Sintesi di sonde ad RNA - MATERIALI E METODI

3. MATERIALI E METODI

3.4. Sintesi di sonde ad RNA

La sintesi in vitro delle sonde ad RNA antisenso utilizzate nelle ibridazioni in situ ha richiesto l’inoculo del clone batterico, contenente i costrutti d’interesse, in terreno liquido LB in presenza di antibiotico appropriato, in concentrazione 100 μg/ml. In seguito si è proceduto con la purificazione del DNA plasmidico, utilizzando le soluzioni e il protocollo forniti dalla ditta Promega.

3.4.1. Mini Preps

I 5 ml di cellule batteriche cresciute in terreno liquido LB addizionato con 100 μg/ml di ampicillina, sono stati centrifugati a 12800 rpm per 5 minuti. Il pellet è stato processato mediante il kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). Il pellet è stato risospeso in 250 μl di “ Cell Resuspension Solution”; sono stati aggiunti, poi, 250 μl di “Cell Lysis Solution” e successivamente 10 μl di “Alkaline Protease Solution”; il campione, poi, è stato incubato 5 minuti a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti 350 μl della soluzione di neutralizzazione e si è proceduto con una centrifugazione alla massima velocità per 10 minuti a temperatura ambiente. A questo punto, è stato fatto avvenire il legame del DNA plasmidico seguito da successivi lavaggi con “Wash solution” per rimuovere eventuali contaminanti come sali e metaboliti; infine, il DNA plasmidico è stato eluito con 30 μl di “Nuclease-Free Water”. Infine, è stato centrifugato alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente e il DNA ottenuto è stato conservato a -20˚C.

3.4.2. Digestione del DNA plasmidico mediante enzimi di

restrizione

Il DNA plasmidico è stato digerito con opportuni enzimi di restrizione in modo da produrre dei frammenti linearizzati necessari per la sintesi di sonde ad RNA. Generalmente, gli enzimi utilizzati per la digestione sono Apa o Pst1; la reazione è costituita da: 10 μg di DNA plasmidico, 1-2 unità di enzima per ciascun μg di DNA, buffer 1X, e H2O a volume. La reazione è stata condotta a 37˚C per 2 ore.

3.4.3. Sintesi della sonda

Il DNA plasmidico linearizzato è stato purificato mediante il kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Per ogni reazione di trascrizione in vitro, effettuata in un volume di 20 μl, è stato utilizzato 1 μg di DNA linearizzato; la reazione di trascrizione è costituita da:

 DNA linearizzato X μl

 10X buffer di trascrizione 2 μl

 10X DIG RNA labelling mix 2 μl

 10 mM DTT 2 μl

 Rnasi hinibitor (40U/μl) (Promega) 1 μl

 T7/Sp6 RNA Polimerasi (20U/ μl) (Promega) 2 μl; si trascrive con T7 se il DNA è stato digerito con l’enzima di restrizione Pst1; al contrario, si trascrive con Sp6 nel caso di Apa.

52 Il campione è stato incubato 2 ore a 37ºC; successivamente, è stato aggiunto 1 μl di DNasi RNasi-free (10U/μl) (Roche) per 20 minuti a 37ºC, in modo da rimuovere contaminazioni di DNA linearizzato. A questo punto, ciascun trascritto è stato precipitato over night (ON) a -20ºC, mediante l’aggiunta di 200 μl di EDTA 200 mM, 2.5 μl di LiCL 4M e 75 μl di etanolo 100%. Il giorno successivo, il campione è stato centrifugato a 12000 rpm per 20 minuti a 4ºC e successivamente il pellet è stato lavato con etanolo al 75% e risospeso in 20 μl di H2O RF. Per una precipitazione più veloce, subito dopo il trattamento con DNasi, si può aggiungere acetato d’ammonio 2,5M e due volumi di etanolo 100% ed si lascia precipitare a -20˚C.

Per la sintesi del probe Dj-vas1, non è stato necessario effettuare il clonaggio poiché sono stati utilizzati, per l’amplificazione, due primers forward e reverse alla cui estremità 5’ di quest’ultimo è stato aggiunto il promotore della polimerasi T7, enzima che è stato utilizzato, poi, per la trascrizione del probe. La reazione di sintesi della sonda è stata allestita come descritto in 3.4.3.

