QX200 ™ Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft ™
Manuale di istruzioni
Firma 1214 10000044967 Versione B IT/IT
Web site www.bio-rad.com USA 800 424 6723 Australia 61 2 9914 2800 Austria 43 1 877 89 01 Belgio 03 710 53 00 Brasile 55 11 3065 7550 Canada 905 364 3435 Cina 86 21 6169 8500 Corea 82 2 3473 4460 Danimarca 44 52 10 Finlandia 09 804 22 00 Francia 01 47 95 69 65
Germania 49 89 31 884 0 Giappone 81 3 6361 7000 Grecia 30 210 9532 220 Hong Kong 852 2789 3300 India 91 124 4029300 Israele 03 963 6050 Italia 39 02 216091 Messico 52 555 488 7670 Norvegia 23 38 41 30 Nuova Zelanda 64 9 415 2280 Paesi Bassi 0318 540666 Polonia 48 22 331 99 99 Portogallo 351 21 472 7700 Regno Unito 020 8328 2000 Repubblica Ceca 420 241 430 532 Russia 7 495 721 14 04
Singapore 65 6415 3188 Spagna 34 91 590 5200 Sud Africa 27 (0) 861 246 723 Svezia 08 555 12700 Svizzera 026 674 55 05 Taiwan 886 2 2578 7189 Thailandia 1800 88 22 88 Ungheria 36 1 459 6100
Life Science Group
Bio-Rad
Laboratories, Inc.
186-3007 12001045 17000034
Revisione manuale: B Versione software: 1.7
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Assistenza tecnica Bio-Rad
Per ottenere supporto e assistenza tecnica, rivolgersi al reparto dell'assistenza tecnica Bio-Rad. Negli Stati Uniti il reparto dell'assistenza tecnica è aperto da lunedì a venerdì, dalle 05:00 alle 17:00, fuso orario del Pacifico.
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Avvertenze legali
Nessuna parte della presente pubblicazione può essere riprodotta o trasmessa in qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo, elettronico o meccanico, inclusa la fotocopia, la registrazione o con qualsiasi sistema di archiviazione e recupero di informazioni, senza autorizzazione scritta da parte di Bio-Rad Laboratories.
Bio-Rad si riserva il diritto di modificare i suoi prodotti e servizi in qualsiasi momento. Il presente manuale di istruzioni è soggetto a modifiche senza preavviso. Sebbene siano state redatte al fine di garantirne l'accuratezza, Bio-Rad non si assume alcuna responsabilità per errori o per qualsiasi danno derivante dall'applicazione o dall'uso delle presenti informazioni.
Excel e Microsoft sono marchi di Microsoft Corporation. FAM e VIC sono marchi di Applera Corporation.
TaqMan è un marchio di Roche Molecular Systems, Inc. twin.tec è un marchio di Eppendorf AG.
EvaGreen è un marchio di Biotium, Inc. Bio-Rad Laboratories, Inc. ha ottenuto la licenza da parte di Biotium, Inc. per la vendita di reagenti contenenti il colorante EvaGreen per l'uso in applicazioni PCR in tempo reale, esclusivamente a fini di ricerca.
I termociclatori e i termociclatori in tempo reale di Bio-Rad sono coperti da uno o più dei seguenti brevetti USA o delle rispettive controparti estere di proprietà di Eppendorf AG: brevetti USA numero 6.767.512 e 7.074.367.
Questo prodotto e/o l'uso dello stesso è coperto da rivendicazioni di brevetti USA e/o da domande di brevetto pendenti negli USA e in altri Paesi di proprietà di o concesse in licenza a Bio-Rad Laboratories, Inc. L'acquisto del prodotto include il diritto limitato, non trasferibile ai sensi di detta proprietà intellettuale per l'uso del prodotto esclusivamente a fini di ricerca interni. Non vengono conferiti diritti per usi diagnostici. Non vengono conferiti diritti per l'uso del prodotto per applicazioni commerciali di qualsiasi natura, inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, produzione, controllo di qualità o servizi commerciali, quali servizi contrattuali o tariffe a prestazione. Informazioni in merito alle licenze per tali usi possono essere ottenute rivolgendosi a Bio-Rad Laboratories. È responsabilità dell'acquirente/utente finale acquisire ulteriori diritti di proprietà intellettuale eventualmente richiesti.
Copyright © 2015 di Bio-Rad Laboratories, Inc. Tutti i diritti riservati.
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Prefazione
Sicurezza e conformità normativa
Questo strumento è stato testato ed è risultato conforme ai requisiti applicabili dei seguenti standard elettromagnetici e di sicurezza:
■
■ IEC 61010-1:2010 (3a ed.), EN61010-1:2010 (3a ed.). Apparecchi elettrici di misura, controllo e utilizzo in laboratorio — Parte 1: requisiti generali
■
■ EN 61326-1:2006 (Classe A). Apparecchi elettrici di misura, controllo e utilizzo in laboratorio. Requisiti EMC, Parte 1: requisiti generali
■
■ UL 61010-1:2004, Apparecchi di laboratorio, apparecchi di test e misura e controlli di processi industriali
■
■ CAN/CSA 22.2 n. 61010-1-04, Requisiti di sicurezza per gli apparecchi elettrici di misura, controllo e utilizzo in laboratorio, Parte 1: requisiti generali
Questo apparecchio genera, utilizza e può emettere energia in radiofrequenza e, se non installato e utilizzato in conformità al manuale di istruzioni, può provocare interferenze dannose alle comunicazioni radio. Il funzionamento di questo apparecchio in una zona residenziale ha la potenzialità di provocare interferenze dannose, nel qual caso l'utente è tenuto a correggere tali interferenze a proprie spese.
Il marchio CE indica che il produttore garantisce la conformità del prodotto ai requisiti essenziali della Direttiva Europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medicali per diagnosi in vitro.
