proinsulina nel RE. Dopo la rimozione del peptide segnale, la proinsulina subisce una rapida piega nel RE. Anche se alcuni ripiegamenti locali, come la formazione di segmenti α-elica e β-strand nella porzione di insulina, svolgono un ruolo nel percorso di piegatura della proinsulina, l'accoppiamento corretto del disolfuro sembra essere uno dei più importanti eventi per determinare se la molecola di proinsulina può raggiungere la struttura piegata nativa. La proinsulina contiene sei cisteine che formano tre legami disolfuro evolutivamente conservate:B7-A7, B19-A20, e A6-A11(Fig.1).
[Fig.1]
Gli isomeri disolfuro mispaired non nativi sono stati osservati sia in vivo e in vitro. È interessante notare che tutti i residui di cisteina sono impegnati e formano casualmente abbinamenti disolfuro con altri residui di cisteina intramolecolari, ci sarebbero addirittura quindici possibili combinazioni disolfuro. Tuttavia, il numero effettivo di isomeri disolfuro osservato da studi in vitro è relativamente basso: in uno studio solo due principali isomeri disolfuro sono stati osservati durante la piegatura della proinsulina da un precursore
23 denaturato, e in un altro studio sono stati recuperati in vitro tre isomeri di proinsulina umana disolfuro. Presumibilmente, altri possibili isomeri di proinsulina disolfuro sono non formati o sono molto instabili. Questi studi in vitro suggeriscono che la proinsulina può formare i suoi tre legami disolfuro nativo in ordine preferenziale, con B19-A20 a formare un'iniziale intermedio uno-disolfuro pieghevole che puo' facilitare la formazione di legami B7- A7 e A6-A1. Il significato del legame B19-A20 nella piegatura in vitro di insulina è coerente con studi del percorso di piegatura di IGF-1. Il disolfuro tra la Cys 18 e 61, corrispondente al legame B19-A20 di insulina, si trova IGF-1 in tutti intermedi pieghevoli rilevabili, suggerendo che questo è il legame disolfuro più favorevole, e il primo ad essere formato. Tra tutti IGF-1 isomeri, il più abbondante intermedio nella via pieghevole
contiene un legame disolfuro nativo aggiuntivo Cys tra 6 e 48, corrispondente al legame B7-A7 dell'insulina e il ripiegamento generale degli intermedi con quelli dei due legami disolfuro assomiglia a quella della proteina nativa tranne il dispiegamento locale dell'elica 2, corrispondente alla A1-A8 elica di insulina. Alcuni studi indicano che, interrompendo selettivamente i singoli legami disolfuro di insulina, l'eliminazione di B19-A20 produce il più significativo deterioramento di ripiegamento in vitro, con conseguente perdita di struttura secondaria ordinata e marcatamente ridotti in compattezza. Per contro,
l'eliminazione dei titoli A6-A11 causa la perturbazione strutturale che si verifica solo nel N-terminale,un dominio α-elica, suggerendo che la struttura terziaria nativa dell' insulina può essere controllata indipendentemente della struttura elicoidale A1-A8 locale o dal legame disolfuro A6-A11. Rispetto alla cancellazione di altri due legami, la perdita del legame B7-A7, che è esposta sulla superficie della molecola di insulina, porta ad una perturbazione intermedia della stabilità termodinamica e della struttura complessiva. Pertanto, sulla base di studi su pieghevoli in vitro, ci sono differenze nel relativo contributo di ciascuno dei tre legami disolfuro alla struttura nativa ripiegata di insulina, B19-A20 sembra essere il più importante e forse il primo legame disolfuro formato. A differenza del pieghevole in vitro, è ancora una questione aperta se i tre ponti disolfuro nativi di modulo proinsulina siano espressi a caso o in un ordine particolare in ambiente ripiegamento complesso del RE delle cellule beta. La prima evidenza pubblicata che wild-type proinsulina può malripiegarsi nel reticolo endoplasmatico ed è avvenuto quando due principali isomeri disolfuro di proinsulina recentemente sintetizzato sono stati osservati entrambi nel lievito e nelle cellule di mammifero. Sulla base del mobility shift in
24 nonreducing SDS-PAGE, distinti isomeri disolfuro sono stati proposti da intermedi di proinsulina pieghevoli che sono stati in gran parte conservati nel reticolo endoplasmatico, dove sono riconosciuti specificatamente e vincolati dal membro RE della famiglia hsp70 chaperone, noto come BiP. È interessante notare che, anche se la perdita del legame disolfuro A6-A11 ostacola seriamente la bioattivita del recettore vincolante e dell'insulina, la proinsulina con il legame A6-A11 eliminato era efficientemente secreta dalle cellule, suggerendo che la struttura complessiva della proinsulina priva A6- A11 può ancora assomigliare a quello di wild-type proinsulina. Invece, il cambiamento di B19-A20 o B7-A7 disturba gravemente il normale percorso di piegatura della proinsulina, portando a proinsulina misfolding e ritenzione RE. Questi dati evidenziano l'importanza dei due interdomini dei legami disolfuro nella piegatura della proinsulina nel RE.