3.5. Ibridazione in situ “whole-mount”

Holtfreter; 30%EtOH/ 5/8 Holtfreter) dopo di che sono stati equilibrati in TPBS (PBS e Triton X-100 usato allo 0,1%) per 30 minuti a 4˚C. Il passaggio seguente in TPBS e proteinasi K (20 µg/ml) a 37˚C per 4 minuti è un passaggio molto stringente ed è fondamentale in quanto serve per degradare le proteine, assicurando così la penetrabiltà del probe all’interno degli organismi. Per bloccare l’azione della proteinasi K gli animali sono stati messi in 5/8 Holtfreter 1 minuto a 4˚C. Segue la post-fissazione dei tessuti in una soluzione 4% Formalina/ 5/8 Holtfreter per 1 ora a 4˚C e, subito dopo, 1 ora in 5/8 Holtfreter a 4˚C. Prima della fase di pre-ibridazione, i campioni sono stati acetilati mediante tre passaggi successivi di trietanolammina 0,1 M a pH 7,6 e anidride acetica in scala crescente (0,25%-0,5%). Questi passaggi sono molto importanti in quanto aumentano la specificità della fase di ibridazione e diminuiscono il background (Nogi e Levin, 2005). La fase di pre-ibridazione è stata condotta a 55˚C per 1 ora in una soluzione contenente il 50% di formammide, 5X SSC, 0,1% di Tween20, 0,1 mg/ml di

54 eparina, 0,1 mg/ml di lievito o di tRNA e 0,5 mg/ml di DTT 1M. Anche la fase di ibridazione è stata condotta a 55˚C per circa 16-36 ore in una soluzione contenente il 50% di formammide, 5X SSC, 0,1% di Tween20, 0,1 mg/ml di eparina, 0,1 mg/ml di lievito o di tRNA e 0,5 mg/ml di DTT 1M ed inoltre il 10% di destransolfato. A questa soluzione è stata aggiunta una concentrazione compresa tra i 20 e i 100 ng/ml di “probe” marcato con digossigenina (DIG), sintetizzato mediante trascrizione in vitro. Per la rivelazione del probe è stata applicata una colorazione immunoistochimica utilizzando un anticorpo anti-DIG a cui è coniugato l’enzima fosfatasi alcalina; l’anticorpo è stato incubato con il campione per 2 ore a temperatura ambiente. Il segnale è stato successivamente visualizzato usando come substrato una miscela di nitro-blu- tetrazolio cloruro e 5-bromo-4-cloro-3-indolo (BCIP/NBT), che viene utilizzato dall’enzima coniugato all’anticorpo. Il tempo di incubazione necessario per la rivelazione varia a seconda di quanto è espresso il gene che si vuole mettere in evidenza. I dettagli del protocollo sono mostrati in tabella.

SOLUZIONE

TEMPO TEMPERATURA NOTE

2%Hcl/ 5/8 Holtfreter 4 min 4˚C

Carnoy 120 min 4˚C

MetOH 60 min -20 ˚C

5%H2O2:MetOH 18 ore RT Sotto

lampada alogena

70% EtOH/ 5/8 Holtfreter 30 min 4˚C

50% EtOH/ 5/8 Holtfreter 30 min 4˚C

30% EtOH/ 5/8 Holtfreter 30 min 4˚C

TPBS 30 min 4˚C

Proteinasi K in TPBS 4 min 37˚C 20

μg/ml

5/8 Holtfreter 1 min 4˚C

4% Formalina/ 5/8 Holtfreter 60 min 4˚C

0,1M Trietanolammina 15 min RT Ph 7,6

0,1M Trietanolammina/ anidride acetica 0,25%

55 0,1M Trietanolammina/ anidride acetica

0,5%

15 min RT

Pre-ibridazione 60 min 55˚C

Ibridazione 16-36 h 55˚C

50% Formammide/5X SSC/0,1% Tween20 5 min 55˚C 50% Formammide/5X SSC/0,1% Tween20 60 min 55˚C 50% Formammide/5X SSC/ 0,1% Tween20 60 min 55˚C 50% Formammide/5X SSC/ 0,1% Tween20 60 min 55˚C