Il marchio CSA indica che un prodotto è stato testato in base agli standard del Canada e degli Stati Uniti e che è conforme ai requisiti degli standard pertinenti.
Questo apparecchio è stato testato ed è risultato conforme ai limiti per i dispositivi digitali di Classe A ai sensi della Parte 15 delle normative FCC. Tali limiti mirano a garantire una protezione ragionevole nei confronti di interferenze dannose quando l'apparecchio viene impiegato in un ambiente commerciale.
Il simbolo della direttiva sui rifiuti di apparecchiature elettriche ed elettroniche (RAEE) indica che quando l'utente finale desidera smaltire questo prodotto, quest'ultimo deve essere inviato a una struttura di raccolta separata per il recupero e riciclaggio.
Questo strumento è destinato all'uso esclusivamente da parte di personale addestrato.
Non posizionare l'apparecchio in modo da ostacolare il collegamento e lo scollegamento della spina dell'alimentatore. La spina dell'alimentatore funge da dispositivo di scollegamento.
All'interno non sono presenti componenti che richiedono manutenzione da parte dell'utente.
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | iii Prefazione Prefazione
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
Avvisi di sicurezza dello strumento
Modifiche apportate a questo strumento fanno decadere la garanzia e la certificazione di sicurezza e determinano rischi potenziali per la sicurezza. Questo strumento è destinato esclusivamente all'uso in laboratorio. Bio-Rad Laboratories non si assume alcuna responsabilità in caso di lesioni o danni provocati dall'uso di questo strumento per scopi diversi da quelli previsti, o da modifiche dello strumento non eseguite da Bio-Rad Laboratories o da un agente autorizzato. Rispettare le specifiche di sicurezza qui riportate e descritte nel presente manuale. Usare esclusivamente il cavo di alimentazione in dotazione con lo strumento, utilizzando soltanto l'adattatore della spina specifico per le prese elettriche della propria area geografica. L'uso di supermix non approvati può provocare danni allo strumento e fa decadere la garanzia.
Formazione all'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI)
Si consiglia di indossare guanti adeguati all'uso di oli e piastre per campioni. I requisiti OSHA in merito ai DPI sono illustrati nel Code of Federal Regulations (CFR) nelle seguenti sezioni: 29 CFR 1910.132 (requisiti generali); 29 CFR 1910.138 (protezione delle mani); 29 CFR 1926.95 (criteri per l'uso di dispositivi di protezione individuale standard). I guanti con capacità di protezione compromessa devono essere smaltiti e sostituiti. Tenere in considerazione la tossicità delle sostanze chimiche e fattori quali la durata dell'esposizione, lo stoccaggio e la temperatura qualora si decida di riutilizzare guanti già esposti a sostanze chimiche. Di seguito sono elencate una serie di caratteristiche per facilitare la scelta di guanti adatti alla manipolazione di apparecchiature, dosaggi, oli e solventi di pulizia:
■
■ I guanti in butile sono realizzati con una gomma sintetica e proteggono nei confronti di perossido, acido fluoridrico, basi forti, alcoli, aldeidi e chetoni
■
■ I guanti in gomma naturale (lattice) sono comodi da indossare e possiedono eccezionali proprietà di resistenza alla trazione, elasticità e resistenza alla temperatura
■
■ I guanti in neoprene sono realizzati in gomma sintetica e offrono buona flessibilità, destrezza delle dita, alta densità e resistenza alla lacerazione; proteggono nei confronti di alcoli, acidi organici e alcali
■
■ I guanti in nitrile sono realizzati con un copolimero e forniscono protezione nei confronti di solventi clorurati quali il tricloroetilene e il tetracloroetene; proteggono in caso di utilizzo di oli, grassi, acidi e sostanze caustiche
Trasporto dello strumento
Non far cadere o sottoporre a urti lo strumento durante il trasporto.
Il peso di questo prodotto è superiore a 20 kg. Per sollevarlo sono necessarie due persone. Afferrarlo dal lato inferiore con le due persone posizionate su lati opposti.
Dopo aver disimballato l'apparecchiatura per collocarla nella posizione scelta, trasportarla rispettando le istruzioni per il sollevamento riportate in precedenza; collocarla in prossimità di una presa dotata di messa a terra con la spina di alimentazione facilmente accessibile.
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Sommario
Capitolo 1 Sistema QX200™ Droplet Digital™ PCR, IVD ...1
1.1 Introduzione ...1
1.2 Componenti del sistema ...2
1.3 Flusso di lavoro Droplet Digital PCR ...4
1.4 Configurazione del sistema e istruzioni operative generali ...4
Capitolo 2 Utilizzo del sistema QX200™ Droplet Reader, IVD ...5
Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft™ ...9
3.1 Configurazione ...10
3.1.1 Utilizzo dell'editor dei pozzetti ...11
3.1.2 Utilizzo dell'editor dell'esperimento ...12
3.1.3 Utilizzo delle opzioni avanzate ...13
3.2 Acquisizione ...13
3.3 Analisi ...14
3.3.1 Visualizzazione dei dati dei canali (1D Amplitude) ...16
3.3.2 Visualizzazione dei grafici dei cluster (2D Amplitude) ...18
3.3.3 Visualizzazione dei dati di concentrazione (Concentration) ...19
3.3.4 Visualizzazione dei dati del numero di copie (Copy Number) ...20
3.3.5 Visualizzazione dei dati del rapporto (Ratio) ...20
3.3.6 Visualizzazione di eventi ...21
3.3.7 Modalità di simulazione ...21
Capitolo 4 Specifiche e manutenzione ...23
4.1 Specifiche ...23
4.2 Manutenzione ...24
4.2.1 Procedure di manutenzione generale ...24
4.2.2 Cambio dell'olio del lettore di goccioline e rimozione dei rifiuti...25
4.2.3 Routine di manutenzione...26
Appendice A. Informazioni per l'ordinazione ...27
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QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 1
Sistema QX200 ™ Droplet Digital ™ PCR, IVD
1
1.1 Introduzione
Il sistema QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR™), IVD consente di eseguire applicazioni di PCR digitale accurate e precise. Il sistema è composto da due strumenti, il modello QX200 Droplet Generator, IVD e il modello QX200 Droplet Reader, IVD, oltre che dai rispettivi materiali di consumo. QX200 Droplet Generator, IVD esegue la partizione dei campioni in ~20.000 goccioline di dimensioni nell'ordine dei nanolitri; una volta eseguita la PCR su un
termociclatore, le goccioline ottenute da ciascun campione vengono analizzate singolarmente sullo strumento QX200 Droplet Reader, IVD.
