Scopo della tes

Lo scopo di questo studio è quello di valutare le variazioni della magnesemia, in soggetti appartenenti alla specie canina, in codice giallo/rosso, ricevuti presso l’Unità di Pronto Soccorso e Terapia Intensiva dell’Ospedale Didattico Veterinario “Mario Modenato” dell’Università di Pisa.

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4.2. Materiali e metodi

Tipo di studio clinico prospettico. Criteri di inclusione

Nel nostro studio clinico, di natura prospettica, sono stati inclusi animali appartenenti alla specie canina, pervenuti presso l’Unità di Pronto Soccorso e Terapia Intensiva dell’Ospedale didattico “Mario Modenato” del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa, nel periodo compreso tra marzo 2016 ed aprile 2017.

I pazienti reclutati sono stati valutati come codici gialli o rossi al momento dell’accettazione in Pronto Soccorso, secondo la classificazione del Triage applicata ad ogni soggetto che si presenti presso tale reparto (Reineke 2015) (Figura 4.1). Sono stati inclusi animali con ricovero nell’Unità di almeno 72 h.

Figura 4.1 Classificazione dei codici per il triage dei pazienti all’arrivo in pronto soccorso (from casilinoemergenza.it)

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Studio clinico

Tutti i soggetti arruolati sono stati sottoposti a visita clinica completa al momento dell’ingresso in Pronto Soccorso ed i parametri vitali quali frequenza cardiaca (FC), frequenza respiratoria (FR), pressione arteriosa media (MAP), colore delle mucose, tempo di riempimento capillare, stato del sensorio e temperatura sono stati opportunamente registrati nell’apposita cartella.

In tutti i pazienti è stato determinato il magnesio sierico attraverso l’esecuzione di due prelievi:

 T0: all’ingresso del paziente in Pronto Soccorso.

 T1: al terzo giorno di ricovero del paziente (dopo 72 h da T0).

I campioni necessari sono stati ottenuti mediante prelievo dalla vena giugulare o a livello delle vene cefalica o safena.

L’area è stata tricotomizzata con una tosatrice e disinfettata con l’utilizzo di cotone ed alcol 90%, quindi, con l’aiuto di un operatore, il cane è stato contenuto in posizione sternale o in decubito latero-laterale per permettere il prelievo di sangue eseguito con una siringa sterile della capacità totale di 5 ml. Un’aliquota pari ad 1 ml è stata utilizzata per la determinazione della magnesemia, l’aliquota restante è stata utilizzata immediatamente per l’esecuzione di una emogasanalisi.

La restante aliquota è stata utilizzata per la misurazione di altri parametri biochimici. Gli animali sono stati successivamente divisi in tre gruppi in base ai valori di magnesemia riscontrati:

 Ipomagnesemici: per Mg< 1,4 mg/dl

 Normomagnesemici: per 1,4 mg/dl<Mg<2,38 mg/dl  Ipermagnesemici: per Mg>2,38 mg/dl

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Per il completamento dello scopo della tesi, per ciascun paziente, sono stati registrati i valori di creatininemia e fosfatemia in entrata.

Per quanto riguarda i parametri emogas-analitici sono stati valutati: pH, HCO3-, K+,

Ca2+_{, Na}+_{, Cl}-_{, pCO2 in ingresso ed al terzo giorno di ricovero.}

I pazienti sono stati quindi suddivisi, sulla base delle patologie presentate, in:  Gastroenterici

 Nefropatici  Respiratori  Neurologici

 Altro (tossinfezioni, traumi ecc.)

Per ciascun paziente è stato inoltre valutato l’indice di sopravvivenza utilizzando la scala SPI2 (Survival Prediction Index) che prevede la considerazione di diversi parametri quali: pressione arteriosa media, frequenza respiratoria, creatinina, ematocrito, albumina, età e la definizione del tipo di trattamento se medico o chirurgico.

Figura 4.6 Formula per il calcolo di SPI2 (King et al. 2001).

Logit (P) viene risolto considerando P= eLogit(P)_/(1+eLogit(P)_{). Il valore ottenuto se}

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Infine per tutti i pazienti arruolati è stato registrato l’outcome:  Sopravvissuti

 Deceduti

 Sottoposti ad eutanasia

Strumentario

Il sangue raccolto per la determinazione della magnesemia è stato subito collocato in provette dedicate all’ottenimento del siero e mantenuto in termostato a 37° per 5 minuti quindi centrifugato a 3000 giri per 4 minuti con l’utilizzo del macchinario ALCPK110.

