Uso previsto e indicazioni per l'uso
L'unità QX200 Droplet Digital PCR, IVD è un sistema a reazione a catena della polimerasi digitale ideato per misurare e separare i vari segnali generati in un dosaggio diagnostico in vitro da un campione clinico. Questa strumentazione viene utilizzata con un dosaggio specifico per misurare più analiti simili che determinano un singolo indicatore di ausilio nella diagnosi.
1.2 Componenti del sistema
Il sistema è composto da due strumenti e da software, materiali di consumo e reagenti associati (Tabella 1.1):
■
■ QX200 Droplet Generator, IVD: utilizza un sistema microfluidico e reagenti proprietari per eseguire la partizione dei campioni in ~20.000 goccioline di dimensioni nell'ordine dei nanolitri
■
■ QX200 Droplet Reader, IVD: dopo l'amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, questo strumento analizza singolarmente ciascuna gocciolina utilizzando un sistema di rivelazione a due colori (impostato per rivelare FAM e uno tra VIC, HEX ed EvaGreen); il conteggio delle goccioline PCR positive e PCR negative permette la quantificazione assoluta del DNA target in formato digitale utilizzando il software QuantaSoft™ I materiali supplementari necessari per eseguire ddPCR sono elencati in Tabella 1.2.
Tabella 1.1. Componenti del sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. Articoli spediti con il sistema QX200 ddPCR, IVD (n. catalogo 17000034). Il numero di catalogo fa riferimento agli articoli per la sostituzione (le quantità possono variare).
Componente Descrizione N. catalogo
QX200 Droplet Generator, IVD
QX200 Droplet Generator, IVD Strumento utilizzato per la generazione di goccioline 12001049 Cartucce e guarnizioni (24) del Cartuccia microfluidica utilizzata per la miscelazione di campione 186-4007 generatore di goccioline DG8™ e olio per generare goccioline; le guarnizioni sigillano la cartuccia
per prevenire l'evaporazione e applicare la pressione necessaria per la generazione delle goccioline
Supporto della cartuccia del Fissa in posizione la cartuccia del generatore di goccioline nello 186-3051 generatore di goccioline strumento per la generazione delle goccioline
Cavo di alimentazione Collega il sistema QX200 Droplet Generator, Chiamare
IVD all’alimentazione l'assistenza tecnica
QX200 Droplet Reader, IVD
QX200 Droplet Reader, IVD Strumento utilizzato per la lettura delle goccioline e la raccolta dati 12001045 PC laptop e software QuantaSoft Si collega al sistema QX200 Droplet Reader, IVD per la raccolta 186-3007
e l'analisi dei dati
Supporti per piastre del lettore Consentono di posizionare la piastra per PCR a 96 pozzetti 29711024 di goccioline (2) nel lettore di goccioline
Cavo USB 2.0 Collega il sistema QX200 Droplet Reader, IVD al PC Chiamare l'assistenza tecnica Cavo di alimentazione Collega il sistema QX200 Droplet Reader, IVD all'alimentazione Chiamare
l'assistenza tecnica
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 3 Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
Tabella 1.2. Materiali supplementari necessari.