Il conteggio delle goccioline PCR positive e PCR negative permette la quantificazione assoluta del DNA target in formato digitale. In alternativa, è possibile estrarre dalle goccioline i prodotti dell'amplificazione dopo la PCR per le applicazioni a valle, quali il sequenziamento o la clonazione.
Il sistema QX200 ddPCR, IVD consente di:
■
■ Rivelare copie rare di target DNA con una sensibilità senza precedenti
■
■ Determinare la variazione del numero di copie con un'accuratezza senza pari
■
■ Misurare con precisione i livelli di espressione genica Usi e applicazioni includono:
Per istruzioni sull'uso del sistema QX200 Droplet Generator, IVD, fare riferimento al manuale di istruzioni QX200 Droplet Generator, IVD (bollettino 10031907).
■
■ Variazione del numero di copie
■
■ Rivelazione di sequenze rare
■
■ Analisi dell'espressione genica
■
■ Quantificazione di librerie NGS (Next-Generation Sequencing)
■
■ Determinazione dei carichi virali
■
■ Analisi dell'espressione genica su singola cellula
■
■ Quantificazione assoluta
■
■ Rivelazione di mutanti rari
■
■ Analisi miRNA
■
■ Preparazione di campioni NGS
■
■ Rivelazione di OGM
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Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
Uso previsto e indicazioni per l'uso
L'unità QX200 Droplet Digital PCR, IVD è un sistema a reazione a catena della polimerasi digitale ideato per misurare e separare i vari segnali generati in un dosaggio diagnostico in vitro da un campione clinico. Questa strumentazione viene utilizzata con un dosaggio specifico per misurare più analiti simili che determinano un singolo indicatore di ausilio nella diagnosi.
1.2 Componenti del sistema
Il sistema è composto da due strumenti e da software, materiali di consumo e reagenti associati (Tabella 1.1):
■
■ QX200 Droplet Generator, IVD: utilizza un sistema microfluidico e reagenti proprietari per eseguire la partizione dei campioni in ~20.000 goccioline di dimensioni nell'ordine dei nanolitri
■
■ QX200 Droplet Reader, IVD: dopo l'amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, questo strumento analizza singolarmente ciascuna gocciolina utilizzando un sistema di rivelazione a due colori (impostato per rivelare FAM e uno tra VIC, HEX ed EvaGreen); il conteggio delle goccioline PCR positive e PCR negative permette la quantificazione assoluta del DNA target in formato digitale utilizzando il software QuantaSoft™ I materiali supplementari necessari per eseguire ddPCR sono elencati in Tabella 1.2.
Tabella 1.1. Componenti del sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. Articoli spediti con il sistema QX200 ddPCR, IVD (n. catalogo 17000034). Il numero di catalogo fa riferimento agli articoli per la sostituzione (le quantità possono variare).
Componente Descrizione N. catalogo
QX200 Droplet Generator, IVD
QX200 Droplet Generator, IVD Strumento utilizzato per la generazione di goccioline 12001049 Cartucce e guarnizioni (24) del Cartuccia microfluidica utilizzata per la miscelazione di campione 186-4007 generatore di goccioline DG8™ e olio per generare goccioline; le guarnizioni sigillano la cartuccia
per prevenire l'evaporazione e applicare la pressione necessaria per la generazione delle goccioline
Supporto della cartuccia del Fissa in posizione la cartuccia del generatore di goccioline nello 186-3051 generatore di goccioline strumento per la generazione delle goccioline
Cavo di alimentazione Collega il sistema QX200 Droplet Generator, Chiamare
IVD all’alimentazione l'assistenza tecnica
QX200 Droplet Reader, IVD
QX200 Droplet Reader, IVD Strumento utilizzato per la lettura delle goccioline e la raccolta dati 12001045 PC laptop e software QuantaSoft Si collega al sistema QX200 Droplet Reader, IVD per la raccolta 186-3007
e l'analisi dei dati
Supporti per piastre del lettore Consentono di posizionare la piastra per PCR a 96 pozzetti 29711024 di goccioline (2) nel lettore di goccioline
Cavo USB 2.0 Collega il sistema QX200 Droplet Reader, IVD al PC Chiamare l'assistenza tecnica Cavo di alimentazione Collega il sistema QX200 Droplet Reader, IVD all'alimentazione Chiamare
l'assistenza tecnica
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 3 Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
Tabella 1.2. Materiali supplementari necessari.
