Scongelamento e valutazione pre e post-scongelamento degli spermatozoi 1 Astore

L’efficacia dei protocolli di crioconservazione utilizzati per l’astore è stata valutata analizzando i risultati ottenuti sia dopo la sola aggiunta del crioprotettore e del diluente, sia dopo l’intero processo di crioconservazione.

Nelle tabelle 30-38 vengono riportati in dettaglio i risultati ottenuti per ogni campione di eiaculato sottoposto a crioconservazione nelle seguenti fasi del processo:

1) nei campioni di eiaculato fresco;

2) nei campioni di eiaculato dopo l’aggiunta del crioprotettore e del diluente; 3) nei campioni di eiaculato dopo l’intero processo di crioconservazione

Quando i campioni di eiaculato sono stati crioconservati con il protocollo I e III all’analisi alla Camera di Makler gli spermatozoi già dopo l’aggiunta del diluente e del crioprotettore hanno mostrato una motilità relativamente bassa, mentre sono risultati completamente immobili dopo l’intero processo di crioconservazione. La colorazione eosina-nigrosina ha fornito la spiegazione a quanto osservato alla Camera di Makler, infatti nei campioni congelati/scongelati con questi protocolli la maggior parte degli spermatozoi sono risultati morti già dopo la prima fase del processo di crioconservazione (aggiunta del diluente e del crioprotettore).

Analizzando in dettaglio al SEM quanto accade dopo l’aggiunta delle criosoluzioni, utilizzando il DMA puro come crioprotettore (protocollo I), gli spermatozoi si presentano rivestiti da denso materiale fibroso che li avvolge completamente, intrappolandoli. Dopo il congelamento e scongelamento questa matrice è ancora visibile ed abbondante e non è stato possibile fare valutazioni sulla citomorfologia degli spermatozoi per capire se e in che misura le anomalie potessero essere eventualmente aumentate dopo il trattamento (Figure 53 A-B).

Nei campioni ai quali è stata aggiunta la criosoluzione contenente glicerolo (protocollo III) non è stato riscontrato il materiale fibroso descritto in precedenza, mentre sono stati evidenziati spermatozoi con danni molto gravi, la cui complessità aumenta rispetto al fresco ed è già molto elevata dopo la sola aggiunta della criosoluzione. Nei campioni esaminati, nella quasi totalità delle cellule danneggiate è la membrana plasmatica ad essere principalmente compromessa, che può sia presentare rotture (Figura 53 D-F) sia essere assente. Alcuni spermatozoi mancano della testa ed è presente solo il pezzo intermedio e il

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pezzo principale della coda e la membrana plasmatica è anche in questo caso assente (Figura 53 D). In alcuni casi il pezzo principale della coda presenta delle rotture e lo spermatozoo risulta più corto (Figura 53 E-F).

Nei campioni di eiaculato crioconservati con il II protocollo, invece, si sono riscontrati risultati completamente differenti infatti dall’analisi della vitalità tramite colorazione eosina-nigrosina è risultato che dopo l’aggiunta del diluente e del crioprotettore la percentuale di spermatozoi vitali è compresa tra 25,5% e 83% nei tre maschi A,B,C, mentre dopo l’intero processo di crioconservazione risulta racchiusa in un range che va dal 14,5% al 59%. Per quanto riguarda la percentuale degli spermatozoi normali dopo il processo di crioconservazione si è osservato un notevole decremento. Infatti nei campioni di eiaculati freschi è risultata compresa tra 77% e 94%, in quelli scongelati invece tra 17,5% e 29,5%.

La percentuale di spermatozoi motili, valutata al microscopio ottico con la Camera di Makler, dopo la prima fase del processo di crioconservazione è risultata compresa tra il 16,5% e il 42,63%; dopo l’intero processo di criocongelamento invece tra il 2,55% e il 12,5%. Le percentuali più basse sono state rilevate nel maschio A (il più anziano) sui campioni congelati ad inizio stagione riproduttiva (marzo), mentre quelle più alte nel maschio C (il più giovane) congelati a metà stagione riproduttiva (aprile).

