Saggio istochimico GUS

Il saggio GUS (Saggio di attività β-glucuronidasica) è una tecnica utile per indagare l’attività di un promotore in termini di espressione di un gene sotto il controllo del suo promotore, permettendo inoltre di localizzare l’attività del gene tramite una colorazione differenziale. Il costrutto di pRHA1::GUS è stato realizzato amplificando mediante PCR (primer AtRHA1 F3 e R2) un frammento di 1164 bp dal DNA genomico di Arabidopsis thaliana , contenente la regione del promotore di RHA1. Il DNA è stato clonato tra i siti HindIII ed NcoI del pGEMT-Easy Vector, e successivamente subclonato nel sito HindIII e NcoI del vettore binario pCAMBIA3301. Il vettore è stato poi introdotto nel ceppo di A. tumefaciens GV3101 (pMP90) mediante elettroporazione. Le piante selvatiche di Arabidopsis ecotipo Wassilewskjia, sono state trasformate per infiltrazione sotto vuoto (Bechthold et al., 1998), come descritto nel paragrafo 4.6.9. Le piante omozigoti, della generazione T3, sono state identificate tramite analisi di segregazione e queste ultime piante sono state utilizzate per la colorazione GUS. Per tutti gli esperimenti, quattro linee indipendenti trasformate sono state utilizzate. Le piantine contenenti il costrutto pRHA1::GUS sono state coltivate su piastre di agar 1.5%, per 3 giorni in camera di crescita. Quattro piastre contenti le piantine sono state ruotate di 90° in senso antiorario rispetto alla verticale e fatte crescere per ulteriori 3 giorni (per produrre una gravistimolazione); altre quattro piastre sono state poste su di un clinostato 2-D per 6 ore a

60 s-1; ulteriori quattro piastre sono state preparate con un terreno contenente auxine (IAA, NAA, o 2,4-D) e ACC ad una concentrazione di 10-5 M, e cresciute per ulteriori 3 giorni. Dopo tali trattamenti le piante sono state trasferite in piastre MultiWellTM da 24 pozzetti, nei quali è stato aggiunto 1 ml di soluzione X-glux (0.1 M tampone NaPO4 pH 7.0, 0.5

mM ferrocianuro di potassio, 0.5 mM ferricianuro di potassio 10 mM NaEDTA pH 8.0, e 1 mg ml-1 X-glucuronide), e incubate al buio a 37°C O/N. Successivamente, le piante sono state lavate con etanolo al 70%, fino a completa decolorazione e fuoriuscita della clorofilla. Le plantule sono state risospese , al momento dell’analisi al microscopio, in glicerolo al 50% e quindi trasferite singolarmente su vetrini ed osservate al microscopio.

L’analisi microscopia è stato eseguita con uno stereomicroscopio Zeiss (Jena, Germania). Le immagini sono state acquisite utilizzando un apparecchio digitale Kodak Science, e trasferite ad un computer in formato TIFF ed elaborate con il programma Adobe Photoshop 8.0 CS2 (Mountain View, CA, USA). Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte, con risultati simili.

V

Simulazione dell’ambiente spaziale:

effetto della radiazione neutronica

Nell’ampio spettro delle radiazioni presenti nello spazio, i neutroni, per la loro natura di particelle prive di carica elettrica, rappresentano un serio problema sia per la salute degli astronauti che per ogni altro organismo, a causa della facilità con la quale essi attraversano le barriere e le schermature producendo infine una vasta gamma di effetti negativi. Tuttavia, finora nessun significativo sistema di protezione è stato trovato per schermare i neutroni (Benton & Benton 2001; Vanhavere et al. 2008).

