Valutazione in vitro dell’attività inibitoria verso differenti metallopeptidasi Determinazione dei parametri cinetic

L’attività inibitoria di NESS002ie e dei composti di riferimento verso NEP, ACE, APN e ECE- 1 è stata valutata attraverso saggi in vitro basati sulla quantificazione della fluorescenza indotta dall’idrolisi di opportuni substrati per azione delle metallopeptidasi sopra indicate. La fluorescenza è stata determinata mediante uno spettrofotometro/ spettrofluorimetro Victor 3 (Perkin Elmer). I parametri cinetici legati all’attività inibitoria nei confronti dei differenti enzimi sono stati determinati in accordo con i metodi precedentemente descritti da Florentin et al.40 _{Allo scopo di determinare la velocità iniziale, le concentrazioni degli enzimi sono state}

scelte in modo da idrolizzare meno del 5% di substrato per unità di tempo. Inoltre sono state impiegate concentrazioni di substrato da 0,2 a 5,0 volte i valori di Km riportati in letteratura.40

I valori sperimentali di Km sono stati determinati mediante regressione non lineare utilizzando

GraphPad Prism (versione 5.00 per Windows). Per valutare l’attività inibitoria dei vari composti, sono stati condotti in una prima fase saggi in assenza degli enzimi (0% di idrolisi) o in assenza degli inibitori (100% di idrolisi). I dati sperimentali rilevati in presenza degli inibitori sono stati rapportati a quelli relativi al 100% di idrolisi al fine di poter determinare i corrispondenti valori di IC50. Attraverso l’equazione di Cheng-Prussof (Ki= IC50 /1 + S / Km), i

valori di IC50 sono stati convertiti in Ki.41 I valori sono stati calcolati come media di tre prove

sperimentali indipendenti, ciascuna delle quali condotta in duplicato. Test di attività della endopeptidasi neutra (NEP)

I test per la valutazione della capacità inibitoria dei composti verso NEP sono stati condotti impiegando: NEP purificata da rene di suino acquistata da Calbiochem, il substrato fluorescente specifico per NEP N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly (DAGNPG) e l’inibitore NEP di

riferimento DL-3-mercapto-2-benzil propanoglicina (DL-tiorfano) forniti da Sigma Aldrich. Per

i saggi sono state preparate soluzioni madri 10-2 _{M in etanolo di DAGNPG, DL-tiorfano, C20}

e NESS002ie. NEP è stata invece solubilizzata in una soluzione tampone a pH=7,4 costituita da Tris/HCl 50 mM e NaCl 150 mM. Le cinetiche di degradazione sono state studiate a 37 °C, utilizzando piastre a 96 pozzetti con fondo nero (PerkinElmer) in volumi finali pari a 100 µL. L’idrolisi del substrato è stata monitorata determinando la fluorescenza a λex = 340 nm e λem = 530 nm. La sperimentazione è stata condotta con concentrazioni di NEP pari a 500 ng/100 µL, pre-incubando l’enzima per 30 minuti a 37 °C prima dell’aggiunta di DAGNPG e degli inibitori. DAGNPG è stato utilizzato alla concentrazione di 58 µM, pari al valore di Km.

La cinetica è stata seguita fino a 60 minuti dall’aggiunta del substrato. Test di attività dell’enzima convertitore dell’angiotensina (ACE)

I test per la valutazione della capacità inibitoria dei composti verso ACE sono stati condotti impiegando: ACE umana ricombinata acquistata da Calbiochem, il substrato fluorescente specifico per ACE o-aminobenzoic acid-Phe-Arg-Lys(2,4-dinitrophenyl)-Pro-OH [Abz- FRK(Dnp)-P-OH] fornito da BIOMOL e l’inibitore ACE di riferimento Captopril (Sigma Aldrich). Per i saggi sono state preparate le seguenti soluzioni madri: (i) ACE è stata solubilizzata in una soluzione acquosa a pH = 7,5 costituita da NaCl 75 mM, Tris 12,5 mM, ZnCl2 500 nM e 40% di glicerolo; (ii) Abz-FRK(Dnp)-P-OH è stato solubilizzato in DMSO

alla concentrazione di 10-2 M; (iii) Captopril, NESS002ie sono stati solubilizzati in acqua alla concentrazione di 10-2 _{M. I test sono stati condotti a 37 °C, utilizzando piastre a 96 pozzetti con}

fondo nero (PerkinElmer) in volumi finali pari a 100 µL. Le cinetiche sono state condotte in soluzione tampone a pH = 7,0 contenente Tris/HCl 100 mM, NaCl 50 mM, ZnCl2 10 µM.