Componente Consigliato N. catalogo e fornitore
QX200 Droplet Generator, IVD Reagenti per la rivelazione delle sonde
PCR supermix ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) 186-3023, 186-3024, 186-3025 ddPCR Supermix for Probes 186-3010, 186-3026, 186-3027,
186-3028
One-Step RT-ddPCR Supermix for Probes 186-3021, 186-3022 Olio per la generazione di goccioline Droplet Generation Oil for Probes 186-3005
Controllo ddPCR Buffer Control Kit for Probes 186-3052
Reagenti per rivelazione EvaGreen
PCR supermix QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 186-4033, 186-4034, 186-4035,
186-4036
Olio per la generazione di goccioline Droplet Generation Oil for EvaGreen 186-4005, 186-4006
Controllo QX200 Buffer Control Kit for EvaGreen 186-4052
Materiali di consumo e altri materiali
Pipette Pipetta da 20 μL per il caricamento dei campioni Rainin L-20 Pipetta da 50 μL per il trasferimento delle goccioline Rainin L-50, L8-50 Pipetta a 8 canali, 200 μL per olio Rainin L8-200
Puntali per pipette Con filtro Rainin GP-L10F, GP-L200F
Piastre per PCR a 96 pozzetti Piastra semi-skirted twin.tec a 96 pozzetti Eppendorf 951020362 Vaschetta reagenti Qualsiasi
Pellicole di sigillatura per piastre Pellicole di sigillatura perforabili per piastre 181-4040
Sigillatrice per piastre PX1™ PCR Plate Sealer 181-4000
Strip con 8 tappi Qualsiasi
QX200 Droplet Reader, IVD
Olio del lettore di goccioline ddPCR Droplet Reader Oil 186-3004 Flacone per i rifiuti del lettore di goccioline Flacone per i rifiuti vuoto N/A Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. A sinistra, l'unità QX200 Droplet Reader, IVD. A destra, l'unità QX200 Droplet Generator, IVD.
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Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
1.3 Flusso di lavoro Droplet Digital PCR
Il flusso di lavoro Droplet Digital PCR è articolato nelle seguenti fasi (per il flusso di lavoro completo sono necessarie 4,5-5,5 ore):
■
■ Preparazione di campioni predisposti per la PCR: combinare il campione di acido nucleico (DNA o RNA), i primer e le sonde (FAM, VIC, o HEX) o il colorante intercalante (EvaGreen) con Bio-Rad ddPCR Supermix (vedere la Tabella 1.2)
■
■ Produzione delle goccioline: caricare 20 μL della reazione ddPCR nella cartuccia del generatore di goccioline DG8; quindi caricare la cartuccia nel sistema QX200 Droplet Generator, IVD per eseguire la partizione del campione in goccioline. Il modello QX200 Droplet Generator, IVD utilizza un sistema microfluidico per combinare olio e campione acquoso e creare le goccioline di dimensioni nell'ordine dei nanolitri necessarie per l'analisi ddPCR. È in grado di elaborare un massimo di otto campioni contemporaneamente in circa 2 minuti.
■
■ Esecuzione della PCR: pipettare le goccioline dalla cartuccia in una piastra per PCR a 96 pozzetti e sigillare la piastra con pellicola di sigillatura utilizzando un'unità PX1 Plate Sealer (vedere la Tabella 1.2). Eseguire la PCR fino all'end point (~40 cicli) utilizzando un termociclatore
■
■ Lettura delle goccioline: caricare la piastra nel sistema QX200 Droplet Reader, IVD e avviare l'acquisizione.
Il lettore di goccioline aspira ciascun campione, singolarizza le goccioline e invia un flusso composto da una gocciolina alla volta a un rivelatore a due colori. Il rivelatore legge le goccioline per determinare quali contengono un target (+) e quali non lo contengono (–)
In caso di lettura o quantificazione delle goccioline e recupero di materiale dalle stesse in parallelo, preparare due set di reazioni, uno per ciascuna applicazione. Per esempio, è possibile generare un set di otto pozzetti in un'unica cartuccia DG8: quattro pozzetti verranno letti dopo il ciclo termico e gli altri quattro non verranno letti
■
■ Analisi dei risultati: il lettore di goccioline si collega a un computer laptop in cui è in esecuzione il software QuantaSoft. Il software mette a disposizione un insieme completo di strumenti per configurare e denominare i campioni, far funzionare e controllare lo strumento e analizzare i risultati. Inoltre, legge le goccioline positive e negative in ciascun campione e traccia il grafico della fluorescenza gocciolina per gocciolina. La frazione di goccioline positive in un campione determina la concentrazione del target espressa in copie/μL
Il sistema QX200 ddPCR è compatibile con le caratteristiche chimiche delle sonde di idrolisi (TaqMan) ed è in grado di rilevare fino a due sonde contemporaneamente (FAM/VIC o FAM/HEX) utilizzando una matrice di deconvoluzione dei coloranti nel software per garantire la specificità per il target. Inoltre è compatibile con le caratteristiche chimiche EvaGreen. Con questo sistema utilizzare esclusivamente le supermix approvate da Bio-Rad elencati nella Tabella 1.2;
l'utilizzo di supermix non approvati può danneggiare lo strumento e fa decadere la garanzia.
1.4 Configurazione del sistema e istruzioni operative generali
■
■ Collegare i sistemi QX200 Droplet Generator, IVD e QX200 Droplet Reader, IVD a una sorgente di alimentazione utilizzando i cavi di alimentazione e l'adattatore di alimentazione in dotazione. Lasciare 25,4 cm (10") di spazio libero sul retro e 12,7 cm (5") a destra e sinistra di ciascuno strumento per consentire una ventilazione adeguata.
Posizionare lo strumento in modo che possa essere facilmente scollegato dalla sorgente di alimentazione qualora ciò fosse necessario ai fini degli interventi di manutenzione dell'apparecchiatura.
■
■ Collegare il sistema QX200 Droplet Reader, IVD al PC laptop utilizzando il cavo USB 2.0 in dotazione. Il software QuantaSoft è pre-installato nel laptop
■
■ Accendere il sistema QX200 Droplet Reader, IVD utilizzando l'interruttore sul retro. L'indicatore di stato emette una luce verde fissa a indicare che l'alimentazione è accesa. Per accendere il sistema QX200 Droplet Generator, IVD collegarlo a una sorgente di alimentazione
■
■ Per il lettore di goccioline è necessario il relativo olio (numero di catalogo 186-3004). Fare riferimento alla Sezione 4.2.2 per istruzioni sul cambio dell'olio del lettore di goccioline
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 5 Capitolo 1 Sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
Utilizzo del sistema
QX200 ™ Droplet Reader, IVD
2
Il marchio IVD CE è valido esclusivamente per il sistema QX200 Droplet Reader, IVD, il sistema QX200 Droplet Generator, IVD e il sistema QX200 Droplet Digital PCR, IVD. In caso di utilizzo di qualsiasi componente privo di marchio IVD CE, inclusi reagenti o accessori, l'uso deve essere esclusivamente a fini di ricerca.