Buffer I 5 min RT

Buffer I 30 min RT

10% Blockingsolution/ 5% Lamb serum /Buffer I (Buffer II)

30 min RT 1:2000 antiDIG/Buffer II 120 min RT Buffer I 5 min RT Buffer I 30 min RT Buffer I 30 min RT Buffer I O.N 4˚C AP Buffer 5 min 4˚C BCIP (175mg/ml)/NBT(337.5mg/ml)/10%polyvinil alcohol/AP Buffer 90 min RT TE 10 min RT

3.6. Whole-mount immunostaining

Le planarie sono state incubate per 4 minuti a 4˚C nella soluzione 5/8 Holtfreter (NaCl 2,188 g, Kcl 0,031 g, CaCl2 0,063 g, NaHCO3 0,125 g/100 ml) contenente il 2% di acido cloridrico, in modo da uccidere gli animali e rimuovere il muco intorno all’organismo. In seguito, sono state fissate nella soluzione 5/8 Holtfreter contenente paraformaldeide al 4% per 2 ore a 4˚C e mantenute in agitazione. Gli animali sono stati sottoposti, poi, ad una fase di disidratazione attraverso una scala ascendente di metanolo (30% MetOH/ 5/8 Holtfreter; 50%MetOH/ 5/8 Holtfreter; 70% MetOH/ 5/8 Holtfreter). Per schiarire gli animali, essi sono stati messi in una soluzione di bleaching costituita da MetOH contenente il 5% di perossido di idrogeno overnight a temperatura ambiente e sotto una lampada alogena in agitazione. Il giorno dopo, gli animali sono stati sottoposti ad una fase di reidratamento attraverso una scala discendente di metanolo (70% MetOH in TPBS 0,1 %; 50% MetOH in TPBS 0,1%; 30% MetOH in TPBS 0,1%); ciascun lavaggio è di circa 15 minuti a 4˚C in agitazione, dopo di che sono stati equilibrati in TPBS (PBS e Triton X-100 usato allo 0,1%) per 30 minuti a 4˚C. Successivamente, si è proceduto con la fase di blocking per bloccare il legame aspecifico degli anticorpi. La soluzione di blocking è composta da 1% BSA (albumina di siero bovino) in TPBS ed è stata lasciata agire per 2 ore a temperatura ambiente in agitazione. L’anticorpo primario scelto è stato usato diluito con la soluzione di blocking e lasciato in incubazione tutta la notte a 4°C. Dopo una serie di almeno quattro lavaggi in TPBS per eliminare l’eccesso di anticorpo primario (VC-1), si è proceduto con una nuova fase di blocking con BSA 1% in TPBS e infine gli animali sono stati incubati tutta la notte con l’anticorpo secondario opportuno diluito nella soluzione di blocking. I campioni, dopo almeno quattro lavaggi in TPBS, sono stati montati nei vetrini con Aqua-mount e osservati allo

57 stereomicroscopio Nikon SMZ1500 accessoriato con camera fotometrica, Leica DFC310 FX e software di imaging per microscopia LAS AF. Il segnale è stato analizzato usando un microscopio invertito Nikon Eclipse Ti, dotato di Digital Sight Camera e software di imaging per microscopia NIS-Elements.

 Anticorpo primario utilizzato: VC-1. È un anticorpo monoclonale anti-arrestina specifico di planaria, ottenuto in topo (Agata et al., 1998). Viene usato alla concentrazione di 1:2000;

 Anticorpo secondario utilizzato: 1:1000 anti-topo coniugato ad Alexa Fluor 488 (Cell Signaling)