Una volta ottenuto il siero, il sopranatante è stato prelevato con una pipetta automatica e trasferito in una eppendorf per essere prontamente stoccato in congelatore alla temperatura di -20°, in un apposito contenitore, ed analizzato in un secondo momento.

Le eppendorf contenti i due campioni per ciascun paziente sono state adeguatamente etichettate con cognome del paziente, numero di cartella, indicazione T0 o T1 a seconda del prelievo, e data.

Al fine di eseguire l’emogasanalisi i campioni sono stati raccolti in una provetta contente litio eparina e successivamente prelevati con una siringa da insulina senza ago della capacità di 1 ml. La siringa è stata prontamente isolata e chiusa mediante tappo apposito per evitare l’ingresso di aria ambiente nel campione e l’alterazione dei valori dei gas ematici ossia PaO2 e PaCO2.

Per la determinazione della magnesemia i campioni di siero sono stati analizzati con la strumento IDEXX VetTest Chemistry Analyzer (

Figura 4.3

Lo strumento testa sia campioni di sangue che urine e riesce ad analizzare oltre 12 parametri contemporaneamente, con l’utilizzo di piastrine analita specifiche, su un

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singolo campione di siero, plasma o urina impiegando solo 6 minuti di tempo per la misurazione.

L’esame funziona attraverso diversi step descritti e guidati sullo schermo del macchinario ed accompagnati da diversi segnali acustici di supporto. Ai fini del test, lo strumento dispone, inoltre, di un ingresso per la piastrina analita specifica, che accoglie solo una piastrina per volta, quest’ultima viene inserita manualmente per scivolamento, di un pipettatore per il prelievo del campione e di una tastiera per l’inserimento manuale dei dati del paziente e per procedere nei vari step di analisi. Il macchinario preleva una quantità di 10 µl a campione, la quale diffonde verso lo strato superiore della piastrina e viene assorbita. La reazione biochimica che consegue all’assorbimento, determina un progressivo cambiamento di colore che viene misurato nella sua intensità dal sistema ottico dell’analizzatore.

Lo strumento possiede tre riflettometri che lavorano con sei lunghezze d’onde diverse per quantificare i vari analiti; tre misurazioni sono convertite nel valore che appare sullo schermo come risultato e che la macchina permette di stampare.

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Figura 4.3 IDEXX VetTest Chemistry Analyzer presente nel reparto di Pronto

Soccorso e Terapia Intensiva dell’Opsedale didattico “Mario Modenato” dell’Università di Pisa.

Figura 4.4 Immagine rappresentativa di due campioni di siero e di una piastrina

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Figura 4.5 Fase di inserimento della piastrina per la misurazione del magnesio totale

nell’apposito spazio dedicato del macchinario VetTest 8008; la piastrina viene collocata maneggiandone esclusivamente i bordi, il codice a barre è rivolto verso l’alto.

L’emogas analisi è stata eseguita entro due minuti di distanza dal prelievo con l’utilizzo della macchina Emogas ABL 700 Series Radiometer Copenhagen (2010) (

Figura 4.2

Lo strumento analizza campioni di sangue intero e permette di misurare numerosi parametri: pH, PO2, PCO2, Ck+, cNa+, cCa2+, cCl-, cGlu, cLat, cCrea, ctBil, ctHb,

So2, e le frazioni di emoglobina FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb, FHbF.

Il macchinario contiene al suo interno diverse camere di misura contenenti gli elettrodi ciascuno corrispondente ad un analita da quantificare (pCO2, pO2, cCl-,

cCa2+_{, cK}+_{, cNa}+_{, cGlu, cLat). Uno spettrofometro consente la misurazione di ctHb,}

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Figura 4.2 Emogas-analizzatore ABL700 Series, presente nel reparto di Pronto Soccorso

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Analisi statistiche

Tutte le correlazioni statistiche sono state effettuate grazie all’utilizzo del software “

Graphpad Prism 7

Prima di ogni analisi statistica è stato eseguito il test di normalità mediante la