Gli stati della BFPF

4.1.1

Confronto cromoforo – proteina

In Fig. 4.1 sono riportati gli spettri Raman della BFPF prima e dopo la fotoconversione, a confronto con gli spettri del cromoforo modello cBFPF

nelle forme cis e trans. Molti dei picchi gi`a osservati si ripetono nello spettro della proteina, pur con qualche variazione nell’intensit`a o nella frequenza.

In generale si osserva un aumento del background residuo (che non `e stato possibile eliminare sottraendo la linea di base) dovuto alla presenza di modi

vibrazionali associati al resto della proteina i quali, pur non godendo dell’am- plificazione dovuta alla prerisonanza, coinvolgono gruppi funzionali ripetuti

molte volte nella catena peptidica. `

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

1 4 0 0

1 6 0 0

1 8 0 0

#

#

#

#

#

#

R a m a n s h i f t ( c m

- 1

)

B F P F i n D E A , p H = 8 . 3 B F P F i n D E A , p H = 8 . 3 , d o p o i r r a g g i a m e n t o

#

c B F P F i n C H ₃C N , f o r m a t r a n s c B F P F i n C H ₃C N , f o r m a c i s

Figura 4.1: Spettri Raman della BFPF in soluzione acquosa a pH = 8.3, prima (blu) e dopo (verde) la fotoconversione, a confronto con i dati analoghi ottenuti per il cromoforo modello cBFPF in acetonitrile. Sono evidenziati il picchi fingerprint a frequenze comprese tra 1100 e 1300 cm−1ed i picchi dei modi localizzati (mostrati in dettaglio in Fig. 4.2 (II)). I picchi segnati con # presentano un background pi`u alto a causa del segnale aspecifico della proteina, come si deduce dall’analisi di Fig. 4.2 (I).

spettro Raman del citoplasma di un tipo di cellule di uso comune in studi biomolecolari (da [32]), ottenuto con un laser a 647.1 nm: questo dato pu`o

essere utilizzato per visualizzare il segnale “aspecifico” dovuto ad una misce- la proteica. Nella regione 1000 – 1700 cm−1 appaiono vistose bande che si possono attribuire a modi vibrazionali di gruppi funzionali presenti in gran numero nelle proteine (legami ammidici e gruppi metilici e metilenici) o alla

presenza di amminoacidi aromatici, i cui modi vibrazionali vengono ampli- ficati per prerisonanza a causa della relativa vicinanza della loro banda di

(I) (II)

1 5 5 0 1 6 0 0 1 6 5 0 1 7 0 0

R a m a n s h i f t ( c m - 1)

#

Figura 4.2: (I) Spettro Raman del citoplasma di cellule HeLa (da [32]). Sono evidenziati i picchi dovuti ai modi vibrazionali di parti di proteina, tra cui quelli localizzati sui gruppi ammidici (–CO–NH2), metilici (–CH3) e metilenici (=CH2) ed un picco stretto a 1000

cm−1dovuto alla presenza dell’amminoacido fenilalanina. (II) Ingrandimento dello spettro riportato in Fig. 4.1 che evidenzia i picchi ad alta energia.

assorbimento — 280 nm — con la riga laser utilizzata.

Tornando ai dati di Fig. 4.1, notiamo che:

ˆ Nello spettro della proteina sono presenti tutti i picchi del cromoforo con frequenza compresa tra 900 cm−1e 1500 cm−1; sono particolarmen- te intensi quelli a 1002, 1236 e 1447 cm−1, che probabilmente risentono della sovrapposizione con modi propri di altre porzioni della proteina

(si nota la presenza di alcuni di quelli riportati in Fig 4.2 (I)).

ˆ Sono ben evidenti il picco del modo C = N (∼ 1560 cm−1_{) ed una banda} larga attribuibile al modo C = C del ponte (∼ 1640 cm−1), parzialmen- te sovrapposto ad un modo ammidico del peptide; il picco del modo C

= C fenilico `e ben evidente nello spettro della forma fotoconvertita (a 1600 cm−1), mentre appare come una spalla in quello della forma nati- va. Un ingrandimento della regione considerata (Fig. 4.2 (II)) mostra inoltre una spalla a 1576 cm−1 (forma ON) / 1583 cm−1 (forma OFF), attribuibile ad un secondo modo dell’anello benzenico.

