mTOR è una grande serina/treonina proteina chinasi che integra segnali provenienti da fattori di crescita, nutrienti e fattori di stress e controlla molteplici processi a valle, inclusi la traduzione dell’mRNA, la sintesi dei lipidi e dei nucleotidi, la progressione del ciclo cellulare, l’autofagia e la forma e la sopravvivenza delle cellule [118].
6.1 STRUTTURA E ATTIVAZIONE
Dal punto di vista strutturale mTOR è costituita da 2549 amminoacidi e comprende diversi domini strutturali conservati. L’estremita N-terminale possiede 20 ripetizioni HEAT (da Huntingtin Elongation factor PP2A and Tor kinase) in tandem. Ciascuna ripetizione HEAT è costituita da due α eliche di circa 40 amminoacidi, ciascuna con un proprio specifico pattern di residui idrofobici e idrofilici. Le ripetizioni HEAT in tandem sono presenti in molte proteine e sono implicate nelle interazioni proteina-proteina [119].
L’estremità C-terminale di mTOR contiene il dominio chinasico PIKK (PI3-kinase-related kinase), che presenta una stretta omologia di sequenza con il dominio chinasico delle
fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), e il dominio FRB, che si trova subito a monte del dominio catalitico, su cui si va a legare il complesso inibitorio FKBP12-rapamicina. Inoltre mTOR contiene un dominio FAT (FRAP, ATM, TRAP) relativamente grande, che è presente anche in altre proteine PIKK e un dominio regolatorio (RD) posto tra il dominio FAT e il dominio FATC. Il dominio FATC è assolutamente necessario per l’attività di mTOR, e la delezione di anche un solo amminoacido al livello di questo dominio abolisce l’attività di mTOR [120, 121] (Figura 15).
Figura 15: Struttura di mTOR
La proteina mTOR interagisce con diverse proteine per formare due complessi distinti denominati complesso mTOR1 (mTORC1) e complesso mTOR2 (mTORC2). mTORC1 e mTORC2 sono costituiti rispettivamente da sei e sette proteine:
1. Sia mTORC1 che mTORC2 condividono la subunità catalitica di mTOR, una proteina simile alla subunità beta della proteina LST8/G dei mammiferi (mLST8/GβL), DEPTOR (DEP domain containing mTOR-interactin-protein) e il complesso Tti1/Tel2;
2. Raptor (regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin) e PRAS40 (proline-richAktsubstrate 40 kDA) sono specifiche solo di mTORC1;
3. Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR), mSin1 (mammalian stress activated mapkinase-interacting protein 1) e protor 1/2 (protein observed with rictor 1 e 2) fanno parte solamente di mTORC2.
6.2 REGOLAZIONE DI mTOR
Il complesso mTOR1 (mTORC1) e il complesso mTOR2 (mTORC2) mostrano una diversa sensibilità all’azione inibitoria della rapamicina, che sopprime prevaloentemente le attività di mTORC1.
Il complesso mTORC1 viene attivato in risposta a diversi segnali intra ed extracellulari, come: fattori di crescita, citochine, lo stato energetico, ossigenazione tissutale e la
disponibilità di amminoacidi, per controllare molteplici funzioni relativfe al metabolismo e alla crescita cellulare [122].
Diversi regolatori a monte di mTORC1 convergono sull’eterodimero tra Sclerosi Tuberosa 1 (TSC1) e TSC2 ( nota come Tuberina); il complesso che si forma prevede l’azione stabi8lizzante di TSC1 su TSC2 impedendo così la sua degradazione, mentre TSC2 funge da proteina attivante la GTPasi (GAP) per Rheb [123]. Rheb unito a GTP si lega e attiva mTORC1, mentre il complesso TSC1/2 normalmente inibisce mTORC1 favorendo lo stato inattivo di Rheb [122] (Figura 16).
Figura 16: Regolazione di mTORC1 e i vari processi a valle da lui regolati.
Fattori di crescita, come l’insulina, aumentano l’attività di mTORC1 promuovendo la fosforilazione e la degradazione del complesso TSC1/2. Questo meccanismo si crea tramite l’attivazione del recettore delle tirosin chinasi (RTK), che provoca l’attivazione di PI3K e del pathway di Ras. Le chinasi attivatrici di queste vie: proteina chinasi B (PKB/AKT) e la chinasi regolata da segnali extracellulari ERK, inducono la fosforilazione di TSC1/2. Citochine pro-infiammatorie, come TNF-α, aumentano l’attivazione di mTORC1 tramite la via IkB chinasi (IKK) inattivando il compolesso TSC1/2.
In risposta all’ipossia o alla carenza energetica, AMPK blocca mTORC1 e induce l’aumento della funzione di TSC2 e Raptor.
Anche aumenti intracellulari di livelli di amminoacidi, in particolare arginina e leucina, promuovono l’attivazione di mTORC1 [124].
mTORC1 può favorire la crescita cellulare regolando negativamente l’autofagia, il principale processo di degradazione cellulare [125].
mTORC1 è inibito da un basso livello di nutrienti, carenza di fattori di crescita e dalla rapamicina. I bersagli a valle dio mTORC1 sono la proteina chinasi 1 p70-s6 (S6K1) e 4E- BP1, quest’ultima lega il fattore eucariotico di iniziazione 4E. mTORC1 fosforila S6K1 su due residui causando la modificazione di un residuo di treonina (T389). Questo evento stimola una successiva fosforilazione si S6K1 ad opera di PDK1. La S6K1 una volta che è attiva può stimolare l’inizio della sintesi proteica attraverso l’attivazione della proteina ribosomiale S6, un componente del ribosoma e altri componenti dell’apparato trascrizionale. S6K1 paqrtecipa anche al circuito a feedback positivo su mTORC1, andandolo a stimolare.
