Western blot

La tecnica SDS-PAGE è una delle tecniche più utilizzate per l’analisi e la caratterizzazione di miscele proteiche; essa tuttavia offre informazioni limitate rispetto all’identità delle proteine, aspetto superato mediante il trasferimento elettrico delle proteine separate nel gel su di una membrana, di solito nitrocellulosa, sulla quale si procede alla rilevazione immunologica per mezzo di anticorpi specifici.

Dopo la corsa elettroforetica, il gel di acrilamide è stato tolto dalla camera elettroforetica e immerso nel tampone di trasferimento per 10 minuti. A parte sono stati equilibrati in tampone di trasferimento anche la membrana di nitrocellulosa, due fogli di carta assorbente e le spugnette che serviranno per la composizione del sandwich che, racchiuso tra due supporti di plastica perforati, è inserito nell’apparecchio di trasferimento riempito di tampone. Il trasferimento è stato eseguito ad una corrente costante di 200 mA per 1 ora e 30 minuti. Al termine, il sandwich è stato smontato e la nitrocellulosa è stata incubata con una soluzione bloccante di latte scremato in polvere al 5% (w/v) in tampone fosfato di Dulbecco contenente tween-20 0.01% v/v ( PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente in lieve agitazione in modo tale da bloccare tutti i siti di interazione idrofobica presenti sulla nitrocellulosa. Dopo tre lavaggi in PBS-T la nitrocellulosa è stata incubata per tutta la notte a 4°C, in leggera agitazione, con una soluzione di anticorpo primario diretto contro la proteina di interesse. Per rivelare le FLC-λ è stato usato un anticorpo anti catene leggere di tipo λ diluito 1:1000 in PBS-T. Per rilevare le FLC-κ è stato usato un anticorpo anti catene leggere di tipo κ diluito 1:1000 in PBS-T. Entrambe le preparazioni sono anticorpi policlonali ottenuti in coniglio (Siemens Healthineers, Italia).

La mattina successiva la soluzione di anticorpo primario è stata recuperata e conservata in frigo alla temperatura di 4°C mentre la nitrocellulosa è stata lavata con PBS-T per rimuovere l’anticorpo primario in eccesso. Per visualizzare il legame proteina-anticorpo primario, la nitrocellulosa è stata incubata per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo secondario coniugato con la perossidasi di rafano (Anti-Rabbit IgG HRP-linked, Cell Signaling) diluito 1:5000 in PBS-T con 2,5% w/v di latte scremato in polvere.

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I complessi antigene-anticorpo sono stati visualizzati mediante una reazione di chemiluminescenza. Per ottenere ciò, la nitrocellulosa è stata incubata per 1 minuto con una soluzione di un substrato chemiluminescente ( BM chemiluminescence blotting substrate, Roche Diagnostics) per la perossidasi. Il segnale che si sviluppa è stato acquisito con lo strumento Chemi Doc (Bio-Rad) dotato di una telecamera digitale.

4.4 Nefelometria

La Nefelometria è una tecnica di analisi quantitativa che permette la quantificazione di specifiche proteine presenti in un campione biologico mediante reazione immunochimica. Si basa sulla formazione di complessi antigene-anticorpo, che diffondono, proporzionalmente alla loro quantità, un raggio di luce. Il campione da analizzare, l’antigene, opportunamente diluito viene aggiunto alla cuvetta di reazione contenente la soluzione con l’anticorpo specifico, fornito dalla ditta. L’antigene da ricercare, se presente, reagisce con l’anticorpo specifico, portando alla formazione di un immunocomplesso. Al termine della reazione si procede alla valutazione della luce diffusa dalla sospensione a 90° rispetto a quella della radiazione incidente effettuando così la misura nefelometrica. La lunghezza d’onda del raggio incidente utilizzato dallo strumento durante questo lavoro è di 840 nm.