Componente Consigliato N. catalogo e fornitore
QX200 Droplet Generator, IVD Reagenti per la rivelazione delle sonde
PCR supermix ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) 186-3023, 186-3024, 186-3025 ddPCR Supermix for Probes 186-3010, 186-3026, 186-3027,
186-3028
One-Step RT-ddPCR Supermix for Probes 186-3021, 186-3022 Olio per la generazione di goccioline Droplet Generation Oil for Probes 186-3005
Controllo ddPCR Buffer Control Kit for Probes 186-3052
Reagenti per rivelazione EvaGreen
PCR supermix QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 186-4033, 186-4034, 186-4035,
186-4036
Olio per la generazione di goccioline Droplet Generation Oil for EvaGreen 186-4005, 186-4006
Controllo QX200 Buffer Control Kit for EvaGreen 186-4052
Materiali di consumo e altri materiali
Pipette Pipetta da 20 μL per il caricamento dei campioni Rainin L-20 Pipetta da 50 μL per il trasferimento delle goccioline Rainin L-50, L8-50 Pipetta a 8 canali, 200 μL per olio Rainin L8-200
Puntali per pipette Con filtro Rainin GP-L10F, GP-L200F
Piastre per PCR a 96 pozzetti Piastra semi-skirted twin.tec a 96 pozzetti Eppendorf 951020362 Vaschetta reagenti Qualsiasi
Pellicole di sigillatura per piastre Pellicole di sigillatura perforabili per piastre 181-4040
Sigillatrice per piastre PX1™ PCR Plate Sealer 181-4000
Strip con 8 tappi Qualsiasi
QX200 Droplet Reader, IVD
Olio del lettore di goccioline ddPCR Droplet Reader Oil 186-3004 Flacone per i rifiuti del lettore di goccioline Flacone per i rifiuti vuoto N/A Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. A sinistra, l'unità QX200 Droplet Reader, IVD. A destra, l'unità QX200 Droplet Generator, IVD.
DIR ID 10000052067/Z03/000/A 2015-12-11 Released CM# 500000002967
Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
1.3 Flusso di lavoro Droplet Digital PCR
Il flusso di lavoro Droplet Digital PCR è articolato nelle seguenti fasi (per il flusso di lavoro completo sono necessarie 4,5-5,5 ore):
■
■ Preparazione di campioni predisposti per la PCR: combinare il campione di acido nucleico (DNA o RNA), i primer e le sonde (FAM, VIC, o HEX) o il colorante intercalante (EvaGreen) con Bio-Rad ddPCR Supermix (vedere la Tabella 1.2)
■
■ Produzione delle goccioline: caricare 20 μL della reazione ddPCR nella cartuccia del generatore di goccioline DG8; quindi caricare la cartuccia nel sistema QX200 Droplet Generator, IVD per eseguire la partizione del campione in goccioline. Il modello QX200 Droplet Generator, IVD utilizza un sistema microfluidico per combinare olio e campione acquoso e creare le goccioline di dimensioni nell'ordine dei nanolitri necessarie per l'analisi ddPCR. È in grado di elaborare un massimo di otto campioni contemporaneamente in circa 2 minuti.
■
■ Esecuzione della PCR: pipettare le goccioline dalla cartuccia in una piastra per PCR a 96 pozzetti e sigillare la piastra con pellicola di sigillatura utilizzando un'unità PX1 Plate Sealer (vedere la Tabella 1.2). Eseguire la PCR fino all'end point (~40 cicli) utilizzando un termociclatore
■
■ Lettura delle goccioline: caricare la piastra nel sistema QX200 Droplet Reader, IVD e avviare l'acquisizione.
Il lettore di goccioline aspira ciascun campione, singolarizza le goccioline e invia un flusso composto da una gocciolina alla volta a un rivelatore a due colori. Il rivelatore legge le goccioline per determinare quali contengono un target (+) e quali non lo contengono (–)
In caso di lettura o quantificazione delle goccioline e recupero di materiale dalle stesse in parallelo, preparare due set di reazioni, uno per ciascuna applicazione. Per esempio, è possibile generare un set di otto pozzetti in un'unica cartuccia DG8: quattro pozzetti verranno letti dopo il ciclo termico e gli altri quattro non verranno letti
■
■ Analisi dei risultati: il lettore di goccioline si collega a un computer laptop in cui è in esecuzione il software QuantaSoft. Il software mette a disposizione un insieme completo di strumenti per configurare e denominare i campioni, far funzionare e controllare lo strumento e analizzare i risultati. Inoltre, legge le goccioline positive e negative in ciascun campione e traccia il grafico della fluorescenza gocciolina per gocciolina. La frazione di goccioline positive in un campione determina la concentrazione del target espressa in copie/μL
Il sistema QX200 ddPCR è compatibile con le caratteristiche chimiche delle sonde di idrolisi (TaqMan) ed è in grado di rilevare fino a due sonde contemporaneamente (FAM/VIC o FAM/HEX) utilizzando una matrice di deconvoluzione dei coloranti nel software per garantire la specificità per il target. Inoltre è compatibile con le caratteristiche chimiche EvaGreen. Con questo sistema utilizzare esclusivamente le supermix approvate da Bio-Rad elencati nella Tabella 1.2;
l'utilizzo di supermix non approvati può danneggiare lo strumento e fa decadere la garanzia.
