terminale di Tuv è funzionalizzato con un sostituente N,O-acetalico con differenti funzioni esteree, altamente insolito per questo tipo di strutture (Figura 1)

R2 N S N H O N R3 O H N R1 O OH O N Me

Mep Ile Tuv Tup/Tut

Tubulisina R1 R2 R3 A OH OC(O)CH3 CH2OC(O)-isobutile B OH OC(O)CH3 CH2OC(O)-n-propile C OH OC(O)CH3 CH2OC(O)-etile D H OC(O)CH3 CH2OC(O)-isobutile E H OC(O)CH3 CH2OC(O)-n-propile F H OC(O)CH3 CH2OC(O)-etile G OH OC(O)CH3 CH2OC(O)CH=C(CH3)2 H H OC(O)CH3 CH2OC(O)-metile I OH OC(O)CH3 CH2OC(O)-metile U H OC(O)CH3 H V H H H Y OH OC(O)CH3 H Z OH H H

Figura 1. Struttura chimica delle tubulisine naturali.

Le basse rese del processo biotecnologico e le ridotte concentrazioni derivanti dall’estrazione delle tubulisine naturali dai brodi di coltura hanno limitato lo sviluppo preclinico di questa classe di composti particolarmente promettenti per la chemioterapia. Tuttavia nel corso degli ultimi anni questa area di ricerca ha suscitato grande interesse, soprattutto per quanto concerne l’individuazione e lo sviluppo di nuove strategie di medicinal chemistry, basate su processi ad alte rese e facilmente scalabili, in grado di assicurare l’ottenimento di composti con strutture coincidenti con quelle delle tubulisine naturali o di analoghi con citotossicità equivalente a quella dei composti naturali di riferimento. Le difficoltà maggiormente evidenziate nell’ambito degli approcci sintetici investigati hanno riguardato in particolare l’inserimento della catena N,O-aminoacetalica, estremamente delicata sia in condizioni acide che basiche, oltre che la sensibilità e i vincoli configurazionali del frammento TUV contenente l’anello tiazolico.6

Le procedure sintetiche sviluppate hanno riguardato in particolare l’ottenimento delle tubulisine U e V,5,7-11 caratterizzate da struttura chimiche esemplificate rispetto a quelle degli omologhi a

maggiore citotossicità, quale ad esempio la tubulisina A. Sono stati inoltre riportati processi di sintesi relativi all’ottenimento delle tubulisine B e D che hanno in ogni caso evidenziato limiti significativi in termini di resa e di scalabilità.12-13

Le strategie sintetiche adottate dai diversi gruppi di ricerca hanno previsto l’assemblaggio della struttura tetrapeptidica attraverso reazioni di coupling dei diversi frammenti amminoacidici (Figura 2). I limiti dei processi preparativi riportati nella letteratura di riferimento non hanno riguardato le reazioni di coupling, ma essenzialmente la costruzione del frammento Tuv, con particolare riferimento all’introduzione del sostituente sull’azoto N- terminale e alla definizione della stereochimica richiesta.

OH N S NH2 O N H O H N O OH O N Cbz

Mep Ile Tuv Tup

N H Boc Boc OH Boc OH

Figura 2. Frammenti aminoacidici impiegati per la sintesi attraverso reazionio di coupling della tubulisina V.

In relazione alle potenzialità di questa classe di composti quali nuovi chemioterapici, soprattutto nel trattamento di tumori con resistenza innata o acquisita verso i chemioterapici ad oggi utilizzati nella pratica clinica, e sulla base dei risultati finora raggiunti relativamente allo sviluppo di adeguati processi sintetici per l’ottenimento di tubulisine o di analoghi ugualmente citotossici e attivi, risulta evidente l’interesse scientifico e applicativo nell’individuazione di nuove strategie di medicinal chemistry in grado di superare i limiti sopra esplicitati.

A partire dalle differenti procedure sintetiche riportate nella letteratura di riferimento, nel corso della presente ricerca si è voluto intervenire al fine di individuare ed ottimizzare una procedura di sintesi totale che potesse portare all’ottenimento di quantitativi significativi (centinaia di milligrammi) di derivati delle tubulisine naturali. La ricerca è stata condotta in collaborazione con la società KemoTech Srl, localizzata presso le strutture del Parco Scientifico e Tecnologico della Sardegna di Pula (CA). Attraverso il procedimento sviluppato, si è voluto inoltre avviare uno studio struttura/attività mirato all’individuazione di potenziali leads da sviluppare a valle della presente ricerca quali nuovi chemioterapici. Sulla base di precedenti studi, l’approccio