La distribuzione dell’intensità della luce diffusa dipende dal rapporto tra le dimensioni delle particelle dei complessi antigene-anticorpo e la lunghezza d’onda di lettura. L’intensità della luce diffusa misurata è, in condizioni controllate, proporzionale alla quantità di complessi antigene- anticorpo nel campione. Con un calibratore, fornito dalla ditta, contenente una quantità nota di analita viene creata una curva di calibrazione sulla quale vengono valutati i segnali della luce diffusa dagli immunocomplessi in modo da ricavare la concentrazione degli antigeni.

Per la quantificazione delle catene leggere libere κ e λ, sia in campioni di siero sia in quelli di urina, è stato utilizzato il nefelometro BNII della ditta Siemens Healthineers.

Il dosaggio delle FLC κ e λ è stato eseguito sia con il reattivo Freelite (The Binding Site) costituito da una preparazione di anticorpi policlonali specifici per le FLC, sia con il reattivo per le catene leggere totali (Siemens Healthineers). La miscela di anticorpi policlonali presenti in quest’ultimo permette il riconoscimento sia delle FLC sia delle catene leggere legate alla catena pesante dell’immunoglobulina.

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Risultati

Dei campioni di urina contenenti esclusivamente FLC, 21 presentavano FLC di tipo ĸ e 11 di tipo λ. Ciascun campione è stato sottoposto a SDS-PAGE in presenza o in assenza del riducente β- mercaptoetanolo per verificare se gli stati di aggregazione delle FLC fossero mantenuti da ponti di solfuro. Gli oligomeri e monomeri di FLC presenti nei campioni sono stati quindi evidenziati con anticorpi specifici in western-blot. Di seguito sono riportati in tabella i campioni contenenti FLC-ĸ e i campioni contenenti FLC-λ.

49 Tabella di campioni urinari contenenti solo FLC-κ.

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5.1

Caratterizzazione delle FLC-λ in campioni di urina di pazienti affetti da

mieloma multiplo

L’analisi degli 11 campioni contenenti solo FLC-λ, in assenza del riducente β-mercaptoetanolo, ha messo in evidenza che la forma predominante di FLC-λ è quella monomerica, infatti essa è la sola forma rilevabile in 5 campioni. Il peso molecolare (PM) apparente di questo monomero è 25 kDa in 3 campioni e poco superiore in 2. Come mostrato nella figura sottostante l’azione del β- mercaptoetanolo su questa forma molecolare non ha nessun effetto sul PM osservato.

In due campioni insieme alla forma monomerica è presente un altro stato di aggregazione di FLC-λ rilevabile intorno ai 50 kDa (un esempio è riportato nella figura sottostante dal Paziente 45), in un campione è presente uno stato di aggregazione rilevabile tra i 37 e i 50 kDa, invece 3 campioni presentano tre stati di aggregazione rilevabili a 25 kDa, 37 kDa e 50 kDa (un esempio è riportato dal Paziente 16). Gli stessi campioni trattati però con il riducente mettono in evidenza che i diversi stati di aggregazione delle FLC-λ sono mantenuti da ponti di solfuro: infatti il β-mercaptoetanolo riducendo il ponte di solfuro risolve l’oligomero portandolo a 25 kDa, peso molecolare atteso della forma monomerica.

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5.2 Caratterizzazione delle FLC-ĸ in campioni di urina in pazienti affetti da

mieloma multiplo

L’analisi dei 21 campioni contenenti solo FLC-ĸ in assenza del riducente β-mercaptoetanolo, ha messo in evidenza che la forma predominante di FLC-ĸ è quella monomerica, che è la sola ad essere presente in 7 campioni, il cui peso molecolare è stato rilevato prevalentemente intorno ai 20 kDa, 4 campioni presentavano una seconda banda a 25 kDa. In condizioni riducenti, invece, è evidente un’unica banda al PM di 25 kDa, perciò si ipotizza che il β-mercaptoetanolo agisca solo sulla mobilità elettroforetica della banda presente a 20 kDa (in condizioni non riducenti), come si può osservare nella figura sottostante.