SOLUZIONE TEMPO TEMPERATURA NOTE

Hcl 2%/ Holtfreter 5/8 4 min 4˚C in agitazione

Paraformaldeide 4%/ Holtfreter 5/8 2h 4˚C in agitazione

MetOH 30%/ Holtfreter 5/8 30 min 4˚C in agitazione

MetOH 50%/ Holtfreter 5/8 30 min 4˚C in agitazione

MetOH 70%/ Holtfreter 5/8 30 min 4˚C in agitazione

MetOH/H2O2 5% ON 4˚C in agitazione

MetOH/ Xilene 1:1 30 min 4˚C in agitazione

MetOH 70%/ TPBS 0,1% 15 min 4˚C in agitazione

MetOH 50%/ TPBS 0,1% 15 min 4˚C in agitazione

MetOH 30%/ TPBS 0,1% 15 min 4˚C in agitazione

TPBS 0,1% 15 min 4˚C in agitazione

TPBS 0,1% + BSA 1% (blocking) 2h RT in agitazione

58 TPBS 0,1% 5 min 4˚C in agitazione TPBS 0,1% 30 min/1h 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione blocking 1h RT in agitazione Ab II / blocking ON 4˚C in agitazione TPBS 0,1% 5 min 4˚C in agitazione TPBS 0,1% 30 min/1h 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione TPBS 0,1% variabile 4˚C in agitazione Montaggio vetrini

3.7. Estrazione proteica e test della caspasi-3

Dopo 7 giorni di trattamento con sanguinarina 0,15 μM, le planarie sono state trasferite in CMF (3 ml; NaH2PO4H2O 2,5 mM, NaCl 14,3 mM, KCl 10,2 mM, NaHCO3, HEPES

15 mM, GLUCOSIO 0,5% , BSA 1%; pH= 7,2) preparato fresco ed Eurodigest (30 μl) per 10 minuti su ghiaccio. Sono state, poi, lavate con 3 ml di CMF e spezzettate su un vetrino in ghiaccio. Dopo averle trasferite in una eppendorf con 250 μl di CMF sono stati aggiunti 17.5 μl di papaina (Sigma) per 1 ora a 25ºC (7,5U di papaina) in agitazione (vortexare di tanto in tanto). Trascorsa l’ora i lisati sono stati filtrati in una membrana nitex con fori di 150 micrometri (in centrifuga 400 rpm per 1 minuto). Le cellule pellettate sono state poi risospese in 50μl di buffer di lisi più 10μl di inibitore di proteasi. BUFFER DI LISI: Tris HCl 20mM pH 7,4 NaCl 150 mM DTT 1mM EDTA 5mM EGTA 5mM TRITON X-100 1%

Lasciare in buffer di lisi per 30 minuti a 4ºC. Durante l’incubazione le cellule sono state agitate ogni 10 minuti. Le proteine sono state centrifugate a 10000 rpm per 15 minuti a 4ºC, separando, quindi, un’aliquota per la misura delle proteine. Le restanti sono state

60 congelate a -80ºC per evitare la perdita di attività nel processo di congelamento- scongelamento; può essere aggiunto un ugual volume di glicerolo.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA

Per misurare la concentrazione delle proteine presenti negli estratti cellulari ottenuti, è stato utilizzato il metodo di Bradford (Bradford, 1976). Sono state fatte delle diluizioni 1:30 (1 μl dell’estratto e 29μl di H2O) a cui sono stati aggiunti, poi, 900μl di soluzione Bradford (Sigma). Infine, è stata misurata la concentrazione allo spettrofotometro.

MISURAZIONE DELL’ATTIVITÀ SPECIFICA DELLA CASPASI-3

Il rilevamento è stato effettuato con uno spettrofotometro lettore di piastre Ultra Microplate reader Bio-Tek Instrumentes Inc utilizzando il software KC Junior ad una lunghezza d’onda di 405 nm. Sono sufficienti 30 μg di proteina per saggio. E’ stata preparata la miscela di reazione di volume finale 100 μl contenente 60 μg di proteina in 20μl di tampone di lisi (massimo volume che si può aggiungere).

Buffer di reazione: per ogni campione sono stati preparati 80 μl di buffer di reazione (50 mM Tris-HCl pH 7,4 e 10 mM DTT e 100 μM di substrato, DEVD-pNa).

L’assorbanza a 405 nm è stata misurata ogni 30 minuti per un tempo totale di 5 ore, fino al raggiungimento di una fase di plateau. La miscela di reazione è stata incubata a 37 ºC fino a 5 ore.

