MOLECOLARE DELLA SORDITÀ EREDITARIA
7.2 Sequenziamento del DNA
Verso la fine degli anni ’70 sono stati sviluppati metodi che permettevano di determinare in modo semplice e veloce, la sequenza nucleotidica di qualunque frammento purificato di DNA.
Metodo SANGER: il metodo Sanger è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede l'utilizzo di un enzima; utilizza dideossinucleotidi trifosfati (ddNTP) per arrestare la sintesi del DNA in posizione 3' al posto dei normali deossinucleotidi trifosfati (dNTP). I dideossinucleotidi trifosfati sono privi del gruppo ossidrile in posizione 3’ che è necessario per formare il legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo. La sintesi, quindi, terminerà in corrispondenza di quel residuo. Questo metodo viene così eseguito:
- Il campione di DNA da sequenziare viene denaturato per ottenere lo stampo a singolo filamento
-Lo stampo a singolo filamento viene suddiviso in 4 provette di sintesi con l'aggiunta di:
un primer specifico complementare al filamento da sequenziare e marcato radioattivamente
75 la DNA polimerasi
una miscela dei 4 dNTP
un ddNTP in ognuna delle 4 provette
-Al termine della reazione di sintesi ogni provetta conterrà nuovi frammenti di DNA marcati di lunghezza diversa (a seconda della posizione 3' in cui è stato incorporato il ddNTP) che vengono poi caricati in 4 pozzetti diversi e separati con elettroforesi su gel di poliacrilammide. I frammenti (che hanno l'estremità 5' marcata) vengono visualizzati attraverso autoradiografia come bande
radioattive di lunghezze diverse.
- La sequenza del filamento di DNA di nuova sintesi viene ricostruita a partire dall'estremità 3' a quella 5' in base alla posizione delle bande nei diversi pozzetti, che corrisponde alla terminazione della sintesi a livello di una delle 4 basi nucleotidiche per incorporazione di un ddNTP. Successivamente è stata introdotta una variante del metodo originale, in cui i frammenti di Sanger sono prodotti mediante amplificazione con PCR di una piccola quantità di DNA stampo a doppio filamento; quindi non è più necessario il clonaggio del DNA da sequenziare e si può utilizzare DNA a doppio filamento. Inoltre si utilizzano “primers” o ddNTPs marcati con 4 fluorocromi differenti, quindi si possono far correre i frammenti in un'unica corsia e, soprattutto, la sequenza può essere letta in maniera automatizzata: Vengono allestite 4 reazioni di PCR con: -il DNA stampo da sequenziare a doppio filamento
-un solo primer (per ottenere soltanto il filamento complementare allo stampo)
-la Taq DNA polimerasi
-una miscela dei 4 dNTP
-un ddNTP marcato con un fluorocromo in ognuna delle 4 provette Per ogni reazione si genera una miscela di frammenti a singolo filamento che vengono poi caricati in un unico pozzetto e separati per elettroforesi. Durante l'elettroforesi i frammenti vengono eccitati da una luce laser e passano
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davanti a un rilevatore che capta la lunghezza d'onda (e l'intensità) delle emissioni fluorescenti e identifica quale nucleotide è presente nella banda. Le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso (uno per ogni nucleotide) con aree proporzionali all'intensità, di emissione.
Sequenziamento in automatico mediante ABI PRISM 377 Il principio è quello del metodo enzimatico, ma la reazione viene eseguita in un
unico tubo che contiene oltre al frammento che si vuole sequenziare anche l’ enzima DNA polimerasi, i quattro nucleotidi e i dideossinucleotidi marcati ciascuno con composto fluorocromo diverso. Le timine sono marcate con fluorocromo che emette nel rosso (ROX), le citosine con uno che emette nel blu (FAM), le adenine con un fluorocromo con spettro di emissione nel verde (NED) ed infine per le guanine si utilizza un fluorocromo che emette nel giallo (HEX). Durante la reazione di sequenziamento, l’amplificazione del filamento si interrompe quando in esso viene inserito il dideossiribonucleotide marcato che manca del gruppo ossidrile in 3’ per cui la polimerasi che sintetizza nella direzione 5’-3’, non riconoscendo il 3’-OH blocca la polimerizzazione e l’ultima base incorporata risulterà marcata. I frammenti di DNA così ottenuti vengono separati mediante corsa elettroforetica effettuata su gel verticale di poliacrilammide al 4.5%. Durante la corsa i campioni migrano in base al loro peso molecolare fino a raggiungere la zona di lettura a livello della quale si verifica una scansione continua mediante luce laser. In questo punto, i fluorocromi vengono colpiti dal raggio laser prodotto dallo strumento ed ognuno emette una radiazione di diversa lunghezza d’onda nello spettro del visibile (Fig. 39). Il Software Sequence Analysys interpreta questa emissione costruendo degli elettroferogrammi, nei quali la presenza di una determinata base azotata è associata ad un picco dello stesso colore del fluorocromo che la marca. La sequenza letta dall’apparecchio è confrontata, mediante Software Navigator, con la sequenza di controllo relativa all’esone di interesse. Dall’analisi dell’accoppiamento delle sequenze, vengono individuate le mutazioni.