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Negli altri campioni esaminati in aggiunta alle forme monomeriche di FLC-ĸ, in condizioni non riducenti, sono presenti delle bande con PM compreso tra 37 e 50 kDa, indicative della presenza di oligomeri. In condizioni riducenti queste bande non sono visibili, ed è rilevabile sono un segnale in corrispondenza dei 25 kDa.

In unico campione è stata rilevata la presenza di diverse forme di aggregazione di FLC-ĸ: a 20 kDa, 37 kDa e 50 kDa. In due campioni, oltre alla banda relativa ai 20 kDa e ai 37 kDa, si rileva un segnale in corrispondenza dei 75 kD: probabilmente corrispondente a forme oligomeriche o a un frammento di immunoglobuline (1 catena pesante associata a 1 catena leggera). Nell’immagine seguente sono riportati degli esempi.

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Di notevole interesse è il comportamento di due campioni. In un campione soltanto l’azione del riducente ha reso possibile il riconoscimento della catena leggera da parte dell’anticorpo primario, come mostrato nell’immagine seguente dopo un’esposizione di 10 minuti.

In un altro campione è presente una banda rilevabile a 50 kDa nel campione senza riducente, che rimane presente in condizioni riducenti. Aumentando la quota del β-mercaptoetanolo di due, cinque e 10 volte o in condizioni riducenti ma con l’aumento della quota del denaturante SDS di due, cinque e 10 volte la presenza della banda è visibile sempre a 50 kDa probabilmente dovuta ad una cross- reattività dell’anticorpo primario con un’altra proteina di peso molecolare simile. L’immagine dell’esperimento è stata riportata di seguito.

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5.3 Caratterizzazione delle FLC in campioni di urina e di siero

Si è deciso di confrontare i campioni di urina e di siero di uno stesso paziente e ottenuti nella stessa data, per vedere se la diversa matrice potesse influire sullo stato di aggregazione delle FLC.

Confrontando i campioni di siero e di urina del paziente 16, che presenta esclusivamente FLC-λ, è stato visto che le FLC-λ nei due fluidi biologici hanno lo stesso comportamento: in assenza di riducente si evidenziano monomeri di FLC-λ in corrispondenza del PM di 25 kDa mentre gli oligomeri hanno una mobilità elettroforetica in corrispondenza dei PM standard di 37 kDa; in condizioni riducenti invece si visualizza un’unica banda in corrispondenza di 25 kDa. Nel campione di siero in aggiunta è presente una banda in corrispondenza dei 150 kDa, corrispondente alle immunoglobuline intere (2 catene pesanti associate a 2 catene leggere). L’immagine dell’esperimento è stata riportata di seguito nella figura A.

A

B

Confrontando i campioni di siero e di urina del paziente 37, che presenta esclusivamente FLC-κ , è stato visto che le FLC-κ nei due fluidi biologici hanno lo stesso comportamento: nel campione di urina le forme monomeriche si trovano in corrispondenza dei 20 kDa mentre gli oligomeri hanno una mobilità elettroforetica compresa tra gli standard di PM di 37 e 50 kDa. In aggiunta nel campione di siero si evidenziano una serie di bande comprese tra i 50 kDa e i 200 kDa, probabilmente dovuto ad un’alterazione della struttura quaternaria dell’immunoglobulina o ad aggregati di FLC . Gli oligomeri sia nel campione di urina sia in quello di siero sotto l’azione del riducente si risolvono in un’unica banda in corrispondenza dei 25 kDa come mostrato nell’immagine B.

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Conclusioni

Dai risultati ottenuti è emerso che nei campioni di urina le catene leggere libere di tipo kappa (κ) e lambda (λ) si trovano sia sotto forma di monomeri sia di oligomeri.