2.2. Ossidoreduttasi PDI
Nel RE, la piegatura delle proteine è facilitata da enzimi che possono sia catalizzare la formazione di legami disolfuro tra cisteine, sia rompere i legami disolfuro impropri che si possono formare durante il processo di piegatura. Così nel lume del RE, ci sono reazioni di ossidazione e di riduzione che si verificano contemporaneamente. Gli enzimi nel RE che svolgono un ruolo centrale sia per l’ossidazione che per la riduzione dei legami disolfuro, sono membri della proteina disolfuro isomerasi (PDI) di famiglia delle ossidoreduttasi; ci sono almeno 20 membri di questa famiglia. Ogni enzima contiene come minimo una sequenza tioredoxina "CXXC", dove C = cisteina e X = qualsiasi amminoacido. Per guidare la formazione del legame disolfuro nella formazione del substrato ridotto, la sequenza tioredoxina del ossidoreduttasi RE deve essere la stessa nella forma intra molecolarmente ossidata. L'enzima quindi costituisce un transitorio disolfuro misto intermedio con il substrato (un "addotto") che viene rapidamente rotto al completamento del legame disolfuro all'interno del substrato. Il prodotto dell'intera reazione lascia un nuovo legame disolfuro nel substrato come la tioredossina in ossidoreduttasi RE che diventa ridotta. Per iniziare un altro giro di formazione del legame di disolfuro, il motivo tioredoxina nel RE deve essere ossidoridotto per tornare ad essere ossidato. Questo è catalizzato per ossidasi upstream RE, in particolare RE oxidoreducin-1. Ero1 normalmente non catalizza direttamente la formazione di ponti disolfuro nel substrato, ma piuttosto usa famiglia PDI come membri chiave che guidano il flusso dai substrati (ad esempio
25 proinsulina) a Ero1 e infine a ossigeno molecolare, con perossido di idrogeno (H2O2) come sottoprodotto.
[Fig.2]
Nonostante gli sforzi fatti per comprendere al meglio come le ossidoreduttasi del RE facilitino l’ ossidazione e riduzione della proinsulina disolfuro, i percorsi specifici coinvolti in questi processi sono tutt'altro che chiari. Da studi in vitro, PDI ha dimostrato di facilitare la piegatura di proinsulina ridotta e di aumentare la resa di proinsulina con legami disolfuro nativi. L'attivita catalitica di PDI non appare dipendere dal relativo dominio del legame peptidico. Tuttavia, la funzione di ossidazione / riduzione del PDI nelle cellule è complesso. PDI si trova in entrambe le forme ossidata e ridotta nel lume del reticolo endoplasmatico. Nel RE del lievito, PDI è più ossidato rispetto che nelle cellule di mammifero. La miscela di stati redox permette di eseguire PDI in entrambe le reazioni di ossidazione e isomerizzazione / riduzione del RE. Sorprendentemente, un recente studio dimostra che PDI knockdown attualmente migliora la proinsulina ossidativa pieghevole e accelera l'esportazione della proinsulina dal RE. Inoltre, sovraesprimendo PDI, diminuisce la secrezione di insulina e provoca accumulo di proinsulina nel RE provocando stress. Questi studi suggeriscono che PDI presenta una rete di attività e serve come fattore di ritenzione RE per proinsulina nelle cellule beta. Pertanto, è molto probabile che qualche altro membro della famiglia RE ossidoriduttasi ancora da scoprire svolga un ruolo nel folding ossidativo della proinsulina nel RE. Le specifiche ossidasi di RE necessarie per l'ossidazione della proinsulina pieghevole non sono chiare. Ero1 è stato identificato come una proteina fonte primaria di ossidazione nel RE. Le cellule beta del pancreas esprimono