In letteratura viene riportato come le piante esposte alle radiazioni ionizzanti presentano alterani in alcuni processi fisiologici quali la respirazione, l’emissione di etilene, l’accumulo di saccarosio e la fotosintesi (Wada et al. 1998; Cho et al. 2000; Kim et al. 2005; Nagata et al. 2005). Viceversa, poco è noto sull’effetto delle radiazioni non- ionizzanti (Todd, 2001; Tim et al. 2007). In particolare, riguardo alla letteratura scientifica sulla specie vegetale Arabidopsis thaliana, è stata riportata una serie di analisi su larga scala sulla variazione dell’espressione genica dopo irraggiamento con agenti ionizzanti (Kranz et al. 1994; Nagata et al. 2005; Sahr et al. 2005). In questi esperimenti è stato dimostrato che la maggior parte dei geni con alterata espressione erano coinvolti nella crescita e divisione cellulare, nello sviluppo, nella trasduzione del segnale, come nelle risposte a condizioni di stress. In aggiunta, è stato mostrato come alte dosi di radiazioni inducano sia l’attivazione di geni coinvolti nella biosintesi di enzimi responsabili del

bilanciamento tra detossificazione e produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) (Miller et al. 1985; Nagata et al. 1999), che a loro volta causano un incremento della perossidazione di proteine e lipidi di membrana (Landry et al. 1995; Mittler 2002, 2004; Kim et al. 2005; Yannarelli et al. 2006), come anche specifici cambiamenti morfologici nella piñata (Hectors et al. 2007). Sulla base dei dati attualmente disponibili, possiamo aspettarci che lo studio dell’effetto delle radiazioni sulle piante ci conduca ad una migliore conoscenza dei meccanismi che inducono stress (Wang et al. 2003), come sull’adozione delle corrette contromisure.

In questo lavoro, l’attenzione è stata concentrata sullo studio dell’effetto della radiazione neutronica su quei geni attivati dal fitormone auxina, che controlla in larga misura i processi morfogenetici nelle piante (Woodvard & Bartel 2005), e, allo stesso tempo, sui geni coinvolti nell’attivazione dei sistemi di difesa da stress e della senescenza. Per superare uno stress le piante hano evoluto sistemi di difesa altamente efficenti, coinvolgendo risposte sia enzimatiche che non-enzimatiche. Sebbene antiossidanti lipofilici (tocoferolo e carotenoidi) siano attivi nelle membrane cellulari, nel percorso enzimatico di detossificazione delle ROS la superossido dismutasi (SOD) converte O2-

direttamente in perossido di idrogeno (H2O2), mentre enzimi come le catalasi (CAT)

detossificano l’eccesso di H2O2 in acqua ed ossigeno (O2) (Corpas et al. 1999;

Zimmermann et al. 2006; Du et al. 2008). Il ruolo delle ROS nella biologia nei fenomeni di stress è di complessa spiegazione, ma appaiono essere coinvolti nel danno ossidativo, nonché potrebbero funzionare come secondo messaggero (Miller 2008). In generale, lo stato ossidativo delle cellule vegetali è elevato durante la senescenza: il livello delle ROS è oltre la soglia di tossicità, l’attività di molti enzimi antiossidanti è ridotta (Zimmermann et al. 2006), ed il livello di perossidazione dei lipidi di membrana è elevato (Vanacker et al. 2006). Quale sia l’effetto della radiazione neutronica, somministrata a tre differenti dosi, sul metabolismo dell’auxina, sulla senescenza e sulle performances fisiologiche di piante di Arabidopsis, sarà argomento trattato nei successivi paragrafi di questo capitolo. Gli esperimenti di bombardamento con neutroni sono stati eseguiti utilizzando il Neutron Generator di Frascati (NGF, figura 5.1, descritto in materiali e metodi).

Figura 5.1. Sistema sperimentale utilizzato per l’esposizione delle piante di

Arabidopsis ai neutroni. La distanza tra il Neutron Generator di Frascati (NGF)e le

piante da trattare è stato calcolato per avere tre diverse dosi assorbite (~30, 50, 76 mGy). Le piante sono state irradiate per ~3 ore al buio, alla temperatura di 23°C, alla umidità relativa del 60%. Le piante usate come controllo sono alloggiate in una stanza separata, completamente protetta da radiazioni, tenute alle stesse condizioni sperimentali dei campioni irradiati. FNG è alloggiato all'interno di un grande bunker (11.5 x 12 x 9 m) e il bersaglio da bombardare è posto a circa 4 m di distanza dalle pareti, pavimento e soffitto.