1. Accendere il sistema QX200 Droplet Reader, IVD utilizzando l'interruttore sul retro. Attenderne il riscaldamento per 30 min; quindi accendere il PC e avviare il software QuantaSoft™.
2. Controllare le spie luminose sul lato anteriore del lettore di goccioline (Tabella 2.1).
Le prime due spie a sinistra devono emettere una luce verde fissa a indicare che l'alimentazione è accesa, che è presente una quantità sufficiente di olio nel relativo recipiente e che il volume di liquido nel flacone dei rifiuti è <700 mL. Se le spie emettono una luce ambra lampeggiante, non è possibile avviare l'acquisizione;
svuotare il flacone dei rifiuti o cambiare l'olio (vedere la Sezione 4.2.2).
Tabella 2.1. Spie luminose di stato sull'unità QX200 Droplet Reader, IVD.
Luce verde fissa Alimentazione accesa Livelli flaconi OK* Piastra in sede Acquisizione completata
Luce verde lampeggiante — Olio <30% o rifiuti >70%** — Acquisizione in corso
Luce ambra lampeggiante — Olio <10% o rifiuti >90%*** — Errore durante l'acquisizione
Spento Alimentazione spenta — Piastra assente Inattività
* La quantità di olio e la capacità residua del flacone dei rifiuti sono sufficienti per acquisire 96 pozzetti.
** L'acquisizione può essere avviata se il numero di pozzetti è <96 (per esempio, per 24 pozzetti è sufficiente il 19% di olio);
se l'olio non è sufficiente, il software non consente l'avvio dell'acquisizione.
*** Il software non consente di avviare l'acquisizione.
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Capitolo 2 Utilizzo del sistema QX200 Droplet Reader, IVD
3. Collocare la piastra per PCR a 96 pozzetti nel relativo supporto:
a. Collocare nella base del supporto la piastra per PCR a 96 pozzetti contenente le goccioline amplificate. Il pozzetto A1 della piastra per PCR deve trovarsi nella posizione in alto a sinistra.
b. Spostare le alette di rilascio del lato superiore del supporto della piastra nella posizione “verso l'alto”
e collocare il lato superiore del supporto sulla piastra per PCR. Premere con decisione verso il basso entrambe le alette di rilascio per fissare la piastra per PCR nel supporto.
4. Premere il pulsante sul coperchio verde per aprire il lettore di goccioline. Caricare il supporto della piastra nel lettore di goccioline e premere nuovamente il pulsante sul coperchio per chiudere. Verificare che le prime tre spie luminose emettano una luce verde (Tabella 2.1).
Inserimento della piastra a 96 pozzetti nel relativo supporto.
In basso In basso
Inserimento del supporto della piastra nel lettore di goccioline.
Premere per aprire/chiudere
Base del supporto della piastra Piastra per PCR a 96 pozzetti
Lato superiore del supporto della piastra
Capitolo 2 Utilizzo del sistema QX200 Droplet Reader, IVD
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 7
Capitolo 2 Utilizzo del sistema QX200 Droplet Reader, IVD
5. Nel software QuantaSoft, fare clic su Setup nella barra di navigazione a sinistra per definire l'esperimento (vedere il Capitolo 3); quindi fare clic su Run. La spia luminosa dell'acquisizione (all'estrema destra) emette una luce verde lampeggiante per indicare che è in corso la lettura delle goccioline.
6. Al termine della lettura delle goccioline, tutte e quattro le spie luminose emettono una luce verde fissa. Aprire lo sportello e rimuovere il supporto della piastra dall'unità. Rimuovere la piastra per PCR a 96 pozzetti dal supporto e smaltirla.
Posizionamento corretto e incorretto del supporto della piastra. Notare che le alette di rilascio sono rivolte “verso l'alto” nel caso del posizionamento incorretto a destra.
Incorretto Corretto
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Utilizzo del software QuantaSoft ™
3
Il software QuantaSoft (versione 1.4 e successive) consente di organizzare e accedere con un solo clic alle tre fasi principali dell'analisi delle goccioline nella barra di navigazione a sinistra, accompagnando l'utente attraverso l'intero flusso di lavoro:
■
■ Configurazione: immissione di informazioni su campioni, dosaggi ed esperimenti (vedere la Sezione 3.1)
■
■ Acquisizione: avvio dell'acquisizione e controllo dello strumento, se necessario (vedere la Sezione 3.2)
■
■ Analisi: calcolo della concentrazione di acido nucleico (vedere la Sezione 3.3 e 3.4)
Il software QuantaSoft utilizza i seguenti tipi di file:
■
■ Modello (*.qlt): impostazioni definite dall'utente del layout delle piastre (senza dati) per la lettura di una piastra ddPCR™
■
■ Dati grezzi (*.qlb): dati non elaborati da ciascun pozzetto in una piastra ddPCR
■
■ Risultati (*.qlp): impostazioni definite dall'utente del layout delle piastre e dati elaborati per una piastra ddPCR
■
■ Valori separati da virgole (*.csv): dati analizzati in un formato che può essere valutato utilizzando altri programmi, per esempio Microsoft Excel
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Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
3.1 Configurazione
2. Immettere il nome del file; quindi utilizzare l'editor dei pozzetti (vedere la Sezione 3.1.1) e l'editor
dell'esperimento (vedere la Sezione 3.1.2) per regolare le impostazioni per lo specifico esperimento. Fare clic su Options per accedere alle opzioni avanzate di configurazione e analisi dei dati (vedere la Sezione 3.1.3).