3.8. Estrazione dell’ RNA totale e sintesi del cDNA

Per l’estrazione dell’RNA totale in Dugesia japonica è stato utilizzato il kit EuroGold Total RNA Kit (EuroClone). Sono stati utilizzati sei animali (6 frammenti di testa + 6 frammenti di coda) per ciascuna estrazione (6). Le cellule sono state inizialmente lisate mediante incubazione in una soluzione contenente una grande quantità di ioni caiotropici. Questo buffer di lisi inattiva immediatamente l’RNasi e crea un’appropriata condizione di legame che favorisce l’assorbimento dell’RNA ad una membrana di silicio. La contaminazione da parte del DNA genomico è stata rimossa mediante il trattamento con DNasi, aggiunta direttamente alla membrana. Successivi steps di lavaggi con due differenti buffer sono stati necessari per rimuovere sali, metaboliti ed altre macromolecole cellulari. Infine, l’RNA purificato è stato eluito con acqua RNasi- free, sotto condizioni di bassa forza ionica. La qualità dell’RNA è stata valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1% in TBE. Dopo aver quantificato l’RNA mediante lettura al Nanodrop è stata allestita la reazione di sintesi del cDNA. La retrotrascrizione è stata effettuata utilizzando il QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Quiagen); sono stati presi alcuni μl di ciascun RNA, variabili a seconda della concentrazione ottenuta, e ad essi è stata aggiunta una mix costituita da 1 μl di Reverse- transcription master mix (contenente anche l’inibitore dell’RNasi), 4 μl di Quantiscript RT Buffer 5X, 1 μl di RT Primer Mix (che include Mg2+ e dNTPs) per un volume finale di 20 μl. La sintesi del cDNA è stata effettuata in un termociclatore con il seguente programma:

1. 42ºC per 8 minuti; 2. 42ºC per 30 minuti; 3. 95ºC per 3 minuti.

62 A reazione avvenuta il cDNA è stato diluito e conservato a -20ºC.

3.9. RT-qPCR

Per valutare l’espressione genica è stata utilizzata la quantificazione relativa. La real- time RT-PCR è stata eseguita utilizzando oligonucleotidi senso e antisenso specifici (tabella) che sono stati creati utilizzando il software LaunchNetPrimer. La reazione è stata preparata utilizzando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega); per valutare in tempo reale la quantità di DNA a doppio filamento presente dopo ogni ciclo di sintesi, alla miscela di reazione è aggiunto il SYBR Green, un composto fluorescente intercalante del DNA. La reazione è stata effettuata sul rotore Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR (Corbett Research). Dopo un’iniziale step di attivazione della polimerasi (2 minuti a 95˚C), sono stati effettuati 45 cicli di amplificazione in questo modo: denaturazione 95˚C per 15 secondi, annealing/estensione 58˚C per 60 secondi. La RT- PCR è stata ripetuta almeno tre volte per ciascun gene in esame, utilizzando tre repliche per ciascun cDNA. L’analisi è stata eseguita alla fine della corsa usando il software Rotor-gene e l’analisi statistica utilizzando il software Statplus. Per scegliere il gene di riferimento con cui analizzare l’espressione dei geni in esame, sono stati testati 5 geni housekeeping

Dj-TUBA (D. japonica tubulin alpha chain), Dj-ACTB (D. japonica β-actin), Dj-EF1 (D. japonica elongation factor-1), Dj-GAPDH (D. japonica glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase) e Dj-18s (D. japonica 18S type I ribosomal RNA). Si è, poi,

utilizzato Normfinder (Versione 0.953) al fine di scegliere il gene housekeeping più stabile che è risultato essere Dj-TUBA. Per questa ragione è stato scelto come gene di riferimento per effettuare l’analisi comparativa dell’espressione genica.