77
Figura 39 competizione tra dideossinucleotidi marcati (A*T*C*G*) e deossinucleotidi (A, T, G, C), alla base della reazione di sequenza
Sequenziatore ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer
Questo sequenziatore automatico è simile, per certi aspetti, al sequenziatore automatico ABI Prism 377 e differisce solo per la corsa elettroforetica in quanto viene adoperata l’elettroforesi capillare. Quest’ultima è una tecnica separativa in cui si utilizzano delle colonne microcapillari rivestite di silice fusa e riempite da un polimero che agisce da setaccio molecolare.
L’uso di microcapillari rivestiti di silice risulta assai vantaggioso perché fa si che il rapporto fra la superficie e il volume del capillare sia alto, aumentando, così, la dissipazione del calore e ciò comporta a una diminuzione dei tempi necessari per la corsa elettroforetica. Un altro vantaggio è dato dal caricamento automatico (dove il campione viene aspirato dal pozzetto che lo contiene e portato velocemente dentro la matrice interna del capillare), che consente di
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evitare la dispersione del campione conseguente al caricamento manuale su gel, e permette di utilizzare minori quantità di DNA .
Come succede nell’altro sequenziatore la prima parte del procedimento è la stessa e quando avremo i campioni ottenuti dal sequenziamento si applica la corsa elettroforetica capillare dove gli oligonuleotidi neosintetizzati migrano dal polo negativo al polo positivo. La velocità di migrazione del DNA all'interno del capillare è legata alle sue dimensioni: maggiore è la lunghezza del frammento di DNA, minore è la sua velocità di corsa. Prima di giungere all'elettrodo positivo i frammenti di DNA attraversano la finestra ottica a livello della quale sono colpiti da un raggio laser, il quale eccita i fluorocromi legati ai dideossinucleotidi inducendo una risposta rilevabile dal sistema. L’emissione rilevata viene elaborata dal software consentendo la visualizzazione della sequenza del frammento di DNA analizzato in un elettroferogramma, in cui la
presenza di una base è indicata dal picco di colore corrispondente.
Next Generation Sequencing (NGS)
Per 20 anni il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger ha dominato nella scienza e nell’industria ed ha consentito il sequenziamento del genoma umano e la scoperta di almeno 2.500 malattie genetiche.
Nel corso degli ultimi anni sono nate e si stanno affermando nuove tecnologie di analisi genomica e di sequenziamento massivo del DNA (“next generation sequencing”-NGS). NGS è un potente metodo capace di decodificare interi genomi. Grandi quantità di dati del DNA sono prodotti da ciascun campione testato, rivelando contemporaneamente informazioni sull’ ereditarietà delle
malattie genetiche, anomalie cromosomiche e mutazioni mitocondriali. I maggiori vantaggi offerti dalla Next Generation Sequencing sono rappresentati
dalla capacità di produrre un volume enorme di dati a costi estremamente più bassi ed in tempi estremamente più rapidi.
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L’apparecchiature attualmente disponibili sono : Roche/454 (pirosequenziamento)
Piattaforma Illumina
Biosistema Solid (ligazione)
Questi apparecchi forniscono nuove prospettive di analisi che permettono di allargare gli orizzonti studiando più geni in parallelo in casi per esempio come quello della mia famiglia, in cui l' analisi ereditaria risulta ancora e purtroppo ristretta ed occorre studiare molti più geni recessivi e dominanti per giungere ad una diagnosi.
80 CONCLUSIONI
L’alta incidenza delle sordità ereditarie nel mondo occidentale fa sì che questa rappresenti la più frequente patologia neurosensoriale su base genetica.
Gli studi genetici hanno reso evidente che la causa più comune della maggior parte delle perdite uditive di natura ereditaria è rappresentata da mutazioni a carico del gene GJB2. Si stima che 1 individuo su 24 sia portatore di una mutazione recessiva di questo gene.
Si stima che 1 bambino su 1000 sia sordo alla nascita e 1 neonato su 2000 presenti difetti uditivi attribuibili a mutazioni genetiche.
La precoce identificazione della mutazione potrebbe portare alla realizzazione di opzioni terapeutiche sempre migliori, come ad esempio la protesizzazione o meglio la messa a punto di una terapia genica, che permetterebbe di migliorare notevolmente le condizioni di vita dei pazienti. Lo screening genetico potrebbe anche evidenziare quelle mutazioni che rendono gli individui particolarmente suscettibili agli effetti ototossici di alcuni farmaci.
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