SEZIONE C: Analisi Morfologica

• Microscopia Elettronica

Per l’esame ultrastrutturale i campioni, prelevati durante il sacrificio, sono stati fissati per 2 ore in una soluzione di gluteraldeide 3% in tampone fosfato 0.12M ; alla fine delle 2 ore è stato fatto un lavaggio in tampone fosfato 0.12M da un minimo di 30 min ad un massimo di 24 ore; successivamente i campioni sono stati postfissati in una soluzione di tetrossido di osmio 1% in tampone fosfati 0.18M per 2 ore a 4° C.

Le sezioni anatomiche vengono quindi lavate in tampone fosfato 0.18M per 30 min e disidratate in acetone a concentrazioni crescenti ( 50%, 75%, 95%) per 20 minuti ciascuno,infine per un’ora in acetone assoluto.

I campioni sono stati inclusi nella resina Durcupan Fluka con i seguenti passaggi:

- miscela 3:1 (3 parti di acetone + 1 di Durcupan) per 1 ora - miscela 1:1 (1 di acetone +1 di Durcupan) per 1 ora

- “over night” miscela 1:3 (1 di acetone + 3 parti di Durcupan)

Il giorno successivo è stata fatta l’inclusione dei campioni in resina pura (Durcupan) per 4 ore, e la polimerizzazione di tale resina a 60° per 24 ore. Mediante la preparazione di semifini si determina il punto di interesse del preparato che verrà poi sottoposto al taglio mediante ultramicrotomo. La qualità maggiore deriva dal minore spessore delle sezioni e principalmente dalla scelta di un mezzo di inclusione, la resina, che è in grado di preservare i tessuti più efficacemente rispetto alla paraffina. Il taglio con ultramicrotomo è seguito dal

posizionamento su retini di rame e dalla colorazione con Sali di metalli pesanti. A causa del basso potere di penetrazione del fascio di elettroni le sezioni devono essere estremamente sottili. L’acetato di uranile o citrato di piombo, utilizzati in questa occasione, si legano selettivamente a specifiche regioni e strutture del preparato aumentandone il contrasto.

• Microscopio Elettronico

Nel microscopio elettronico a trasmissione (TEM) la sorgente d’onda è un filamento di tungsteno che funge da catodo e da cui parte il fascio di elettroni. Questi sono accelerati dalla differenza di potenziale presente tra catodo ed anodo, e sono orientati e condensati medianti lenti magnetiche. L’immagine finale è osservabile su uno schermo fluorescente che converte la radiazione elettrica, invisibile, in radiazione fotonica, da cui si ottiene una stampa che la riproduce ulteriormente ingrandita. Il TEM lavora esclusivamente sotto vuoto per garantire la propagazione del fascio di elettroni, e per questo motivo il campione è inserito in una piccola camera che è prima posta al livello di vuoto richiesto e, solo successivamente, messa in comunicazione con la camera vera e propria. Il fascio di elettroni ha uno scarso potere di penetrazione che rende impraticabile l’analisi del materiale vivente. Inoltre, date le ridottissime dimensioni richieste per i campioni diventa indispensabile adottare una tecnica specifica nell’allestimento dei preparati che devono essere prelevati, fissati e disidratati.

Microscopia Ottica

Dagli animali sacrificati sono stati prelevati campioni di rene, contenente sia la midollare che la corticale, delle dimensioni di un millimetro quadrato.

Sono stati inclusi con il seguente protocollo:

1. in formalina neutra tamponata al 10% per 12-48 ore 2. alcool 95% tutta la notte

3. alcool assoluto due cambi (8 ore) 4. xilolo tutta la notte

5. xilolo più parafina (1:1) per 1 ora in stufa a 58°C 6. paraffina in stufa a 58°C per 2-3 ore

7. passaggi in stufa a vuoto 2-3 ore

8. Inclusione: i pezzi sono stati messi manualmente in vaschette di metallo precedentemente riscaldate, ponendo attenzione al fatto che la superficie di taglio fosse rivolta verso la base di queste e ricoperte con supporti in plastica. E’ stata colata poi la paraffina all’interno delle vaschette in modo da formare la caratteristica forma del blocchetto da tagliare. Dopo un breve raffreddamento a temperatura ambiente, i blocchetti sono stati posti in frigorifero per accelerare il processo.

Una volta raffreddati, è stato possibile eliminare il supporto metallico per ottenere il blocchetto pronto da tagliare al microtomo.