Gene name Forward primer Reverse primer

Dj-ACTB 5’-ACACCGTACCAATCTATG-3’ 5’-GTGAAACTGTAACCTCGT-3’ Dj-18S 5’-AACGGCTACCACATCCACGA-3’ 5’-GCACCAGACTTGCCCTCC -3’ Dj-TUBA 5’-ACTGGTTTCAAAGTCGGTATTA-3’ 5’-TCTCCAACATACCAATGAACAA-3’ Dj-EF1 5’-TGGTTACTCTCCAGTCTTAGA-3’ 5’-CAGCTTTCTTAGTTACCTCCTT-3’ Dj-GAPDH 5’-CCAACTGTTTAGCTCCCTTAG-3’ 5’-GATGGTCCATCAACAGTCTTT-3’ Dj-MCM2 5’-TCTGGCGATCTAAGAAGAGG-3’ 5’-ATCCCAATGTTTCACCTGCC-3’ Dj-BRUNO 5’-GACAGAGCCACAAACCAAAG-3’ 5’-TTAATGCTTTTGTTCCAATGTG-3’ Dj-INX1 5’-AGAATCTACTGAAAGCAATG-3’ 5’-ACTACCGAATCCGCAACAC-3’ Dj-INX10 5’-GTGGAAACCATTTGGAAGGA-3’ 5’-CTTCGTCCACAGCATACTAA-3’ Dj-MT-MMPA 5’-TTCAGTGGAAAACTTCAATGG-3’ 5’-CTATTGTTATTGGTAATGCTGG-3’ Dj-MHCA 5’-TAGAAGAGGCAGAATCACAAAT-3’ 5’-TCAGCATTGAGATTACGAACAT-3’ Dj-HKATPase 5’-TGGAGTGGGCTTCTTTGTGA-3’ 5’-TGGCCATTCGTTTTGCTGTT-3’ Dj-VAS1 5’-GTAGCGGGGACGACAGAA-3’ 5’-CTCTTGTTTCACATCGGTATT-3’ Dj-PIWIA 5’-CGGGAACTGTCGTAGATGA-3’ 5’-GCCATAGGTGAAATCTCATTTG-3’ Dj-DAP 5’-TGCGGCACAGGCTTATTAGG-3’ 5’-GAAGTCGTGGGGATTCTGGTAGT-3’ Dj-IFB 5’-GGGGTAAAGAAACTGCCAGA-3’ 5’-CTGAGTAGCATCATTTAATTCC-3’

I primers forward e reverse per l’amplificazione di Dj-HKATPase sono stati disegnati sulla sequenza corrispondente alla subunità α della Dj-H/KATPase identificata da Nogi

3.10. Analisi statistica

Per l’analisi dei dati è stato utilizzato il software STATPLUS. Normalità ed omoschedasticità di due campioni indipendenti sono state testate con i Test di Shapiro- Wilk, Kolmogorov-Smirnov ed F-test. Nei casi in cui l’ipotesi di uguaglianza è rispettata, è stato applicato il T-test per due campioni indipendenti; nel caso contrario, la significatività dei risultati è stata verificata con l’utilizzo di test non parametrici applicabili come alternativa al T-test: Test U di Mann-Whitney, Test di Kolmogorov- Smirnov ed il Test di Wald-Wolfowitz. E’ stato considerato statisticamente significativo un P value minore di 0,05. P value < 0,05: * P value < 0,001: ** P value < 0,0001: *** P value < 0,00001: **** P value < 0,000001: *****

4.1. Valutazione tossicologica della sanguinarina in planaria

Per un primo screening sono state saggiate quattro concentrazioni di sanguinarina (0,05 μM, 0,1 μM, 0,2 μM e 0,3 μM)al fine di scegliere una concentrazione che consentisse di vedere gli effetti dell’alcaloide sugli animali ma nello stesso tempo non causasse la morte degli stessi. Gli animali sono stati tagliati nella regione pre-faringea e lasciati rigenerare per 7 giorni, periodo in cui la rigenerazione è considerata completa; sono stati osservati a tempi diversi di rigenerazione (24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h) controllandone lo stato (vivi/morti). Quindi, dopo 7 giorni di trattamento è stata calcolata la percentuale per la quale si ha il 50% e il 95% di morti, LC50 e LC95 rispettivamente, utilizzando probit-analysis. In particolare, a concentrazioni di 0,05 μM e 0,1 μM la percentuale di mortalità è pari allo 0 %; alla concentrazione di 0,2 μM è pari a 83,33 % ed infine alla concentrazione di 0,3 μM la mortalità è del 100%.

Table 1

Conc Log10 C % dead 168h Corrected % _Probits

0,05 -1,3 0 0,4 -

0,1 -1 0 0 2,67

0,2 -0,7 83,33 83 5,95

0,3 -0,52 100 96,66 7,65

In tabella 1 sono riportati i valori delle percentuali di mortalità dopo 168 h di trattamento. Queste percentuali sono state, successivamente, convertite in probits (Muhammad Akram Randhawa, 2009) (Tabella 2).