26 due forme di Ero1: Ero1α e Ero1β. A differenza dell’ubiquitariamente espresso Ero1α, l'espressione Ero1β è molto limitata tra i vari tipi di cellule ma è ben espresso nelle cellule beta pancreatiche, suggerendo che potrebbe svolgere un ruolo nella piegatura della
proinsulina. In verita, la sovraespressione Ero1β in linee cellulari beta migliora la proinsulina pieghevole, ne facilita l'esportazione dal RE, e aumenta la produzione di proinsulina e la secrezione. Al contrario, Ero1β compromette l'ossidazione della
proinsulina pieghevole e diminuisce il contenuto di insulina in cellule beta. È interessante notare che, Ero1β nei topi mostra solo un modesto difetto nell'ossidazione e trasformazione della proinsulina, e Ero1α e Ero1β doppio non fanno aggravare ulteriormente il difetto, suggerendo che, oltre a Ero1, altri ossidasi del RE potrebbero fornire una fonte di equivalenze ossidanti per la maturazione della proinsulina disolfuro. In effetti, diversi ossidasi del RE, tra cui la perossiredossina IV, glutatione perossidasi, vitamina K epossido reduttasi, sulfidril-ossidasi QSOX e ossidato glutatione , sono stati considerati come ulteriori potenziali fonti di equivalenti ossidanti per la formazione del legame disolfuro nelle proteine. Tuttavia, il ruolo di questi ossidasi nell'ossidazione della proinsulina nelle cellule beta rimane sconosciuto.
2.3 Piegatura e dimerizzazione
La proinsulina può formare dimeri sia in vitro sia nel RE delle cellule beta. I residui di insulina di dominio B (B8-B29) sono strettamente coinvolti nella dimerizzazione interfaccia, e si ipotizza che le superfici di proinsulina e insulina dimerizzate siano identiche (il dominio C è in bobina casuale e quindi improbabile per contribuire in alcun modo alla dimerizzazione di proinsulina). Mutando alcuni residui coinvolti nell'interfaccia nella dimerizzazione si permette la produzione di insulina monomerica - un esempio è l'insulina lispro in cui la prolina e lisina in posizioni B28 e B29, rispettivamente, sono cambiate. Fino ad oggi, non è ancora noto se proinsulina ossidazione / pieghevole monomero e dimerizzazione siano eventi che si verificano in sequenza o
contemporaneamente.Tuttavia, dato il fatto che la bioattività di analoghi dell'insulina
monomerica, ad esempio, l'insulina lispro o insulinaspart sono stati in gran parte conservati, le insuline monomeriche sono pensate per contenere tutti gli elementi essenziali della struttura nativa di insulina. Inoltre, le strutture NMR di proinsulina monomero [DKP
27 e wild-type proinsulina sono simili, entrambi contenenti un residuo di insulina-like nativo. Così, almeno in vitro, la dimerizzazione non è richiesta per proinsulina per fare il suo nativo legame disolfuro. Tuttavia, il rapporto tra la dimerizzazione di proinsulina e la sua ossidazione nel RE sembra essere più complicato. Mentre la proinsulina monomerica S (B9) D ha dimostrato di essere efficacemente esportata dal RE e mirata ai granuli secretori, una dettagliata analisi mostra che S (B9) D, così come altre due mutanti H (B10) D e V (B12) E possono interrompere la dimerizzazione di proinsulina, modulo mispaired
disolfuro, suggerendo un pieghevole difettoso in RE. Non è noto se il misfolding di questi monomeri di proinsulina mutante è una conseguenza del loro fallimento della
dimerizzazione o causa di un effetto diretto delle mutazioni sul folding ossidativo della proinsulina monomerica.
