Per progettare nuovi mutanti `e importante stabilire un collegamento di-
retto tra la struttura e la funzione di una proteina, ovvero tra la sua sequenza amminoacidica e le sue prestazioni in termini di resa quantica, tempo di vita,
popolazioni relative dei diversi stati, quantit`a e natura degli stati dark, ecc. Una maggiore comprensione di queste relazioni permetterebbe di progettare
nuove proteine in modo pi`u mirato per ciascuna applicazione. Per arrivare a ci`o `e opportuno studiare separatamente i diversi fenomeni che possono avere
luogo, e solo in un secondo momento affrontare il problema nella sua inte- rezza, forti delle scoperte e del metodo conseguiti. Questo `e stato il metodo
seguito dal nostro gruppo di ricerca nello studio dello “switching”.
Abbiamo svolto la nostra indagine su due mutanti che per costruzione
non potessero andare incontro a fotoattivazione:
la BFPF (F64L/Y66F GFP), un mutante blu il cui cromoforo, essendo privo del gruppo –OH, pu`o esistere solo in uno stato neutro;
una variante della E1GFP con la mutazione aggiuntiva E222Q, una proteina giallo-verde che non pu`o andare incontro a fotoattivazione in
quanto il residuo 222 non possiede pi`u un gruppo carbossilico.
Figura 1.23: Fotoconversione della BFPF (comunicazione personale): spettri della pro- teina nativa, dopo 6 min e 12 min di irraggiamento a 360 nm (linee nere); dopo ulteriore irraggiamento a 406 nm (rosso) o a 458 nm (blu e celeste).
La BFPF presenta una banda di assorbimento con massimo attorno a 360 nm ed emette a 442 nm, con una resa quantica del 7%. In seguito
ad irraggiamento prolungato la proteina si fotoconverte ad uno stato non fluorescente. Non `e stato osservato ritorno spontaneo, il che ci ha facilitati
enormemente nell’acquisizione degli spettri Raman. Si pu`o invece avere re- cupero fotoindotto irraggiando a lunghezze d’onda leggermente pi`u lunghe,
dato che lo spettro della forma fotoconvertita presenta una coda di assorbi- mento pi`u alta, ad esempio con i laser a 406 nm e 458 nm. La trasformazione
`
e quindi reversibile.
In figura 1.23 sono messi a confronto gli spettri di assorbimento della pro- teina prima e dopo la fotoconversione in entrambi i versi, mentre in Tab. 1.4
sono riportati i valori del coefficiente di estinzione molare sul massimo della banda degli amminoacidi aromatici e al centro della banda del cromoforo.
La E222Q E1GFP non possiede il secondo sito di protonazione, per cui il suo comportamento chimico-fisico si pu`o spiegare con un modello a due soli
stati di equilibrio, A e B. Sperimentalmente si ricava pKa = 6.86: a pH pi`u bassi prevale la forma A, che assorbe a 410 nm, mentre a pH pi`u alti prevale
la forma B, con picco di assorbimento a 510 nm. Tali forme possono essere eccitate selettivamente e fotoconvertite a stati dark differenti, come mostrato
nello schema di Fig. 1.24. Qui i cinque stati osservati sperimentalmente vengono identificati mediante lo stato di protonazione e (quando nota) la
Parte di molecola λass/nm /M−1cm−1
amminoacidi aromatici 280 33220
cromoforo 360 19480
Tabella 1.4: Le due bande di assorbimento della BFPF nella forma ON. Sono riportate le lunghezze d’onda di picco ed i coefficienti di estinzione calcolati.
Figura 1.24: Modello degli stati per la E222Q. All’interno del rettangolo in basso sono raffigurate le due forme (A e B) coesistenti all’equilibrio. In seguito ad irraggiamento esse si portano su stati dark differenti, Z ed X, entrambi con cromoforo neutro. X `e in equilibrio acido-base con Y, che decade verso B a temperatura ambiente con κ = 0.02 s−1.
configurazione geometrica del cromoforo.
In seguito ad irraggiamento prolungato a 514.5 nm a pH ' 8 compare una banda di assorbimento a 416 nm che segnala la fotoconversione ad una
forma X avente cromoforo protonato. Questo stato dark `e a sua volta in equilibrio acido-base con una forma Y avente cromoforo anionico che assorbe
a 503 nm, con un pKa = 9.76. Irraggiando a 416 nm un campione a pH ' 5 si ottiene invece uno stato differente (indicato con Z nel seguito) che assorbe
a 350 nm. Le propriet`a ottiche dei cinque stati osservati sono raccolte in Tab. 1.5.