Per ottenere una conferma di questi risultati positivi ottenuti per i parametri sopra descritti negli stessi campioni abbiamo effettuato anche i seguenti test:

a) test di Accudenz per valutare la mobilità degli spermatozoi b) saggio di interazione sperma – strato perivitellino

Anche i risultati di questi test vengono riportati nel dettaglio nelle tabelle 30-38 dalle quali si evince che dopo l’intero processo di crioconservazione gli spermatozoi dei tre esemplari analizzati con il metodo Accudenz hanno mostrato tutti una OD molto bassa che sta ad indicare una bassa mobilità degli spermatozoi, ed una scarsa capacità di penetrare lo strato perivitellino. Questi valori sono dovuti alla bassa percentuale di spermatozoi vitali dopo l’intero processo di crioconservazione, e alla loro scarsa capacità di movimento come evidenziato alla camera di Makler.

Quindi analizzando tutti questi risultati possiamo affermare che il II° protocollo, che prevede l’utilizzo del prefreezing lake come diluente e il DMA 6% come crioprotettore, è quello che fornisce risultati migliori nella crioconservazione degli spermatozoi di astore.

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Esaminando nel dettaglio i risultati ottenuti con tale protocollo, emerge che gli spermatozoi del maschio C sono quelli che, durante l’intera stagione riproduttiva, hanno la maggiore capacità di resistenza al processo di congelamento e scongelamento, mentre aprile è il mese in cui i campioni dei tre esemplari oggetto del nostro studio hanno mostrato la migliore resistenza alla crioconservazione.

3.5.2 Fagiano

Come descritto nel paragrafo 2.5 i campioni di eiaculato di fagiano sono stati crioconservati utilizzando il pre-freezing lake come diluente e il DMA 6% come crioprotettore. In totale, durante la stagione riproduttiva, sono state effettuate 10 prove di crioconservazione dei gameti maschili di fagiano. In tutti i campioni di spermatozoi scongelati sono stati esaminati i seguenti parametri:

a) vitalità degli spermatozoi con colorazione eosina nigrosina b) percentuale di spermatozoi con morfologia normale

c) mobilità con il metodo Accudenz

d) analisi qualitativa delle anomalie ultrastrutturali presenti nei campioni di spermatozoi

e) valutazione della fertilità degli spermatozoi crioconservati attraverso l’inseminazione artificiale

I risultati ottenuti nei primi tre test (a-b-c) sono stati messi a confronto con quelli ottenuti per gli stessi parametri negli eiaculati freschi e come si evince nella tabella 39, dove vengono riportati nel dettaglio i risultati per ciascun campione, il processo di crioconservazione ha causato una notevole perdita di qualità degli spermatozoi.

Infatti la percentuale di spermatozoi vitali è compresa in un range che va dal 10,9% al 48%, mentre negli eiaculati freschi variava dal 79,5% al 93,8% ed anche la percentuale di spermatozoi vitali con morfologia normale ha subito un notevole decremento dopo il processo di crioconservazione ed è compresa in un range che va dal 7,2% al 26,5%, mentre nel fresco variava dal 54,6% al 83,2%. Anche le OD osservate nei campioni crioconservati sono notevolemente più basse rispetto a quelle osservate nei campioni di eiaculato freschi e

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ciò sta ad indicare una perdita di mobilità degli spermatozoi dopo il processo di crioconservazione.