2.4 Proinsulina misfolding
Negli ultimi dieci anni, una crescente attenzione è stata attribuita al possibile ruolo
difettoso della proinsulina pieghevole allo stress del RE nello sviluppo e nella progressione del fallimento delle cellule beta e il diabete. Un crescente numero di evidenze indicano che la proinsulina misfolding può essere causata sia da difetti primari di proinsulina dovute a mutazioni INS-gene, o da un ambiente RE sfavorevole in cui il normale percorso
ripiegamento di wild-type proinsulina viene influenzato secondariamente. Nelle forme di diabete MIDY, le mutazioni più sperimentalmente testate si trovano a causare proinsulina misfolding nel RE. Più della metà di queste proteine mutanti generano cisteine spaiate perché eliminano uno dei residui di cisteina nativi, oppure talvolta possono crearerne di nuovi. Questi mutanti interrompono la formazione di corrette coppie disolfuro, portando a proinsulina misfolding. Ad oggi, tra i sei residui di cisteina naturali di proinsulina, per cinque è gia’ stato verificata l’esistenza di una mutazione che è collegata a MIDY. In aggiunta a quelle mutazioni che creano un numero dispari di proinsulina cisteine, alcune mutazioni MIDY non comportano residui di cisteina. Queste mutazioni non-cisteina sono principalmente sostituzioni aminoacidiche più altamente conservate e residui che hanno dimostrato di essere importanti per la piegatura locale e intramolecolare con interazioni non covalenti. Dal momento che questo tipo di misfolding è causato da un difetto principale della molecola di proinsulina, ci riferiamo ad esso come "misfolding
28 proinsulina primario." In questo caso, la proinsulina misfolded mutata può essere
considerata come un "primo colpo"che è di per sé sufficiente ad innescare una serie di cascata di eventi che hanno portato al fallimento delle cellule beta e al diabete in pazienti MIDY. È importante sottolineare che il percorso di ripiegamento di nuova sintesi della wild-type proinsulina è influenzato anche quando è co-espresso con la MIDY proinsulina mutante nel RE. La prova diretta di questo effetto viene da studi di Akita, topi che portano un spontanea mutazione missense del gene dell'insulina codificata C (A7) Y in uno dei due alleli INS2. Una mutazione presso il solito sito è stata trovata anche per causare MIDY negli esseri umani. La mutazione distrugge l'essenziale legame interdominio B7-A7 disolfuro che innesca misfolding di proinsulina mutante. I topi sviluppano il diabete poco dopo lo svezzamento. Accumulando prove indicano che il sottostante meccanismo avvia un deficit di insulina nei topi Akita diabetici e nei pazienti MIDY, è una perdita di valore delle esportazioni RE di wild-type proinsulina a causa di blocco da co-espressione di proinsulina mutante. Utilizzando tristricine- SDS-PAGE urea in grado di distinguere wild-type e proinsulina Akita sia sotto condizioni riducenti e non riducenti, si è riscontrato che più del 50% di wild-type di molecole proinsulina (vale a dire più del doppio rispetto alle cellule beta normali) sono mal ripiegate negli isolotti del tipo Akita. L'effetto della
proinsulina misfolded mutante nel ripiegamento di wild-type proinsulina può essere diretta e / o indiretta. E 'stato dimostrato che la proinsulina mutante può anormalmente interagire con wild-type proinsulina, formando complessi intermolecolari proteici disolfuro-linked e compromette direttamente la piegatura di wild-type proinsulina. Inoltre, misfolded
proinsulina mutante puo' influenzare il ripiegamento di wild-type proinsulina
indirettamente e indurre RE stress e disturbare il folding delle proteine nell ambiente RE. La proinsulina sembra essere una molecola difficile da piegare in RE, il percorso di piegatura della proinsulina può essere influenzato negativamente dall’ambiente di ripiegamento sfavorevole di RE. È stato recentemente dimostrato che chimicamente la proinsulina sintetica può robustamente ripiegarsi in vitro a pH 10; in queste condizioni la piegatura di alcuni mutanti MIDY può essere realizzata con successo. Tuttavia, in
condizioni di pH fisiologico all'interno del RE, l'ambiente pieghevole sembra essere meno favorevole per la proinsulina pieghevole. Uno studio che analizza la stabilità, la secrezione e l'aggregazione di wild-type proinsulina in più linee di cellule beta ha scoperto che nessuno di loro poteva efficientemente piegare la proinsulina. Questo suggerisce che anche
29 in cellule beta normali più del 20% di proinsulina di nuova sintesi wild-type non riesce a raggiungere la sua struttura pieghevole nativa, suggerendo che durante la biosintesi, una certa quantità di proinsulina misfolded è prevista come sottoprodotto. In condizioni
fisiologiche normali, queste molecoledi proinsulina wild-type mal ripiegate possono essere ripiegate alla loro struttura nativa o degradate attraverso al degrado associato a RE (ERAD) e all’autofagia. Pertanto, tale misfolding non compromette la funzione normale delle
cellule beta. Tuttavia, in certe condizioni patologiche, la quantità totale di proinsulina misfolded wild-type aumenta, superando geneticamente la determinata capacità delle cellule beta di gestire il carico di proteine misfolded e che porta ad un accumulo di misfolded wild-type proinsulina. Ad un certo livello di soglia, la proinsulina misfolded accumulata è potenzialmente in grado di propagare il misfolding sulla proinsulina
rimanente, che si conclude con tossicità delle cellule beta del pancreas. Dal momento che un aumento wild-type proinsulina misfolding è secondario alla piegatura difettosa dell’ ambiente di RE, chiamiamo questa "proinsulina misfolding secondaria." In effetti, l'aumento del misfolding di wild-type proinsulina può essere considerato come un "secondo colpo" per le cellule beta, aggravando le disfunzioni di RE con conseguente insufficienza delle cellule beta e diabete.