In SDS-PAGE, i monomeri di FLC-λ presentano una mobilità elettroforetica corrispondente al PM atteso di 25 kDa indipendentemente dalle condizioni riducenti o no. I monomeri FLC-κ invece hanno un comportamento peculiare, infatti si comportano come atteso solo in condizioni riducenti, migrando al PM di 25 kDa, mentre in assenza di β-mercaptoetanolo mostrano un PM intorno ai 20 kDa. Il diverso comportamento osservato potrebbe essere dovuto alla presenza di un ponte disolfuro intra-catena che conferisce al monomero una conformazione tale da permettergli di migrare come una molecola di PM inferiore in condizioni non riducenti.

Sono state, inoltre, rilevate forme di aggregazione sia per le FLC-κ che per le FLC-λ che presentano una mobilità elettroforetica pari a PM di 37 kDa, 50 kDa e 75 kDa. In condizioni riducenti esse si risolvono in un’unica banda in corrispondenza dei 25 kDa confermando che gli stati di aggregazione delle FLC sono mantenuti da ponti disolfuro.

Per verificare se la matrice biologica possa influire sugli stati di aggregazione sono stati confrontati campioni di urina e di siero appartenenti allo stesso paziente. I dati, seppur preliminari perché ottenuti su pochi casi, indicano che il diverso ambiente presente nelle urine non sembrerebbe alterare le forme di aggregazione delle FLC presenti in circolo, suggerendo quindi che lo studio dei campioni di urina sia rappresentativo dello stato delle catene leggere libere sieriche.

Alcuni problemi che emergono nello studio delle FLC in campioni di siero sono l’elevata concentrazione di proteine e la visualizzazione di una serie di bande che migrano nell’intervallo di PM tra i 50 kDa e i 200 kDa. Uno studio recente condotto da Zhu e collaboratori [2013] dimostra che in presenza di SDS, ma non di β-mercaptoetanolo, la struttura quaternaria dell’immunoglobulina possa essere alterata. Secondo questo studio la parziale denaturazione dovuta alla presenza di SDS comporterebbe l’esposizione di gruppi sulfidrilici che possono interferire con i ponti disolfuro caratteristici della struttura quaternaria dell’immunoglobulina. Il risultato di questo fenomeno sarebbe la formazione di omodimeri di catene pesanti o eterodimeri di catene pesanti e leggere.

Revisionando i western blot relativi ai soli campioni di urine è stato notato inoltre che solo nei campioni corsi in condizioni non riducenti le bande visualizzate all’altezza di 25 kDa circa presentano una deformazione laterale, più frequentemente evidente nei campioni con catene leggere libere lambda. Anche in questo caso non è possibile escludere completamente un artefatto dovuto alla parziale denaturazione indotta del detergente SDS; non è possibile neanche escludere che si verifichi una parziale diffusione del β-mercaptoetanolo presente nei campioni caricati nelle corsie adiacenti.

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Infatti il β-mercaptoetanolo può diffondere nelle corsie adiacenti durante l’elettroforesi [Hansen and Wither, 2009].

La possibilità che una parte delle osservazioni possa essere influenzata dalla presenza di artefatti sperimentali andrà approfondita. In particolare si pensa di verificare i risultati analizzando nuovamente i campioni in condizioni non riducenti, ma introducendo nella preparazione del campione per l’elettroforesi un agente alchilante specifico per i gruppi sulfidrilici e impedire così il riarrangiamento dei ponti disolfuro.

I due agenti alchilanti che si possono utilizzare sono la N-etilmaleimmide (NEM) e la iodoacetammide. L’agente alchilante sarà aggiunto alla soluzione tampone a pH 6.8 che si usa per preparare il campione per l’elettroforesi. A questo valore di pH la NEM forma un legame stabile e specifico con i gruppi tiolo, mentre la iodoacetammide reagisce anche con i gruppi ammino. Per tale motivo è stato scelto di utilizzare la NEM per gli esperimenti futuri.

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