SAR è stato condotto mantenendo fissa la stereochimica dei differenti frammenti, oltre che il gruppo isopropilico sulla porzione della Tuv, ed ha riguardato in particolare la valutazione dell’effetto del sostituente R1 _{sulla citotossicità dei composti verso differenti linee cellulari}

tumorali (Classe 1; Figura 3). Precedenti studi SAR hanno infatti evidenziato l’influenza della stereochimica dei vari stereocentri distribuiti lungo la catena peptidica delle tubulisine, così come del gruppo isopropilico presente nel frammento della tubuvalina e del gruppo benzilico, eventualmente sostituito con gruppi opportuni, del frammento della Tup/Tut, nel determinare un’elevata citotossicità dei derivati delle tubulisine.14-16

Una valutazione ulteriore della presente ricerca ha riguardato lo studio dell’eventuale effetto sulla citotossicità dei composti correlato all’introduzione di un atomo di fluoro sul benzile della porzione della Tup.

O N S N H O N R1 O H N X O OH O N Me 1 O

Figura 3. Struttura chimica generale dei derivati delle tubulisine sintetizzati nel corso della ricerca (X: H o F; R1_{: fenile, benzile, metil-cicloalchili, metil-eteroarili, metil-eterocicloalchili).}

I composti sintetizzati sono stati sottoposti ad opportuni saggi in vitro basati sull’uso di diverse linee cellulari. Tra queste sono state utilizzate anche linee cellulari di tumori caratterizzati da fenotipi di resistenza acquisita nei confronti di chemioterapici convenzionali.

In relazione ai profili individuati attraverso i saggi in vitro, tra i nuovi composti studiati è stato selezionato un lead compound con il quale sono stati condotti sia test mirati a valutarne il meccanismo d’azione che saggi in vivo al fine di verificarne le potenzialità terapeutiche.

6.2 Sintesi dei composti

La sintesi del frammento Tuv è stata avviata a partire dalla generazione dell’anello tiazolico. L’estere etilico della L-Cisteina cloridrata 2 è stato condensato con metil gliossale in presenza di carbonato di sodio, ottenendo la 2-acetil-4-etossicarboniltiazolidina 3 (instabile a temperature superiori ai 30°C in etanolo). Questa è stata solubilizzata in CH3CN e ossidata con

MnO2 a 65°C con l’ottenimento del 2-acetil tiazolo 4, con una resa del 52% sui due passaggi

sintetici. Il tiazolo 4, è stato quindi sottoposto a condensazione aldolica con isobutirraldeide in THF anidro, utilizzando come catalizzatore l’acido di Lewis TiCl4, Et3N a -78°C per un’ora.

Successivamente la miscela di reazione è stata portata a temperatura ambiente per ottenere così il tiazolil chetone α,β insaturo 5 con una resa del 70% (Schema 1).

O N S OEt O O H N S OEt O HCl H2N COOEt SH _{(a) (b)} 52% in due step 2 3 4 (c) O N S OEt O 5

Schema 1. Reagenti e condizioni: (a) metil gliossale, NaHCO3, EtOH-H2O (1:1), o.n; (b)

MnO2, MeCN, 65°C, o.n; (c) isobutirraldeide, TiCl4, Et3N, THF anidro, da -78°C a T.amb.

Con l’intento di ampliare gli studi SAR su nuovi derivati tubulisinici, si è pensato di variare la natura dei sostituenti sull’azoto presente nel frammento Tuv. A tal proposito, sono stati scelti una serie di derivati amminici 6 in cui il sostituente R1 era costituito da raggruppamenti alchilici, arilici, etero alchilici ed eteroarilici. Le ammine 6 sottoposte a reazione con il derivato acilico 7 enantiomericamente puro, a 0°C in presenza di diisopropiletilammina, hanno portano all’ottenimento degli azido derivati 8a-h, con rese comprese tra 80 e 99% (Schema 2).

Attraverso la reazione di addizione Aza-Michael tra i derivati 8a-h e il derivato α,β insaturo 5, è stato possibile inserire il gruppo amminico originario nel frammento Tuv con ottenimento dei β-amino chetoni 9a-h. Questi sono stati recuperati come miscela diastereoisomerica, in cui il rapporto tra i due diastereisomeri è risultato differente in relazione alla tipologia di sostituente R1 _{presente nell’azido derivato 8. Al fine di ottenere i frammenti Tuv stereochimicamente puri,}

è stata condotta una riduzione asimmetrica della funzione chetonica mediata da ossazaborolidine chirali (riduzione di Corey-Bakshi-Shibata, CBS catalizzata). L’(S)-CBS, in presenza del complesso BH3•Me2S, ha infatti reagito quasi esclusivamente con la faccia Si dei

derivati 9 per dare gli alcoli 10a-h e 10’a-h come miscele diastereisomeriche che sono state