2.5 Stress lipotossico
Anche se non sono implicate nel diabete di tipo 2, ci sono diverse rare mutazioni umane che provocano misfolding di pro-insulina, con conseguente RE stress e insufficienza delle cellule beta. Il topo Akita fornisce un utile modello di questo esempio. Per contro, le alterazioni in ambiente RE (alterazioni del pH, redox o Ca2 +) che compromettono la capacità complessiva di piegatura, potrebbero avere un ruolo più comune nel fallimento delle cellule beta. Certo,molti fattori di stress RE, tra cui l'ossido nitrico, le citochine, e glucotossicità, sembrano agire diminuendo il contenuto di Ca2 + nel lumenal. Un
meccanismo simile è stato usato per spiegare lo stress lipotossico di RE, ma l'evidenza non è ancora definitiva. Data la misura del Ca2+, il depauperamento è tecnicamente
impegnativo,effetti variabili dei singoli AF sono stati riportati in termini di estensione, di tempi, e di specificità. In un recente studio, sia il palmitato (anche se testato solo ad alte concentrazioni) e sia sarco / reticolo endoplasmatico Ca2 + -ATPasi (SERCA) inibitore della pompa, tapsigargina, erano più efficaci nel ridurre Ca2 + che citochine o
30 glucotossicità. È interessante notare che, la sovraespressione di proteine secretorie mutanti anche con Ca2 + impoverito dal RE, suggerisce che questo fenomeno si verifica di
conseguenza, così come un inizio dello stress del RE. Tuttavia, la diminuzione di Ca2 + nel RE è necessaria per l'induzione di stress nel RE in risposta a citochine, glucotossicità, nonché i donatori di ossido di azoto, poiché gli effetti di questi agenti su apoptosi sono parzialmente salvati da sovraespressione di SERCA2b. Tuttavia, tale nesso di causalità è stato dimostrato per lo stress lipotossico. Considerando l'inibizione sia della glucotossicità e delle citochine dell' espressione SERCA2b nelle cellule beta, non ci sono prove che questo si verifichi con lipotossicità. Al contrario, una ridotta espressione di SERCA2b è osservata negli isolotti di pazienti con diabete di tipo 2, e accompagna ridotta
manipolazione di Ca2+ e disfunzione delle cellule beta nei topi db / db. Il secondo modello è più definito da glucotossicità anziché lipotossicità, così forse la perdita di SERCA2b e, per estensione, del misfolding, contribuiscano alla progressione anziché iniziazione di diabete di tipo 2. In conclusione, è probabile che il ruolo, e di certo il meccanismo della deplezione di Ca++delle cellule beta è meglio stabilito per altri fattori di stress RE che per lipotossicità. Inoltre,il Ca2 + è solo una misura indiretta dell’ effettivo stato di
ripiegamento proteico. Tuttavia, questo è stato analizzato direttamente in uno studio di RE con un reporter localizzato, che comprende la glicoproteina virus della stomatite
vescicolare etichettati con GFP (VSVG-GFP). Utilizzando un anticorpo specifico per la nativa conformazione (piegato correttamente) di VSVG-GFP, il palmitato non è stato dimostrato indurre proteina misfolding, mentre tapsigargina l'ha fatto. Speriamo,che le tecniche per saggiare lo stato di ripiegamento della proteina endogena cargo in condizioni lipotossicita o diabetiche diventeranno disponibili per aiutare meglio a risolvere questi problemi.
