NUOVI DERIVATI DELLE TUBULISINE
derivati 9 per dare gli alcoli 10a-h e 10’a-h come miscele diastereisomeriche che sono state facilmente separate attraverso cromatografia flash In relazione ai risultati precedentemente
6.5 Saggi in vivo
In base al profilo mostrato nell’ambito dei test in vitro, KEMTUB012 è stato selezionato quale
lead della nuova classe di composti da sottoporre alla valutazione in vivo in modelli animali tumorali. Gli esperimenti in vivo sono stati condotti utilizzando femmine di topo nudo atimico Swiss (età 10 settimane, Charles River, Calco, Italia), utilizzando quali riferimenti il veicolo e un’analoga formulazione del chemioterapico di riferimento vinorelbina. Gli animali sono stati stabulati in stanze a flusso laminare a temperatura e umidità costanti. I topi hanno avuto libero accesso a cibo e acqua e gli esperimenti, condotti presso lo stabulario dell’Istituto dei Tumori di Milano, sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dello stesso Istituto Nazionale dei Tumori di Milano, in accordo con le linee guida istituzionali e internazionali.
Le cellule di mesotelioma peritoneale maligno umano (MESOII), provenienti da colture in vitro in monostrato, sono state inoculate sottocute in topi sani (107 cellule/fianco). Quando il volume tumorale è risultato dell’ordine dei 90-100mm3 (4 giorni dall’inoculo), gli animali sono stati randomizzati per il trattamento (7 animali/gruppo sperimentale). Il derivato KEMTUB012, solubilizzato in un veicolo costituito da Cremophor EL (Basf), etanolo ed acqua, è stato somministrato per via endovenosa (i.v.) in un volume di 10 ml/Kg di peso corporeo. Il composto è stato somministrato ogni 4 giorni per 4 volte La crescita tumorale è stata seguita misurando due volte alla settimana i diametri dei tumori. Il volume tumorale (TV) è stato calcolato secondo la formula:
TV = d2xD/2 (d = diametro minore, D = diametro maggiore).
Gli animali sono stati eliminati quando la media dei volumi tumorali ha raggiunto 500-600 mm3. L’efficacia del trattamento è stata valutata in termini d’inibizione del volume tumorale,
in accordo alla seguente formula:
TVI% = 100- (TV medio dei topi trattati/TV medio dei topi controlli x 100).
Gli animali sono stati pesati 2 volte alla settimana allo scopo di evidenziare eventuali differenze di peso, espresse in percentuale rispetto all’inizio del trattamento. Per valutare la tossicità del trattamento è stato preso in considerazione il massimo calo di peso osservato. Gli animali trattati e morti prima del primo controllo, sono stati considerati morti per gli effetti tossici (tossicità letale). Per l’analisi statistica dei risultati, i volumi tumorali degli animali trattati rispetto ai controlli sono stati confrontati utilizzando il test t di Student a due code. Le differenze sono state considerate significative quando P era < 0,05.
Gli effetti determinati dalla somministrazione i.v. del composto KEMTUB012 sono evidenziati dai risultati sperimentali riepilogati in Tabella 5. Alle dosi di 0,100 e 0,125 mg/kg, il nuovo derivato delle tubulisine ha determinato una riduzione del volume notevolmente superiore rispetto a quella indotta dalla somministrazione di vinorelbina alla dose di 5,000 mg/kg. In particolare, il valore di TVI% per KEMTUB012 alla dose di 0,125 mg/kg è risultato pari al 77 %, con una significatività statisticamente rilevante non solo rispetto alla somministrazione del veicolo, ma anche rispetto al chemioterapico di riferimento somministrato ad una dose quaranta volte superiore di quella del nuovo derivato delle tubulisine (P<0,05 vs vinorelbina; P<0,001 vs veicolo). Alle dosi sopracitate, KEMTUB012 non è risultato letale (Tox: 0/n; nessuna morte / numero animali testati) e non ha evidenziato effetti tossici riscontrabili attraverso la perdita di peso. Alle stesse dosi, anche indagini preliminari condotte sugli organi principali (fegato, milza, intestino) degli animali a fine sperimentazione non hanno rilevato effetti riconducibili ad una tossicità del composto in esame.
Tabella 5. Valutazione dell’attività antitumorale in un modello murino di tumore peritoneale maligno umano (Meso II). Trattamento ai giorni 4, 8, 12, 16 dall’inoculo.
Composto Dose (mg/kg) TVI% Perdita Peso % Tox
KEMTUB012 0,100 63 4 0/7
KEMTUB012 0,125 77** ° 5 0/11
Vinorelbina 5,000 40 3 0/11
**P<0,001 vs veicolo; °P<0,05 vs Vinorelbina
6.6 Conclusioni
La ricerca condotta ha consentito di individuare una nuova classe di derivati delle tubulisine naturali ottenibili attraverso un processo di sintesi totale a partire da composti commerciali facilmente reperibili. Il processo di sintesi individuato ed ottimizzato nel corso della ricerca è risultato scalabile, almeno ai fini dell’ottenimento di quantitativi di tubulisine dell’ordine delle centinaia di milligrammi.
I nuovi composti sintetizzati, caratterizzati da opportuni sostituenti (etero)-aromatici o (etero)- ciclici sull’azoto del frammento TUV delle tubulisine, hanno mostrato elevata citotossicità nei confronti di differenti linee tumorali, comprese cellule di tumori intrinsecamente resistenti o con resistenza acquisita ai chemioterapici convenzionali. In particolare, per i nuovi composti
sintetizzati sono stati determinati valori di IC50 dell’ordine del nanomolare o inferiori,
significativamente più bassi rispetto a quelli di Paclitaxel e vinblastina, oltre che inferiori a quelli di tubulisine di riferimento (tubulisine A e U).
L’introduzione dei nuovi sostituenti sul frammento TUV non ha comportato alcun cambiamento sul meccanismo d’azione delle tubulisine. Come nel caso della vinorelbina, i nuovi derivati delle tubulisine hanno infatti mostrato la capacità di inibire la polimerizzazione della tubulina in cellule LoVo.
Anche se attraverso un saggio preliminare, il composto KEMTUB012, selezionato quale lead fra i nuovi derivati sintetizzati, ha mostrato in vivo una significativa attività antitumorale in un L’attività condotta ha confermato le grandi potenzialità dei nuovi derivati delle tubulisine. I risultati preliminari ottenuti dovranno essere ulteriormente approfonditi a valle della presente ricerca, sia relativamente all’impiego dei composti tal quale nell’ambito di modelli animali più completi ed accurati, sia per quanto concerne gli aspetti tossicologici. Un ulteriore aspetto rilevante da valutare potrà inoltre essere rappresentato dalla coniugazione dei nuovi derivati delle tubulisine con anticorpi o frammenti di anticorpi in grado di riconoscere marcatori tumorali per lo sviluppo di nuove strategie antitumorali basate sulla target therapy.
6.7 Referenze
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