Prima di procedere al taglio, si è effettuata la xilanizzazione dei vetrini; questa prevede:

1. immersione dei vetrini in soluzione contrad 5% (un sapone) in acqua distillata per 1 ora

2. risciacquo sotto acqua corrente per 3-4 ore 3. passaggio in acqua distillata

4. asciugatura in stufa a 37°C

5. passaggio dei vetrini in alcool assoluto 6. asciugatura in stufa a 37°C

7. preparazione di una soluzione al 2% di 3-amminopropyltriethoxisilane in acetone

8. immersione nella soluzione precedente di ogni gruppo di vetrini per 2 min 9. lavaggio continuo con acqua distillata fino a lavare via la soluzione in

eccesso sulla superficie del vetrino

10. asciugatura dei vetrini in stufa a 37°C da 2 ore a tutta la notte 11. osservazione a temperatura ambiente

E’ stato effettuato per ciascun campione di rene di ratto un taglio seriale: per ognuno di essi sono state raccolte 5 fettine seriate, cioè una in successione all’altra, di 5 µm l’una raccolte sui vetrini xilanizzati. Successivamente sono stati tagliati 100 µm di tessuto a vuoto, corrispondenti a 20 fette dello spessore già impostato, e quindi si è ripartiti a raccogliere le 5 fettine in serie. Il tutto è stato eseguito per 5 volte per ognuno dei campioni in modo da ottenere un totale di 25 fette da 5 µm.

• Sparaffinatura e Colorazione

Passaggio fondamentale prima della colorazione è l’eliminazione del paraffina uperflua mediante la sparaffinatura. Abbiamo fatto 2 passaggi in xilolo da 10 min e successivamente passaggi in alcool a concentrazioni decrescenti (100%,

96%, 70%, 50%) da 5 min ciascuno ed infine un lavaggio in acqua sempre per 5 min. Si può quindi procedere alla colorazione vera e propria.

• Colorazione “Rosso Sirius”

Il Rosso Sirius è un tipo di colorante, basato sul principio dell’impregnazione del tessuto. E’ utilizzato principalmente per l’individuazione delle fibre del collagene ed è quindi particolarmente indicato nella quantificazione del processo di fibrosi all’interno di un tessuto. Questo colorante si ottiene sciogliendo il rosso sirius sotto forma di polvere (Sirius Red F3BA) in una soluzione satura di acido pitrico. Il colorante è presente in soluzione finale alla concentrazione dello 0.1%. Con questa colorazione le fibre di collagene assumono una colorazione rossa che ne permette la distinzione all’interno del tessuto colorato con colorazioni istologiche di routine (es.: ematossilina).

• Analisi quantitativa della deposizione di collagene interstiziale

I vetrini colorati con rosso sirius sono stati sottoposti ad analisi quantitativa presso l’Istituto Clinico “Humanitas” di Rozzano. Mediante una telecamera digitale molto avanzata, collegata ad un microscopio ottico, sono state acquisite le immagine dei tessuti bioptici dopo la messa a fuoco e la taratura automatica del bianco. Grazie ad un programma appositamente ideato, abbiamo poi effettuato la misura dell’area totale della sezione bioptica e calcolato l’area colorata dal rosso sirius, corrispondente al collagene presente nel tessuto. E’ stato considerato il rapporto percentuale tra area “marcata” e area totale, definito come indice di fibrosi. L’analisi statistica è stata effettuata calcolando la

varianza ed utilizzando il test per confronti multipli di Student-Newman-Keuls. Le differenze sono state considerate significative per valori di p<0.05.

• Colorazione PAS

Dopo la sparaffinatura si procede alla colorazione con l’Acido Periodico ed il reattivo di Shiff (PAS). Precisamente si immergono i vetrini con adese le fettine in una soluzione di acido periodico, allo 0.2% o all’1% per 10 min. Dopo si effettua un lavaggio mediante acqua di fonte per 10 min, dopo i quali si applica il reattivo di Shiff , che colora i citoplasmi, per 40 min. Successivamente si aggiunge, 3 volte per 2 min, una soluzione solforosa di lavaggio che si ottiene sciogliendo 1 g di metabisolfito di sodio in 10 ml di HCl 1 N e 200 ml di acqua distillata. A questo punto si immergono i vetrini in Ematossilina Carazzi per 15 min, si lavano con acqua distillata e poi si fanno dei passaggi veloci in alcool assoluto, alcool 95% e xilolo.

L’Ematossilina Carazzi, che colora i nuclei, è stata preparata sciogliendo a caldo 25 g di allume potassico in 350 ml di acqua distillata; quando il sale è tutto disciolto si sospende il riscaldamento e si aggiungono 0.5 g di ematossilina. In un altro recipiente si sciolgono a freddo 0.1 g di iodato potassico in 50 ml di acqua distillata. Una volta raffreddatasi la soluzione di ematossilina, vi si aggiunge quella di iodato e 100 ml di glicerina pura distillata, oltre ad un cristallo di timolo per evitare lo sviluppo di muffe. Questa soluzione così preparata è subito pronta per essere utilizzata.