1. Fare clic su Setup per immettere informazioni su campioni, dosaggi ed esperimenti.
■
■ Per aprire i dettagli (impostazioni e dati) salvati di un altro esperimento, fare clic su Plate > Load e selezionare il file
■
■ Per aprire un modello salvato per la mappa di una piastra (solo impostazioni, senza dati), fare clic su Template > Load e selezionare il file
■
■ Per creare un nuovo modello, fare clic su Template > New
Per sovrascrivere le informazioni di configurazione per una piastra aperta (tipo e nome dell'esperimento, nome del campione e così via), fare clic su Template > Load. Nella finestra Load template fare clic su Overwrite.
Interfaccia di configurazione del software QuantaSoft. La mappa della piastra è un diagramma dei pozzetti nella piastra a 96 pozzetti e contiene informazioni su tipo di analisi, campione e dosaggio associati allo specifico pozzetto. Dopo un'acquisizione, contiene anche i dati della concentrazione.
Nome del file
Opzioni di manutenzione dello strumento (visualizzate solo in caso di collegamento al lettore di goccioline o in modalità di simulazione) Opzioni avanzate di configurazione e analisi dei dati
Apertura dell'editor dell'esperimento Caricamento o creazione di un modello
(solo impostazioni)
Caricamento di impostazioni e dati da esperimenti precedenti
Mappa della piastra Interruzione
dell'acquisizione o uscita dal programma Visualizzazione e analisi dei dati Avvio dell'acquisizione Definizione delle impostazioni dell'esperimento
QX200 Droplet Reader, IVD and QuantaSoft Software Instruction Manual QX200 Droplet Reader, IVD and QuantaSoft Software Instruction Manual | 11 Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
3.1.1 Utilizzo dell'editor dei pozzetti
Utilizzare l'editor dei pozzetti per definire le impostazioni (campioni, tipo di esperimento e tipo di rivelazione) per la piastra. I tipi di campioni ed esperimenti sono contrassegnati da codici a colori e possono essere personalizzati per un facile riferimento nella mappa della piastra.
1. Per aprire l'editor dei pozzetti, fare doppio clic sul pozzetto o sui pozzetti da modificare. I pozzetti selezionati sono evidenziati in grigio e l'editor dei pozzetti è visualizzato sul lato superiore dell'interfaccia.
■
■ Per selezionare più pozzetti, tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare i pozzetti
■
■ Per selezionare pozzetti in una sequenza continua (orizzontale o verticale), tenere premuto il tasto Maiusc e selezionare il primo e l'ultimo pozzetto
■
■ Per selezionare tutti i pozzetti nella piastra, fare doppio clic nell'angolo superiore sinistro della piastra
■
■ Per selezionare una riga o una colonna, fare doppio clic sulla lettera o sul numero della riga o della colonna 2. Nel pannello Sample immettere il nome del campione nel campo Name e selezionare il tipo di esperimento
dal menu a discesa Experiment.
■
■ Nel menu a discesa sono visualizzati tutti gli esperimenti salvati, insieme all'opzione add experiment... per aggiungere un esperimento
■
■ Il nome del campione distingue tra minuscole e maiuscole; solo i pozzetti con nomi del campione identici possono essere trattati come pozzetti combinati durante l'analisi dei dati
■
■ Per creare o modificare un esperimento, utilizzare l'editor dell'esperimento (vedere la Sezione 3.1.2) 3. Selezionare la Supermix dal menu a discesa (operazione obbligatoria; la selezione non può essere
modificata dopo la raccolta dei dati).
Opzioni dei tipi di dosaggi.
Editor dei pozzetti. Sono mostrate le impostazioni per la quantificazione assoluta di due campioni sconosciuti in un singolo campione.
Unused: canale inutilizzato
Unknown: campione sperimentale sconosciuto
Reference: target o gene di riferimento (necessario per i calcoli del rapporto, CNV o RED)
Positive: controllo positivo Negative: controllo negativo
Blank: nessun campione; utilizzare per i pozzetti che non verranno analizzati
NTC: controllo senza modello
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Reset: ripristina le impostazioni predefinite Apply: applica le impostazioni senza uscire
dall'editor dei pozzetti Cancel: chiude senza salvare le modifiche OK: salva le modifiche e chiude l'editor dei
pozzetti
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Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
4. Definire Target 1 (canale 1, il canale FAM) e Target 2 (canale 2, il canale VIC o HEX). Assegnare a ciascun dosaggio un nome Name e un tipo di campione Type.
Via via che vengono immesse, le impostazioni sono visualizzate nella casella Applied Well Settings. Al termine, fare clic su Apply o su OK per salvare le informazioni. Le impostazioni sono visualizzate nel pozzetto nella mappa della piastra.
Suggerimenti:
È possibile cambiare il pozzetto selezionato utilizzando la mappa della piastra senza uscire dall'editor dei pozzetti.
Per aggiungere ai pozzetti selezionati nomi dei campioni o dei dosaggi con incrementi numerici, selezionare la casella di controllo Auto Inc accanto a Name.
Utilizzare i tasti di scelta rapida standard di Windows per copiare, incollare ed eliminare le selezioni (per esempio utilizzare Ctrl+c per copiare una selezione, Ctrl+z per annullare un'operazione e così via).
3.1.2 Utilizzo dell'editor dell'esperimento
Utilizzare l'editor dell'esperimento per definire il tipo di esperimento. Per aprire l'editor dell'esperimento, selezionare Experiment > add experiment... nell'editor dei pozzetti oppure selezionare New o Edit (fare doppio clic sul nome di un esperimento) nella finestra Experiments alla voce Setup. Sono possibili quattro tipi di esperimenti: Absolute Quantification (ABS), Rare Event Detection (RED), Copy Number Variation (CNV) e Gene Expression (GEX). Un elenco predefinito di esperimenti è fornito all'installazione, ma è possibile creare e salvare esperimenti personalizzati; le installazioni di aggiornamento preservano gli elenchi correnti degli esperimenti.