2.6 RE stress e il rilascio di insulina difettosa
Come discusso sopra, la visualizzazione delle singole cellule beta di un accumulo pro-insulina nel RE mostrano RE stress e perdita di contenuto di insulina, anche prima della morte cellulare. Compromesso il traffico da RE al Golgi si contribuisce
probabilmente a questa deplezione di insulina compromettendo la maturazione della pro-insulina nei compartimenti post-Golgi. Ci sono anche numerose prove per il ruolo della
31 UPR, soprattutto perché mRNA per pro-insulina, e relativo secernente o proteine di
elaborazione, si rivolge dall'attività endoribonuclease di IRE1 seguente a forte RE stress. RE stress può anche reprimere il gene di espressione pro-insulina a cellule beta con effetti indiretti della ATF6. Un simile ruolo per XBP-1 spicing è stato proposto, mediata in parte dal regolamento del Pdx1. Tuttavia, nessuno di questi meccanismi è stato collegato a stress lipotossico, e ci sono altri meccanismi attraverso i quali i FAS sono noti per reprimere il gene di trascrizione dell' insulina in modo più diretto e indipentemente della UPR. Vi sono anche prove che miglioramenti nella proteina RE folding possono parzialmente ovviare all’alterata biosintesi di insulina a causa di glucotossicità, ma la rilevanza di questo per lipotossicità è sconosciuta.
Una caratteristica fondamentale del diabete di tipo 2 è la perdita selettiva di secrezione di glucosio, che si verifica nel prossimale percorso di accoppiamento stimolo-secrezione, indipendentemente alla riduzione di massa cellulare e / o contenuto di insulina.
Anche se questi ultimi sono chiaramente legati a RE stress, questo è meno evidente per la disfunzione secretoria. Forse la prova più evidente di supporto deriva da un modello di glucotossicità, dove la somministrazione in vivo di 4-fenilbutirrato (PBA) ha comportato un miglioramento della secrezione glucosio-stimolata di insulina (GSIS) da isolotti ex vivo con poca alterazione del contenuto di insulina. Tuttavia, non può essere escluso che ci sono benefici indiretti sulla funzione delle cellule beta in questo modello a causa di effetti sistemici di PBA. Sebbene ci sono anche numerosi studi in vitro che pretendono di mostrare un restauro di GSIS con seguente risoluzione di RE stress, questo potrebbe più semplicemente essere spiegato da un pieno di rifornimenti di insulina, come è stato
osservato in una delle poche indagini dove sia il contenuto sia la secrezione insulinica sono stati misurati in parallelo. La differenzazione delle cellule beta è stata anche legata allo stress di RE in modelli murini e allo stress glucotossico in vitro, ma se queste alterazioni dell'espressione dell'mRNA equivalgono a una perdita funzionale di stimolo-secrezione accoppiamento non è stato rigorosamente stabilito. La prova piu forte di un legame tra re stress e la secrezione ruota attorno a un nuovo ruolo per la sindrome di Wolfram 1 (WFS1). Questo prodotto del gene reprime normalmente il braccio ATF6 dell'UPR, in modo tale che si trova in natura mutazioni in WFS1 risultato in RE stress, morte cellulare, e una rara forma di diabete noto come sindrome di Wolfram. Il nuovo studio dimostra in modo convincente che il glucosio promuove il traffico di WFS1 dal RE al plasma membrana,
32 dove regola positivamente la generazione cAMP, un segnale di amplificazione sia per esocitosi distale che per espressione genica dell’insulina. Il circuito cAMP è stata inibito da tapsigargina (coerente con la ritenzione WFS1 in ER) ma inalterato con delibera di RE stress moderato con il PBA chaperone chimico. Sarà interessante determinare se ci sono altre possibili vie di modulazione dello stress e di insulina secreta.