È stato osservato che mTORC1 fosforila almento quattro residui di 4E-BP1, questo fattore quando non è fosforilato si lega al fattore iniziante la trascrizione eIF4E prevenendo così il suo legame sull’mRNA. Sotto fosforilazione ad opera di mTORC1, 4E-BP1 rilascia eIF4E permettendo di svolgere la sua funzione.
6.3 SIRT1 E mTOR: RECIPROCA INIBIZIONE
Il sistema sirtuinico e il pathway di mTOR sono implicati entrambi nel pathway della longevità, come evidenziano numerosi studi sperimentali. In particolare mTOR sembra promuovere l’invecchiamento in molti organismi animali, agendo in modo inibitorio rispetto a SIRT1. Nei mammiferi l’asse PI3K/Akt/mTOR viene attivato dalla disponibilità di nutrienti (glucosio, amminoacidi), insulina, citochine, radicali liberi e fattori di crescita. A sua volta mTOR inibisce SIRT1, aumenta la sintesi proteica e inibisce l’autofagia, favorendo così il processo di invecchiamento. Inoltre l’iperattivazione cellulare causa un segnale di resistenza a feedback. Ad esempio, con l’attivazione della chinasi S6 (S6K) mediata da mTOR si ha insulino resistenza. Tutte queste alterazioni possono essere connesse all’invecchiamento e alle patologie età-correlate, come tumori benigni e maligni, ipertrofia cardiaca, osteoporosi, sindrome metabolica, aterosclerosi, ipertensione, neuro degenerazione e degenerazione maculare età-correlata.
Di contro, la restrizione calorica, l’esercizio fisico e il Resveratrolo (un potente attivatore del sistema sirtuinico) attivano SIRT1 che a sua volta interferisce con il pathway PI3K/Akt/mTOR.
SIRT1 infatti inibisce mTOR e promuove l’autofagia, ossia quel processo che permette alle cellule di degradare ed eliminare i componenti vecchi o danneggiati prima che questi possano causare gravi danni alle stesse. Inoltre mTOR viene inibito anche dalla restrizione calorica, dall’esercizio fisico e dall’AMPK. L’AMPK infatti è in grado di fosforilare raptor, portando al legame di una proteina 14-3-3 e alla inibizione allosterica di mTOR. Attraverso la regolazione di tutti questi processi, SIRT1 gioca quindi un ruolo determinante nel contrastare gli effetti pro-aging mediati da mTOR, consentendo così l’ottenimento di benefici per la salute e un miglioramento delle aspettative di vita [126].
6.4 mTOR E PARKINSON
Anche nel caso di mTOR, molti lavori in letteratura hanno analizzato l’esistenza di una eventuale relazione tra questa proteina ed il PD, sebbene però il meccanismo alla base ancora oggi rimane sconosciuto. Negli ultimi anni ci sono state molte prove del fatto che il signalling di mTOR risulta alterato durante la progressione del PD ed una sua eventuale attivazione potrebbe portare ad una protezione contro questa patologia. Tuttavia, il ruolo di mTOR nel PD sembra essere controverso, come emerso dai molti studi che ne evidenziano un ruolo neuroprotettivo o neurotossico in diversi modelli di PD. A tal proposito sono state utilizzate molte sostanze tossiche in grado di riprodurre la patogenesi del PD ed in tali modelli è stata evidenziato come tali sostanze siano in grado di sopprimere il signalling di mTOR e di ridurre la vitalità cellulare, mentre l’over-espressione di mTOR può prevenire la perdita cellulare neuronale indotta dalle tossine. In aggiunta, Domanskyi et al. (2011) [127] hanno provato che la delezione genica di PTEN (fattore che codifica per una fosfatasi lipidica) provoca l’attivazione di mTOR ed è in grado di proteggere i neuroni dopaminergici contro l’insulti neurotossico in modelli murini di PD. Al contrario, la soppressione o la down regolazione dipendente dallo stress ossidativo di Tnfaip8/ Oxi-α, un potenziale attivatore di mTOR, può prevenire l’attivazione di mTOR e potenziare la morte neuronale legata allo stress ossidativo. A conferma di ciò, REDD1, un potente inibitore di mTORC1 risulta altamente espresso nel cervello di pazienti con il PD e iper- regolato in modelli cellulari di PD indotti dall’accumulo di neurotossine. Infine, è stato suggerito un ulteriore ruolo dell’attivazione di AKT/mTOR nei neuroni dopaminergici
della substantia nigra, evidenziando come ciò possa facilitare la rigenerazione delle lesioni assonali dovute alle neurotossine [127].
Un ulteriore meccanismo che potrebbe spiegare il ruolo di mTOR nel PD è, anche in questo caso, la modulazione dell’autofagia attraverso questa proteina. A tal proposito, è stato visto come l’inibizione dell’autofagia mediante l’attivazione di mTOR possa prevenire la lesione dei neuroni dopaminergici durante lo stress ossidativo, descrivendo l’autofagia come un processo ipoteticamente dannoso per i neuroni dopaminergici. D’altra parte, un gran numero di studi che trattano la tossicità dell’α-sinucleina nel PD supportano, al contrario, l’idea che l’autofagia degradi ed elimini α-sinucleina, proteggendo così i neuroni dopaminergici.[128,129].