L’individuazione di picchi a frequenza < 900 cm−1 presenta serie diffi- colt`a, in quanto il segnale `e debole e con numerose irregolarit`a nella linea di base. Questo si pu`o spiegare da un lato con un rapporto segnale / rumore

sfavorevole (il segnale derivante dalla luce diffusa `e pi`u intenso, come pure il segnale aspecifico dovuto alla presenza del resto della proteina), dall’altro con

una effettiva minore attivit`a dei modi a bassa frequenza in proteina, a causa dell’ingombro sterico del barilotto β e dei residui circostanti, che ostacolano

la dilatazione del cromoforo.

4.1.2

Forma nativa e forma fotoconvertita

Modo cBFPFcis cBFPFtrans BFPF nativa BFPF fotoconvertita

Fig. 2.9 (I) — 1132 — 1142 Fig. 2.9 (II) 1182 1182 1179 1184 Fig. 2.9 (III) 1218 1220 1236 1234 C = N 1563 1563 1564 1560 C = C fenolo 1576 1576 1576 1583 C = C fenolo 1597 1597 1596 1593 C = C ponte 1644 1640 1664 1665

Tabella 4.1: Tabella riassuntiva dei picchi Raman pi`u importanti per la BFPF e per il cromoforo modello cBFPF in acetonitrile. Le frequenze riportate (in cm−1) sono i valori ottenuti sperimentalmente.

I picchi pi`u significativi sono riportati in Tab. 4.1. Per meglio apprezzare le variazioni tra gli spettri della forma nativa e della forma fotoconvertita

`

e stato ricavato uno spettro differenza, sottraendo lo spettro della forma fotoconvertita da quello della forma nativa in modo da ottenere un grafico il

pi`u possibile piatto nelle regioni in cui non sono previsti picchi del cromoforo. In questo modo viene ridotto l’impatto del segnale aspecifico sul grafico: il

risultato `e riportato in Fig. 4.3 a confronto con l’analogo spettro differenza del cromoforo.

Sono subito evidenti alcuni picchi differenziali a numeri d’onda compresi tra 1550 cm−1 e 1600 cm−1, che descrivono spostamenti nei picchi dei modi localizzati sul gruppo C = N e sul fenile. Questi spostamenti non sono apprezzabili negli spettri dei cromofori in soluzione e sono legati a modifiche

nella struttura della rete di legami a idrogeno tra il cromoforo e il barilotto β presenti nella proteina espressa (Sez. 1.1.1). Questi legami a idrogeno non

sono naturalmente presenti nel caso del cromoforo isolato in soluzione. Ai fini della nostra analisi `e importante valutare che:

1. il picco a 1142 cm−1— corrispondente al picco fingerprint gi`a mostrato per i cromofori in Fig. 2.9 (I) — `e pi`u alto nello spettro della proteina in forma fotoconvertita;

2. i picchi a 1180 cm−1 e a 1230 cm−1 sono invece pi`u intensi nello spettro della forma nativa, come pure il picco corrispndente al modo C = C del ponte insaturo (1665 cm−1).

Sulla base delle osservazioni sopra esposte siamo ora in grado di proporre

la configurazione geometrica del cromoforo nella proteina in ciascuna delle forme ON ed OFF. In particolare

1 0 0 0

1 1 0 0

1 2 0 0

1 3 0 0

1 4 0 0

1 5 0 0

1 6 0 0

1 7 0 0

#

R a m a n s h i f t ( c m

- 1

)

B F P F , f o r m a O N - f o r m a O F F

c B F P F i n C H ₃C N , c i s - t r a n s

Figura 4.3: Spettro differenza per la BFPF, a confronto con lo spettro differenza per cBFPF in acetonitrile. Sono evidenziate le variazioni di intensit`a nei picchi a 1100 ÷ 1300 cm−1 e nel picco del modo C = C. L’apparente sdoppiamento del picco a 1234 cm−1 `e dovuto alla presenza di un modo dei gruppi ammidici della proteina.

ˆ il cromoforo della forma fotoconvertita si trova in configura- zione trans.

Nel documento Fotocromismo nelle proteine fluorescenti: uno studio Raman (pagine 89-94)