1.4 Configurazione del sistema e istruzioni operative generali
■
■ Collegare i sistemi QX200 Droplet Generator, IVD e QX200 Droplet Reader, IVD a una sorgente di alimentazione utilizzando i cavi di alimentazione e l'adattatore di alimentazione in dotazione. Lasciare 25,4 cm (10") di spazio libero sul retro e 12,7 cm (5") a destra e sinistra di ciascuno strumento per consentire una ventilazione adeguata.
Posizionare lo strumento in modo che possa essere facilmente scollegato dalla sorgente di alimentazione qualora ciò fosse necessario ai fini degli interventi di manutenzione dell'apparecchiatura.
■
■ Collegare il sistema QX200 Droplet Reader, IVD al PC laptop utilizzando il cavo USB 2.0 in dotazione. Il software QuantaSoft è pre-installato nel laptop
■
■ Accendere il sistema QX200 Droplet Reader, IVD utilizzando l'interruttore sul retro. L'indicatore di stato emette una luce verde fissa a indicare che l'alimentazione è accesa. Per accendere il sistema QX200 Droplet Generator, IVD collegarlo a una sorgente di alimentazione
■
■ Per il lettore di goccioline è necessario il relativo olio (numero di catalogo 186-3004). Fare riferimento alla Sezione 4.2.2 per istruzioni sul cambio dell'olio del lettore di goccioline
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 5 Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
Utilizzo del sistema
QX200 ™ Droplet Reader, IVD
2
Il marchio IVD CE è valido esclusivamente per il sistema QX200 Droplet Reader, IVD, il sistema QX200 Droplet Generator, IVD e il sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. In caso di utilizzo di qualsiasi componente privo di marchio IVD CE, inclusi reagenti o accessori, l'uso deve essere esclusivamente a fini di ricerca.
1. Accendere il sistema QX200 Droplet Reader, IVD utilizzando l'interruttore sul retro. Attenderne il riscaldamento per 30 min; quindi accendere il PC e avviare il software QuantaSoft™.
2. Controllare le spie luminose sul lato anteriore del lettore di goccioline (Tabella 2.1).
Le prime due spie a sinistra devono emettere una luce verde fissa a indicare che l'alimentazione è accesa, che è presente una quantità sufficiente di olio nel relativo recipiente e che il volume di liquido nel flacone dei rifiuti è <700 mL. Se le spie emettono una luce ambra lampeggiante, non è possibile avviare l'acquisizione;
svuotare il flacone dei rifiuti o cambiare l'olio (vedere la Sezione 4.2.2).
Tabella 2.1. Spie luminose di stato sull'unità QX200 Droplet Reader, IVD.
Luce verde fissa Alimentazione accesa Livelli flaconi OK* Piastra in sede Acquisizione completata
Luce verde lampeggiante — Olio <30% o rifiuti >70%** — Acquisizione in corso
Luce ambra lampeggiante — Olio <10% o rifiuti >90%*** — Errore durante l'acquisizione
Spento Alimentazione spenta — Piastra assente Inattività
* La quantità di olio e la capacità residua del flacone dei rifiuti sono sufficienti per acquisire 96 pozzetti.
** L'acquisizione può essere avviata se il numero di pozzetti è <96 (per esempio, per 24 pozzetti è sufficiente il 19% di olio);
se l'olio non è sufficiente, il software non consente l'avvio dell'acquisizione.
*** Il software non consente di avviare l'acquisizione.