A pH alti `e stato inoltre osservato un recupero spontaneo e totale della fluorescenza, come mostrato dagli spettri in Fig. 1.25. La cinetica osservata
Forma Condizioni del cromoforo λass/nm /M−1cm−1 (tutte) 278 31350 A neutro, cis 410 27860 B anionico, cis 510 69060 X neutro 416 20360 Y anionico 503 44130 Z neutro 350
Tabella 1.5: Tabella riassuntiva dei cinque stati osservati sperimentalmente nella E222Q: sono riportate per ciascuno la lunghezza d’onda di assorbimento e il coefficiente di estinzione.
varia in funzione del pH:
κ = κX+ 10
pH − pKκ
Y
1 + 10pH − pK . (1.6)
dove κ = 1/τOF F `e la costante cinetica di ritorno spontaneo. I dati speri- mentali in funzione del pH si possono interpolare con una curva sigmoidale:
κ = 0.02 s −1
1 + 109.76−pH , (1.7)
da cui ricaviamo che κX κY e κY ' 0.02 s−1, ovvero il recupero avviene come decadimento dello stato Y sullo stato B. A pH = 7.9 la vita media dello stato dark (τ = κ−1) `e pari a circa un’ora (pari alla durata massima di una nostra acquisizione).
I due mutanti scelti presentano quindi una fenomenologia semplificata
rispetto alle proteine di partenza e in particolare vanno incontro a fenomeni di fotoconversione “totalmente” reversibili. Scopo della presente ricerca `e
determinare l’effettiva configurazione del cromoforo nelle proteine espresse. A questo scopo ci siamo serviti della spettroscopia Raman prerisonante,
Figura 1.25: Fotoconversione della E222Q (comunicazione personale): spettri della pro- teina nativa (nero), dopo alcuni cicli di irraggiamento a 514 nm (rosso e blu) a dopo il recupero spontaneo (magenta, verde, celeste). Si pu`o apprezzare la quasi perfetta sovrapponibilit`a degli spettri dopo il recupero con quello iniziale.
Capitolo 2
La spettroscopia Raman
(I) (II)
Figura 2.1: (I) L’effetto Raman come diffusione inelastica di luce da parte di una mole- cola. (II) Esempio stilizzato di spettro Raman (da [23]). La diffusione elastica (Rayleigh) genera righe spettrali alla stessa lunghezza d’onda di quella incidente, mentre la diffusione Raman di tipo Stokes genera righe spettrali a lunghezze d’onda maggiori e quella di tipo anti-Stokes genera righe (meno intense) a lunghezze d’onda pi`u corte.
Con il termine effetto Raman si indica la diffusione anelastica di luce, ovvero un’interazione tra luce e materia in cui viene distrutto un fotone (di
frequenza ωL) e ne viene creato uno di frequenza diversa ωS, portando quindi il sistema materiale — nel nostro caso la molecola — da uno stato di energia
Ei ad uno stato avente energia Ef = Ei+~(ωL−ωS). Nel caso in cui ωS < ωL si parla di effetto Raman “di tipo Stokes”, altrimenti “di tipo anti-Stokes”.
Poich´e a temperature ordinarie la maggior parte delle molecole si trova nello stato vibronico fondamentale, il segnale Stokes `e mediamente pi`u intenso.
All’inizio di questo capitolo vengono esposti i concetti base sulla teoria dell’effetto Raman, in generale ed in sistemi molecolari. Vengono poi fornite
alcune nozioni pratiche sull’acquisizione di spettri Raman in soluzione ed alcuni esempi di interesse biologico. In chiusura sono riportati i risultati di
un recente studio Raman su cromofori modello in soluzione, condotto presso il nostro laboratorio.
Nel seguito useremo spesso lo “shift di Raman”, sia in unit`a di frequenza angolare (s−1): ∆ω ≡ ωL− ωS, sia in numeri d’onda (cm−1):
∆¯ν = 107 1 λL − 1 λS = η ∆ω
200πc, dove le lunghezze d’onda sono espresse in nanometri, η `e l’indice di rifrazione del mezzo e c = 299792458 m/s `e la
velocit`a della luce.