Saggio Freelite

Il saggio Freelite (The Binding Site, UK), realizzato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti d’America nel 2001, utilizza antisieri policlonali che riconoscono specificamente e quantificano separatamente le FLC ĸ e le FLC λ nel siero, permettendo il calcolo del rapporto FLC kappa/lambda che è utilizzato per determinare la clonalità [Palladini et al., 2009; Bakshi NA et al., 2005].

I risultati sono considerati normali se rientrano negli intervalli stabiliti [Katzmann et al., 2002] riportati di seguito:

- sFLC ĸ: 3.3-19.4 mg/L - sFLC λ: 5.7-26.3 mg/L - rapporto FLC ĸ/λ: 0.26-1.65

Il rapporto ĸ/λ è utilizzato per distinguere un aumento di FLC in senso policlonale o monoclonale. In caso di proliferazione policlonale, come in malattie infettive o autoimmuni, risultano aumentate le concentrazioni delle FLC sia ĸ che λ, per cui il rapporto ĸ/λ risulta inalterato. Mentre in caso di proliferazione monoclonale, come si verifica nelle gammopatie monoclonali, l’eccessiva produzione clonale di un unico tipo di FLC, con soppressione nella produzione dell’altra catena leggera alternativa, porta spesso ad uno sbilanciamento del rapporto κ/λ.

Il saggio immunologico Freelite, amplificato in lattice, migliora la sensibilità del test, permettendo di misurare concentrazioni di FLC nel siero molto basse come 1.5 mg/L per FLC-ĸ e 3 mg/L per FLC-λ, valori inferiori alle normali concentrazioni sieriche [Katzmann et al., 2002]. In realtà il metodo Freelite presenta dei limiti quali la non assoluta specificità nei confronti delle FLC rispetto a quelle

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legate, la variabilità tra i diversi lotti di reagente e una ridotta linearità nelle diluizioni delle FLC monoclonali [Tate et al., 2009].

La quantificazione indipendente delle sFLC ĸ e λ è resa possibile dall’utilizzo di antisieri policlonali, ottenuti da pecore tollerizzate nei confronti degli antigene di superficie delle catene leggere legate alle immunoglobuline complete attraverso protocolli di tollerizzazione. Le pecore rese tolleranti sono state successivamente immunizzate con le proteine ĸ e λ purificate da urine contenenti le proteine di Bence Jones, producendo così anticorpi policlonali che riconoscono con alta affinità e in modo specifico gli epitopi esposti della catena leggera quando essa non è associata alla catena pesante dell’immunoglobulina. Per cui gli epitopi sono accessibili soltanto quando la catena leggera non è associata alla catena pesante come mostrato nella Figura 10.

FIGURA 10. Struttura di una molecola di anticorpo a sinistra, a destra sono mostrati i target del saggio Freelite. Immagine tratta dal sito wikilite.TheBindingsite.

La scelta dell’utilizzo di antisieri policlonali deriva dal fatto che le FLC monoclonali sono eterogenee tra di loro (a causa della ricombinazione genetica, variazioni isotipiche e allotipiche, ipermutazione somatica della regione variabile dopo l’esposizione dell’antigene) e ciò permette il riconoscimento dei diversi epitopi delle FLC monoclonali prodotti dai pazienti affetti da gammopatie monoclonali piuttosto che l’utilizzo di anticorpi monoclonali che riconoscono un unico epitopo [Ellen, 2014]. In realtà alcuni gruppi hanno sviluppato saggi immunologici per le FLC con anticorpi monoclonali [Velthius et al., 2012] e anche se un gran numero di studi clinici ancora siano richiesti per accertare la loro utilità clinica, alcuni risultati pubblicati non sono riusciti a dimostrare la loro equivalenza clinica rispetto ai saggi che utilizzano anticorpi policlonali [Drayson and Carr, 2012].

Esistono comunque degli svantaggi per la quantificazione delle sFLC legati all’uso di antisieri policlonali nei saggi immunochimici, che richiedono l’uso del nefelometro e del turbidimetro, quali:

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l’aspecificità dell’anticorpo anti-IgG, IgA o IgM per la componente monoclonale (CM) che non è in grado di discriminare tra immunoglobuline monoclonali e policlonali, né tra le differenti componenti monoclonali qualora sul tracciato ne siano presenti più di una della stessa classe ed è importante nel monitoraggio dei pazienti con MM e MW in quanto con la progressione della malattia l’incremento della CM si associa alla riduzione della quota policlonale dell’immunoglobulina [Merlini et al., 1997]; la mancanza di commutabilità tra il calibratore policlonale del saggio e la CM del campione infatti il calibratore reagisce con l’antisiero nel saggio in maniera differente dalla CM del campione generando dei segnali scarsamente confrontabili [Merlini et al., 1997]; un altro problema è che gli epitopi di ciascuna CM sono riconosciuti solo da una piccola parte degli anticorpi policlonali dell’antisiero e ciò espone il sistema analitico al rischio di eccesso di antigene, soprattutto se la CM è di notevole entità [Merlini et al., 1997]; inoltre vi è una differente risposta del saggio alle differenti forme molecolari nelle quali si può presentare la CM, come nell’aggregazione delle IgM pentameriche che in immunonefelometria mostrano una sovrastima di circa l’80% rispetto alla quantificazione sul tracciato EF a causa della struttura della CM IgM che aumenta la diffusione della luce incidente amplificando di conseguenza il segnale rilevato [Murray et al, 2009].

Questi problemi analitici descritti sono comuni anche all’altro saggio immunologico prodotto dalla ditta The Binding Site ovvero il saggio Hevylite che utilizza anticorpi policlonali in grado di riconoscere gli epitopi conformazionali esposti tra la regione costante delle catene pesanti e la regione costante delle catene leggere delle immunoglobuline. Questi anticorpi identificano per le IgG, IgA e IgM, le immunoglobuline montanti catene ĸ e quelle montanti catene λ, permettendo quindi la determinazione specifica di IgG ĸ e IgG λ, IgA ĸ e IgA λ, IgM ĸ e IgM λ e il calcolo del rispettivo rapporto ( IgG ĸ/ IgG λ, IgA ĸ/ IgA λ, IgM ĸ/ IgM λ) [Harding et al., 2013].

Per la produzione di anticorpi policlonali, le pecore sono immunizzate con singole immunoglobuline monoclonali di una singola classe e tipo di catena leggera (ad esempio, IgG ĸ) [Bradwell et al.,2009]. Le pecore sono contemporaneamente rese tolleranti con: immunoglobulina monoclonale della stessa classe ma montante la catena opposta (IgG λ); immunoglobuline monoclonali di differente classe ma stesso tipo di catena leggera (IgA ĸ); e catene leggere libere monoclonali dello stesso tipo della catena leggera (FLC ĸ). Gli antigeni per l’immunizzazione e tollerizzazione sono ottenuti e purificati da siero e urine di pazienti affetti da gammopatie monoclonali.

Dato che le caratteristiche di attendibilità analitica per il saggio Hevylite non sono ancora state valutate e descritte in letteratura non è raccomandato per la quantificazione della componente monoclonale nella pratica clinica.

In conclusione, le linee guida internazionali per la quantificazione delle FLC nel siero si basano su risultati ottenuti con il saggio Freelite e la determinazione delle FLC nel siero e la stima del rapporto

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ĸ/λ sono stati definiti, dall’International Myeloma Working Group, i parametri per lo screening, la stratificazione prognostica e il monitoraggio della terapia del mieloma multiplo e delle altre discrasie plasmacellulari.