A livello ultrastrutturale gli spermatozoi di fagiano scongelati hanno mostrato numerose anomalie. Similmente a quanto effettuato negli eiaculati freschi tali alterazioni sono state classificate in base alla loro localizzazione in:

a) anomalie della testa; b) anomalie della coda

a) anomalie della testa: l’anomalia di questa regione del gamete maschile di fagiano maggiormente riscontrata è stata il rigonfiamento della zona basale della testa che spesso è associata con la rottura della membrana plasmatica (Figura 54 A-B). Quest’ultima anomalia è stata osservata anche nella regione acrosomiale (Figura 54 C) e a livello nucleare (Figura 54 D).

b) anomalie della coda: a livello della coda le anomalie riscontrate maggiormente sono localizzate a livello del pezzo intermedio che ha mostrato: danni irreversibili del manicotto dei mitocondri, che nei casi più gravi risulta completamente danneggiato (Figura 54 E) e mitocondri rigonfi (Figura 54 F-G). Anche nel pezzo intermedio e in quello principale della coda, come precedentemente osservato nella testa, la membrana plasmatica presenta spesso delle rotture (Figura 54 H-I).

L’inseminazione artificiale, è stata praticata in 5 femmine di fagiano diverse, con le metodiche riportate nel paragrafo 2.3. I pellets di spermatozoi crioconservati utilizzati sono stati combinati in modo da apportare concentrazioni di spermatozoi vivi normali diverse. Come si evince dai dati riportati in tabella 40 i risultati migliori in termini di fertilità si sono ottenuti quando per l’inseminazione artificiale sono stati utilizzati pellets a concentrazioni maggiori (110 x 106 e 65 x 106 sperm x ml). In termini di uova schiuse, invece, contrariamente a quanto ci si sarebbe potuto aspettare, visti anche i risultati sulla fertilità, i risultati migliori si sono avuti quando sono stati utilizzati i pellets di spermatozoi crioconservati a concentrazione minore (45 x 106 sperm xml).

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Figura 46: Immagini al SEM di spermatozoi di astore crioconservati con DMA in rapporto 1:1 rispetto al volume iniziale e con glicerolo. A-B: spermatozoi crioconservati con DMA completamente avvolti dalla matrice fibrosa (barra A=5 µm; barra B=1 µm). C-D: spermatozoi crioconservati con glicerolo in cui sono osservabili anomalie complesse non riscontrate negli eiaculati freschi (barra=1 µm). E-F: spermatozoi crioconservati con glicerolo che presentano numerose rotture a livello della membrana plasmatica e della coda (barra=1 µm).

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Figura 47: Immagini al SEM e al TEM di spermatozoi di fagiano crioconservati con DMA al 6% rispetto al volume iniziale. A-B: immagini longitudinali al TEM dello spermatozoo crioconservato che presenta dei rigonfiamenti alla base della testa e delle rotture della membrana plasmatica (testa di freccia) (barra A= 500 nm; barra B= 250 nm). C: sezione trasversale al TEM della regione acrosomiale dello spermatozoo che presenta rotture della membrana plasmatica (testa di

freccia) (barra= 100 nm). D: sezione trasversale al TEM del nucleo dello spermatozoo che presenta rotture della membrana plasmatica (testa di

freccia) (barra= 250 nm). E: immagine al SEM dove lo spermatozoo presenta danni irreversibili a livello del pezzo intermedio (barra= 1 µm). F: sezione longitudinale al TEM del pezzo intermedio della coda in cui è possibile osservare dei mitocondri rigonfi (asterisco) (barra= 125 nm). G: sezione longitudinale al TEM della coda dello spermatozoo in cui è possibile osservare delle rotture della membrana plasmatica a livello del pezzo intermedio (testa di freccia) (barra= 1 µm). H: sezione trasversale al TEM dello spermatozoo in cui è possibile osservare delle rotture della membrana plasmatica a livello del pezzo intermedio (testa di freccia) (barra= 100 nm). H: sezione longitudinale al TEM dello spermatozoo in cui è possibile osservare delle rotture della membrana plasmatica a livello del pezzo intermedio della coda (testa di freccia) (barra= 250 nm).

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CAMPIONI DI EIACULATI FRESCHI RISULTATI DOPO AGGIUNTA