67 Infine, utilizzando Excel, è stata costruita una retta di taratura ottenuta riportando nel grafico il Log10 della concentrazione, sull’asse delle ascisse, e i valori di Probits, in ordinata. Per interpolazione con la retta di taratura, è stato trovato il Log10 della concentrazione corrispondente ad un valore di probit pari a 5.00. Ciò ha consentito, in ultima analisi, di calcolare il valore di LC50 ottenuto come l’inverso del suo Log10. La stessa cosa è stata fatta per calcolare il valore di LC95.

Log10 [ ] [ ]M

LC50

-0,78 0,22

LC95

-0,62337 0,376

In definitiva, quindi, il 50% di mortalità (LC50) si ha ad una concentrazione di sanguinarina pari a 0,22 μM; il 95% (LC95), invece, ad una concentrazione pari a 0,376 μM. Per questo, per i successivi esperimenti, è stata utilizzata una concentrazione di sanguinarina pari a 0,15 μ corrispondente al 20% di mortalità.

La stessa procedura è stata utilizzata per valutare la tossicità della sanguinarina in planarie intatte:

Log10 [ ] [ ]M

LC50

-0,6545 0,221564

LC95

-0,41109 0,38807

I valori di LC50 e di LC95 sono pressochè uguali sia in animali rigeneranti che in animali intatti, 0,22 μM e 0,39 μM, rispettivamente.

4.2. Assorbimento della sanguinarina nelle planarie

La distribuzione della sanguinarina è stata osservata in animali vivi sfruttando la naturale emissione di fluorescenza rossa che la sanguinarina emette (con lunghezza d’onda 510-560 nm). Infatti, gli animali trattati con l’alcaloide sono stati osservati al microscopio a fluorescenza ed è stata rilevata una forte fluorescenza rossa diffusa in tutto il corpo dell’animale, soprattutto a livello dell’intestino (Figura 17).

Figura 17. Assorbimento della sanguinarina in planaria. A) Morfologia dell’intestino di una

planaria; B) Visualizzazione in campo chiaro di branche intestinali in una regione terminale del corpo di una planaria; C) Visualizzazione a 510-560 nm della stessa regione. La fluorescenza rossa della sanguinarina appare accumulata all’interno delle branche intestinali dell’animale. Scale bar: 150 μm in (B) e (C).

4.3. Osservazione degli effetti prodotti dalla sanguinarina sulla

rigenerazione

Gli animali sono stati tagliati nella regione pre-faringea e lasciati rigenerare in una soluzione contenente sanguinarina 0,15 μM per 7 giorni. Dopo 7 giorni di trattamento le planarie sono state osservate al microscopio ottico. In particolare, i frammenti caudali rigeneranti la testa mostravano evidenti fenotipi anormali: la maggior parte di essi, infatti, presentava un blastema molto piccolo con una morfologia anomala (Figura 18); talvolta, il blastema era completamente assente. Al contrario, i frammenti di teste rigeneranti la coda risultavano paragonabili a quelli di controllo.

Figura 18. A) Frammento di testa rigenerante la coda nel controllo (DMSO 0,015%); B)

Frammento di testa rigenerante la coda in seguito al trattamento con sanguinarina 0,15 μM; C) Frammento di coda rigenerante la testa nel controllo (DMSO 0,015%); D) Frammento di coda rigenerante la testa, in seguito al trattamento con sanguinarina 0,15 μM; E, F) Visualizzazione di diversi frammenti di coda rigeneranti la testa che in seguito al trattamento con sanguinarina 0,15 μM mostrano evidenti anomalie nella regione rigenerante. La parte anteriore è in alto. Scale bars: 500 μm in (A-E); 100 μm in (F).

Per valutare se effettivamente ci fosse una riduzione significativa delle dimensioni del blastema è stata effettuata l’analisi morfometrica in animali rigeneranti; in quest’analisi è stata misurata l’area dell’intero corpo dell’animale e quella del blastema e sono state

Nel documento Valutazione degli effetti prodotti in vivo da un alcaloide di origine naturale, la sanguinarina, nella planaria Dugesia japonica. (pagine 50-131)