L’idrolisi del substrato è stata monitorata determinando la fluorescenza a λex = 320 nm e λem = 420 nm. La sperimentazione è stata condotta con concentrazioni di ACE pari a 500 ng/100 µL, pre-incubando l’enzima per 30 minuti a 37 °C prima dell’aggiunta di Abz-FRK(Dnp)-P- OH e degli inibitori. Abz-FRK(Dnp)-P-OH è stato utilizzato alla concentrazione di 10 µM, pari al valore di Km. La cinetica è stata seguita fino a 30 minuti dall’aggiunta del substrato.

Test di attività della aminopeptidasi N (APN)

L’attività di APN è stata valutata utilizzando: leucina aminopeptidasi APN purificata da rene di suino, il substrato specifico per APN cloridrato di L-Leucin 7-amido-4-metil cumarina (Leu-

AMC), l’inibitore APN di riferimento Amastatina, forniti da Sigma Aldrich. E’ stata preparata una soluzione madre di APN solubilizzando l’enzima in una soluzione acquosa a pH=7,7 contenente (NH4)2SO4 3,5 M e MgCl2 10 mM. Soluzioni madre di Leu-AMC, Amastatina e

NESS002ie sono state preparate in metanolo alla concentrazione di 10-2 M. I test sono stati condotti a 37 °C, utilizzando piastre a 96 pozzetti con fondo nero (PerkinElmer) in volumi finali pari a 100 µL. Le cinetiche sono state condotte in soluzione tampone a pH = 8,0 contenente Tris/HCl 100 mM. L’idrolisi del substrato è stata monitorata determinando la fluorescenza a λex = 355 nm e λem = 460 nm. La sperimentazione è stata condotta con concentrazioni di APN pari a 500 ng/100 µL, pre-incubando l’enzima per 30 minuti a 37 °C prima dell’aggiunta di Leu-AMC e degli inibitori. Il substrato è stato utilizzato alla concentrazione di 35 µM, pari al valore di Km. La cinetica è stata seguita fino a 30 minuti dall’aggiunta di Leu-AMC.

Test di attività dell’enzima convertitore dell’endotelina (ECE-1)

I test per la valutazione della capacità inibitoria dei composti verso ECE-1 sono stati condotti impiegando: ECE-1 umana ricombinata ed il substrato fluorescente specifico per ECE-1 7- metossicumarin-4-acetil-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(2,4-dinitrofenil)-OH [Mca- RPPGFSAFK(Dnp)-OH] forniti da R&D Systems, l’inibitore ECE-1 di riferimento Phosphoramidon acquistato da Sigma Aldrich. E’ stata preparata una soluzione madre di ECE- 1 solubilizzando l’enzima in una soluzione acquosa a pH = 8,0 contenente NaCl 0,15 M e Tris/HCl 25 mM. Soluzioni madre di Mca-RPPGFSAFK(Dnp)-OH, Phosphoramidon e NESS002ie sono state preparate in DMSO alla concentrazione di 10-2 _{M. I test sono stati}

condotti a 37 °C, utilizzando piastre a 96 pozzetti con fondo nero (PerkinElmer) in volumi finali pari a 100 µL. Le cinetiche sono state condotte in soluzione tampone a pH = 6,0 contenente

MES 0,1 M e NaCl 0,1 M. L’idrolisi del substrato è stata monitorata determinando la fluorescenza a λex = 340 nm e λem = 405 nm. La sperimentazione è stata condotta con concentrazioni di ACE pari a 500 ng/100 µL, pre-incubando l’enzima per 30 minuti a 37 °C prima dell’aggiunta di Abz-FRK(Dnp)-P-OH e degli inibitori. Abz-FRK(Dnp)-P-OH è stato utilizzato alla concentrazione di 10 µM, pari al valore di Km. La cinetica è stata seguita fino a

60 minuti dall’aggiunta del substrato.

3.2.3 Saggi in vivo per la valutazione dell’attività analgesica dei nuovi inibitori delle