2.7 Analisi di rilevazione proinsulina misfolding
Una delle sfide nel campo del folding della proinsulina è una mancanza di approcci affidabili che possono specificatamente rilevare la proinsulina malripiegata. Attualmente, ci sono solo pochi modi di analizzare la piegatura e la maturazione disolfuro di proinsulina nelle cellule. Uno riguarda l'utilizzo della non ridotta tris-tricineurea-SDS-PAGE. Questo sistema gel produce una risoluzione superiore di piccole proteine nell'intervallo di peso molecolare compreso tra 5 e 20 kDa (peso molecolare di preproinsulina, proinsulina, e l'insulina sono circa 11, 9, e 5,8 kDa). Quando le sintesi di preproinsulina e proinsulina vengono analizzate sotto condizioni nonreducing tali che i ponti disolfuro preformati nelle cellule sono conservati, questo sistema gel può discriminare tra proinsulina nativa e isomeri disolfuro mal ripiegatI. Un secondo approccio che coinvolge il gel elettroforesi esamina il recupero totale della proinsulina nativa sotto condizioni nonreducing rispetto alla proinsulina totale recuperata in condizioni riducenti. E’ stato dimostrato che la proinsulina può fare legami disolfuro intermolecolari anormali con altre molecole di proinsulina o di altre proteine (ad esempio chaperoni) nel RE. Questi prodotti appaiono come maggiori complessi molecolari di proteine quando essi vengono analizzati utilizzando SDS-PAGE in condizioni nonreducing. Tuttavia, quando questi complessi vengono esaminati in condizioni di riduzione in cui tutti i ponti disolfuro intermolecolari sono rotti, le molecole di proinsulina sono recuperate come specie monomeriche. Pertanto, confrontando il totale recupero della proinsulina monomerica sotto condizioni non
riducenti e riducenti può aiutare a stimare la quantità di proinsulina che ha formato legami disolfuro intermolecolari, compresa la formazione di un complesso a più alto peso
33
2.8 Prospettive
E' stato stabilito che la proinsulina misfolded causa fallimento delle cellule beta in modo dose-dipendente, ma rimane ignoto se una quantità specifica di proinsulina misfolded deve essere presente prima della rottura delle cellule beta. Dato che l'aumento di misfolding di wild-type proinsulina si verifica in alcune condizioni patologiche, ulteriori studi sono necessari per determinare la soglia di proinsulina misfolded richiesta per innescare fallimento delle cellule beta in forme comuni di diabete, nonché per identificare
modificatori genetici che possono rendere alcuni individui più sensibili di altri. Un'altra sfida per comprendere il ruolo della proinsulina misfolding nel diabete è il requisito per isolare gli isolotti amiloidi dal vivo o cellule beta per misurare definitivamente proinsulina misfolding durante la biosintesi. Dato lo sviluppo delle conformazioni di anticorpi
dipendenti per α-1 antitripsina, potrebbe essere possibile sviluppare anticorpi che
riconoscono specificamente proinsulina misfolded nel plasma (forse, liberato dalla morte delle cellule beta) dei pazienti. Questi anticorpi potrebbero anche essere utili per lo studio di sezioni di tessuto di cadavere con campioni di pazienti diabetici in diverse fasi di la malattia. Tale approccio potrebbe consentire lo sviluppo di strumenti di diagnostica per migliorare la nostra comprensione della patogenesi e della malattia. Inoltre, a questo punto non sappiamo se il tipo selvatico di proinsulina "sa" come formare il corretto abbinamento di disolfuro, e viceversa, non si capisce perché la non-cisteinamutante MIDY "si confonde" nel percorso della proinsulina pieghevole. Presumibilmente, le mutazioni MIDY alterano le fasi di piegatura più sensibili coinvolte nel corretto allineamento dei domini B e A della proinsulina in modo da perturbare la formazione del legame nativo proinsulina disolfuro. È possibile che la collezione di mutanti MIDY possa servire come modello molecolare della natura per evidenziare gli ostacoli più impegnativi della cinetica della proinsulina
pieghevole, che rischiano di coinvolgere le regioni maggiormente bisognose di assistenza da parte di enzimi e chaperon molecolari di RE. Sono ancora in corso studi per capire quali ossidoreduttasi RE e chaperoni sono necessari per il corretto ripiegamento della
proinsulina, e come tali attività sono sovraregolate secondo l' aumento del carico della proinsulina. Inoltre, l'importanza della dimerizzazione della proinsulina rimane misteriosa: è la dimerizzazione la base da cui si blocca l'uscita della proinsulina misfolded da ER? In tal caso, l'interfaccia di dimerizzazione potrebbe essere un potenziale sito bersaglio terapeutico che potrebbe impedire interazioni anomale tra wild-type e proinsulina mutante,
34 e consentire l'esportazione del wild-type proinsulina dal RE per produrre insulina bioattiva matura. Inoltre, data la prominenza di RE nello stress nello sviluppo e nella progressione del diabete di tipo 1, di tipo 2, e di alcuni diabete monogenici, le strategie incentrate su alleviare lo stress RE modulando la segnalazione UPR potrebbero fornire nuove opportunità terapeutiche per prevenire o ritardare l'insufficienza delle cellule beta e del diabete.