Via via che vengono immesse, le impostazioni sono riassunte nella casella Applied Well Settings. Fare clic su Apply o su OK per salvare le informazioni sull'esperimento. Le impostazioni sono visualizzate nel pozzetto nella mappa della piastra.
Se tutti i parametri Sample Name, Experiment, Target Name, Target Type e Supermix corrispondono su più pozzetti (ognuno di questi parametri distingue tra maiuscole e minuscole), il software può identificare i pozzetti come “combinati” e fornire l'opzione di visualizzazione dei dati combinati durante l'analisi (vedere la Sezione 3.3).
Editor dell'esperimento. Sono mostrate le opzioni per un esperimento CNV.
Le opzioni del numero di copie sono visibili solo per gli esperimenti CNV
Personalizzazione dei codici a colore per gli esperimenti (per esempio per tipo di esperimento, utente e così via)
Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
3.2 Acquisizione
1. Fare clic su Run nella barra di navigazione a sinistra per avviare l'acquisizione.
2. Nella finestra Run Options selezionare la chimica di rivelazione:
■
■ Se nell'editor dei pozzetti è selezionato una supermix per sonde, vengono visualizzati i set di coloranti per sonde. Selezionare FAM/HEX o FAM/VIC
■
■ Se è selezionato una supermix EvaGreen, viene visualizzato il set di coloranti EvaGreen; nella schermata è confermato il numero di pozzetti EvaGreen configurati nella piastra
3.1.3 Utilizzo delle opzioni avanzate
Fare clic su Options nella finestra Setup per visualizzare tutte le opzioni avanzate per l'analisi e la raccolta di dati.
Rielaborazione dei dati con una versione più recente del software
Esportazione di dati di ampiezza per i pozzetti selezionati in un file .csv (un file per ciascun pozzetto)
Opzioni avanzate.
Selezione dei pozzetti per riga (selezionato) o per colonna (deselezionato) Impostazione della visualizzazione della soglia (colore)
Opzioni di acquisizione.
3. Fino a 1 minuto più tardi, accanto al pulsante di interruzione dell'acquisizione compare un cerchio verde che lampeggia periodicamente a indicare che l'acquisizione è in corso. Anche i pozzetti attivi e analizzati sono evidenziati in verde nella mappa della piastra.
4. Via via che ciascun pozzetto viene analizzato, i dati compaiono nell'area di navigazione in alto. Una volta completata l'acquisizione, tutti i dati vengono nuovamente analizzati per il file di dati finale.
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3.3 Analisi
Nella finestra Setup caricare una piastra (nomefile.qlp); quindi fare clic su Analyze per aprire e analizzare i dati.
L'interfaccia di analisi dei dati è suddivisa in tre finestre:
■
■ Tabella dei risultati: contiene un riepilogo dei risultati per i pozzetti selezionati nell'apposito selettore
■
■ Selettore pozzetti: consente di selezionare i pozzetti per l'analisi mirata
■
■ Dati elaborati/visualizzazione grafica: consente la visualizzazione di dati grafici da pozzetti selezionati
Flusso di dati del pozzetto Istogramma canale 1 (eventi in funzione dell'ampiezza)
Indicatore dell'acquisizione Pozzetti analizzati
Alternanza delle viste dei dati (grafici in una finestra più grande)
Interfaccia durante un'acquisizione attiva. Sono mostrati i dati per entrambi i canali del rivelatore per il pozzetto in corso di lettura.
Esperimento
Conc. campione sconosciuto canale 1
Conc. campione sconosciuto canale 2 Nome del campione
Canale 1 (FAM): fluorescenza in funzione del numero di eventi Canale 2 (VIC o HEX): fluorescenza in funzione del numero di eventi Istogramma canale 2 (eventi in funzione dell'ampiezza)
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Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
Interfaccia di analisi dei dati. Sono mostrati i dati da un'analisi CNV.
Visualizzazione grafica dei dati
Tabella dei risultati Selettore pozzetti
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Visualizzazione della tabella nella finestra di visualizzazione grafica (alterna)
Esportazione dei dati in un file .csv
Selezione dei dati dal canale o dai canali del rivelatore Alternanza dell'ordine di visualizzazione dei dati dei canali nella tabella
Visualizzazione separata delle repliche, come pozzetti combinati (se tutti i parametri Sample Name, Experiment, Assay Name e Type corrispondono sui pozzetti) oppure in entrambe le modalità
Opzioni della tabella dei risultati. Sono mostrati i dati da un'analisi CNV.
Opzioni di stato:
OK: analisi automatica riuscita
CHECK: analisi automatica non riuscita; per visualizzare la concentrazione, utilizzare gli strumenti di analisi manuale
Multi: dati analizzati automaticamente nell'ambito di una selezione multi-pozzetto
Manual: goccioline analizzate manualmente Opzioni di visualizzazione asse Y
Copia grafico negli Appunti o stampa
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3.3.1 Visualizzazione dei dati dei canali (1D Amplitude)
Fare clic su 1D Amplitude per visualizzare i dati raccolti da ciascun canale dei pozzetti selezionati. Utilizzare i pulsanti di opzione per selezionare i canali da visualizzare. Questa scheda fornisce anche le opzioni per la regolazione delle soglie utilizzate nell'assegnazione dei positivi e negativi per ciascun canale.
