Risultati sperimental

Le immagini risultanti dall’osservazione al microscopio a fluorescenza, salvate su supporto fotografico digitale, sono state analizzate tramite un opportuno programma sviluppato in ambiente Matlab®, riportato in App.(2), che ha consentito per ogni immagine il calcolo del gradiente di intensità di luminescenza (I) e dunque la stima della distribuzione di massa genica sul substrato (cfr. Par. 6.3).

Le condizioni sperimentali delle eseguite, mirano a verificare la dipendenza del processo di deposizione di massa dalla concentazione particellare in sospensione e dal tempo.

In fase sperimentale sono state eseguiti diversi test, a causa della non ottimizzazione del protocollo di lavoro in fase iniziale, vengono riportati di seguito i risultati più significativi che confermano la validità del modello analitico sviluppato e simulato.

6.5.1 PROVA # 1

Le condizioni di prova imposte sono:

• concentrazione di oligofluoresceina in soluzione Tris: 25 nM • portata volumetrica: 50 μl/min

• tempo di prova: 10 min di lavaggio con Tris pura + 30 min di flusso soluzione target

In Fig.(6.11.a) è riportata la foto del vetrino cosiddetto bianco esposto a sorgente, prima cioè della prova, e in Fig.(6.11.b) è riportata la foto del vetrino testato; entrambi sono stati ripresi esposti al fascio luminescente del microscopio per poter eseguire successivamente una valutazione differenziale rigorosa.

Fig.(6.11.a): fotografia dell’elemento sensibile “bianco”, nella PROVA #1

L’elaborato Matlab® ci fornisce, nei modi descritti (cfr. Par.6.3), il risultato di Fig.(6.11.c): la curva rossa indica il segnale di rumore che si ha su un vetrino vergine esposto al fascio luminescente; la curva blu e la verde ci forniscono rispettivamente il segnale ottenuto sul vetrino bianco e testato esposti e al medesimo fascio luminoso di cui prima.

Fig.(6.11.b): Andamento del gradiente sull’elemento sensibile vergine (linea rossa) bianco (linea blu) e “testato”(linea verde), nella PROVA #1

Come si nota immediatamente, il gradiente di intensità di luminescenza è in una condizione di assurdo: la luminescenza prima del test risulta superiore a quella post test; i motivi ricadono in un settaggio sbagliato della fotocamera con focus automatico e non bloccato. Le prove riportate a scopo didattico nella questa sequenza sotto indicata, non corrispondono a quella temporale con cui sono state effettuate; sono state eseguite prima le prove #1,#2 e #4 e con protocolli fotografici risultati a posteriori non corretti, non avendoci permesso di modificare in tempo i parametri in questione. Da un’indagine ad occhio nudo, non valida ai fini del lavoro, si nota però una forte massa fluorescente depositata, a conforto per prove successive. Si è comunque costretti ad annullare i risultati del primo test, non andando oltre nell’elaborazione differenziale delle immagini.

6.5.2 PROVA # 2

Le condizioni di prova imposte nella seconda prova sono:

• concentrazione di oligofluoresceina in soluzione Tris: 25 nM • portata volumetrica: 50 μl/min

• numero di giri della pompa peristaltica 15 g/min

• tempo di prova: 10 min di lavaggio con Tris pura + 45 min di flusso soluzione target

In Fig.(6.12.a) è riportata la foto del vetrino cosiddetto bianco esposto a sorgente, prima cioè della prova, e in Fig.(6.11.b) è riportata la foto del vetrino testato.

Fig.(6.12.b): fotografia dell’elemento sensibile “bianco”, nella PROVA #2

L’elaborato Matlab® ci fornisce, nei modi descritti (cfr. Par.6.3), il risultato di Fig.(6.12.c): in questo caso occultiamo la curva rossa ininfluente ai fini del lavoro e con la curva blu e la verde indichiamo come sopra rispettivamente il segnale ottenuto sul vetrino bianco e testato esposti e al medesimo fascio luminescente.

Fig.(6.12.c): Andamento del gradiente sull’elemento bianco (linea blu) e “testato”(linea verde), nella PROVA #1

In questo caso, una volta settata in modo rigoroso la fotocamera , il gradiente di intensità di luminescenza ottenuto, è in una condizione ottimale rispetto ai risultati aspettati: la luminescenza prima del test risulta nettamente inferiore a quella post test; anche da un’indagine ad occhio nudo, non valida ai fini del lavoro, si nota una forte massa fluorescente depositata tipo “monolayer”.

Andando ad eseguire l’elaborazione differenziale delle immagini si ottiene l’andamento di Fig.(6.12.d).

Fig.(6.12.c): Andamento differenziale del gradiente di intensita di luminescenza nella PROVA #2

6.5.3 PROVA # 3

Le condizioni di prova imposte nella terza prova sono:

• concentrazione di oligofluoresceina in soluzione Tris: 250 nM • portata volumetrica: 50 μl/min

• numero di giri della pompa peristaltica 15 g/min

• tempo di prova: 10 min di lavaggio con Tris pura + 30 min di flusso soluzione target

In Fig.(6.13.a) è riportata la foto del vetrino cosiddetto bianco esposto a sorgente e in Fig.(6.13.b) è riportata la foto del vetrino testato.

Fig.(6.13.a): fotografia dell’elemento sensibile “bianco”, nella PROVA#3

Fig.(6.13.b): fotografia dell’elemento sensibile “testato”, nella PROVA #3

L’elaborato Matlab® ci fornisce, nei modi descritti (cfr. Par.6.3), il risultato di Fig.(6.13.c): con la curva blu e la verde indichiamo come sopra rispettivamente il segnale ottenuto sul vetrino bianco e testato esposti e al medesimo fascio luminescente.

Fig.(6.13.c): Andamento del gradiente sull’elemento bianco (linea blu) e “testato”(linea verde), nella PROVA #3

Come detto, come nella PROVA #1 e #4, il gradiente di intensità di luminescenza è in una condizione di assurdo: la luminescenza prima del test risulta superiore a quella post test; i motivi ricadono come prima in un settaggio sbagliato della fotocamera con focus automatico e non bloccato. Da un’indagine ad occhio nudo, non valida ai fini del lavoro, si nota però una forte massa fluorescente depositata, a conforto per prove successive. Si è comunque costretti ad annullare i risultati del primo test, non andando oltre nell’elaborazione differenziale delle immagini.

6.5.4 PROVA # 4

Le condizioni di prova imposte nella quarta prova sono:

• concentrazione di oligofluoresceina in soluzione Tris: 250 nM • portata volumetrica: 50 μl/min

• numero di giri della pompa peristaltica 15 g/min

• tempo di prova: 10 min di lavaggio con Tris pura + 45 min di flusso soluzione target

In Fig.(6.14.a) è riportata la foto del vetrino cosiddetto bianco esposto a sorgente e in Fig.(6.14.b) è riportata la foto del vetrino testato.

Fig.(6.14.a): fotografia dell’elemento sensibile “bianco”, nella PROVA #4

Fig.(6.14.b): fotografia dell’elemento sensibile “testato”, nella PROVA #4

L’elaborato Matlab® ci fornisce, nei modi descritti (cfr. Par.6.3), il risultato di Fig.(6.14.c): con la curva blu e la verde indichiamo come sopra rispettivamente il segnale ottenuto sul vetrino bianco e testato esposti e al medesimo fascio luminescente.

Fig.(6.14.c): Andamento del gradiente sull’elemento bianco (linea blu) e “testato”(linea verde), nella PROVA #4

Come si nota, anche in questo caso, come quello della PROVA #1 e #3, il gradiente di intensità di luminescenza è in una condizione di assurdo: la luminescenza prima del test risulta superiore a quella post test; i motivi ricadono come detto in un settaggio sbagliato della fotocamera con focus automatico e non bloccato. Da un’indagine ad occhio nudo, non valida ai fini del lavoro, si nota però una forte massa fluorescente depositata, a conforto per prove successive. Si è comunque costretti ad annullare i risultati del primo test, non andando oltre nell’elaborazione differenziale delle immagini.