Quando si visualizza un singolo pozzetto, modificare la soglia utilizzando una delle seguenti opzioni:
■
■ Utilizzare lo strumento di soglia per singolo pozzetto . La soglia assegnata appare come una linea orizzontale rosa
-Oppure-
■
■ Immettere i valori di soglia nel campo Set Threshold
Quando si visualizzano più pozzetti, modificare le soglie come segue:
■
■ Utilizzare lo strumento di soglia per singolo pozzetto per modificare la soglia in un singolo pozzetto. Righe verticali gialle nei grafici dei dati elaborati indicano i punti di inizio e fine dei dati delle goccioline da ciascun pozzetto, mentre la soglia assegnata è visualizzata come una riga orizzontale rosa
■
■ Utilizzare lo strumento di soglia multi-pozzetto per modificare la soglia in tutti i pozzetti (la soglia appare come una riga rosa nei grafici)
■
■ Per impostare manualmente valori di soglia per uno o più pozzetti, inserire i valori nel campo Set Threshold sotto il grafico e fare clic su Set Threshold o su Enter
Fare clic su Auto Analyze per tornare alle impostazioni di soglia e ai calcoli automatici. È possibile eseguire le regolazioni della soglia anche nei grafici dei cluster 2D Amplitude (vedere la Sezione 3.3.2).
Grafico dei cluster canale 1 in funzione del canale 2 Dati di concentrazione
Grafico dei numeri di copie misurati
Grafico del numero di eventi goccioline conteggiati
Opzioni di visualizzazione grafica dei dati. È mostrato un grafico della concentrazione da un'analisi CNV; in alto sono disponibili le opzioni di visualizzazione.
Dati dei canali Grafico del rapporto sconosciuto:riferimento (a/b o a/[a+b])
| 17 QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
Canale 1:
ampiezza di fluorescenza in funzione del numero di eventi
Canale 2:
ampiezza di fluorescenza in funzione del numero di eventi
Canale 1 (FAM):
istogramma degli eventi in funzione dell'ampiezza
Canale 2 (VIC o HEX):
istogramma degli eventi in funzione dell'ampiezza
Visualizzazione dei dati dei canali per un singolo pozzetto. Sono mostrati i dati elaborati da entrambi i canali di un singolo pozzetto.
Selettore canali
Visualizzazione dei dati dei canali per più pozzetti. Sono mostrati i dati elaborati da entrambi i canali di più pozzetti. Nel canale 1 è abilitato lo strumento di soglia per singolo pozzetto (la soglia è indicata dalla riga rosa e il valore nel campo Set Threshold; lo stato di tale pozzetto nei risultati è contrassegnato da Manual). Nel canale 2 è abilitato lo strumento di soglia multi-pozzetto.
Strumento di regolazione della soglia (singolo pozzetto)
Strumenti di regolazione della soglia Reimpostazione
delle soglie automatiche
Attivazione/disattivazione della scala logaritmica dell'asse Y Impostazioni della soglia
Canale 1:
ampiezza di fluorescenza in funzione del numero di eventi
Canale 2:
ampiezza di fluorescenza in funzione del numero di eventi
Canale 1 (FAM):
istogramma degli eventi in funzione dell'ampiezza
Canale 2 (VIC o HEX):
istogramma degli eventi in funzione dell'ampiezza Selettore canali
Reimpostazione delle soglie automatiche
Attivazione/disattivazione della scala logaritmica dell'asse Y Impostazioni della soglia
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Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
3.3.2 Visualizzazione dei grafici dei cluster (2D Amplitude)
Fare clic su 2D Amplitude per visualizzare il grafico dei cluster del canale 1 in funzione del canale 2 e abilitare le opzioni di regolazione manuale o automatica delle soglie utilizzate nell'assegnazione dei positivi e negativi per ciascun canale di rivelazione.
■
■ Per reimpostare le soglie automatiche per i positivi e negativi, fare clic su Auto Analyze
■
■ Per assegnare manualmente le soglie:
– Utilizzare il mirino dei livelli di soglia per assegnare le regioni di classificazione per l'intero grafico (lo strumento dei cluster è disabilitato quando si visualizza il grafico in modalità mappa di calore)
– Utilizzare lo strumento di regolazione della soglia ellisse, rettangolo o lazo per classificare una regione del grafico. Fare clic sullo strumento; quindi fare clic sul tipo di regione nel selettore del cluster di lavoro.
Utilizzare lo strumento per selezionare la regione all'interno del grafico.
Suggerimento:
Passare il mouse su un qualsiasi pozzetto nel selettore pozzetti per visualizzare un'anteprima dei dati da tale pozzetto nel grafico dei cluster.
Visualizzazione di grafici dei cluster. Sono mostrate le opzioni di regolazione delle soglie disponibili nel grafico dei cluster. I valori delle soglie sono indicati dalle righe rosa nel grafico.
Strumenti di regolazione della soglia
Soglia Ch2
Soglia Ch1
Selettore cluster di lavoro
Ch1+/Ch2– Ch1+/Ch2+
Ch1–/Ch2– Ch1–/Ch2+
Ch1+/Ch2– Ch1+/Ch2+
Ch1–/Ch2+
Ch1–/Ch2–
Reimpostazione delle soglie automatiche
Impostazioni della soglia
Visualizzazione della mappa di calore multicolore
QX200 Droplet Reader, IVD and QuantaSoft Software Instruction Manual QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 19 Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
3.3.3 Visualizzazione dei dati di concentrazione (Concentration)
I dati di concentrazione per ciascun target sono visualizzati nei pozzetti nella mappa della piastra e in formato tabellare nella tabella dei risultati. Fare clic su Concentration per visualizzare i dati nei grafici della concentrazione. Utilizzare i pulsanti di opzione per selezionare i canali visualizzati. Le barre di errore riflettono l'errore totale o i limiti di confidenza al 95% della distribuzione di Poisson. I dati possono essere esportati per l'analisi in altre applicazioni per fogli di calcolo (per esempio Microsoft Excel).
Attivazione/disattivazione della scala logaritmica dell'asse y
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni
Visualizzazione dati da singoli pozzetti, dati combinati
o entrambi Attivazione/disattivazione dei valori sull'asse x e della
visualizzazione di pozzetto, nome o etichetta
Visualizzazione di dati di concentrazione. Sono mostrati i dati da una quantificazione assoluta. Passare il puntatore del mouse sui punti di dati per visualizzare l'identità del pozzetto, la concentrazione e i limiti di confidenza di Poisson. I punti di dati pieni (in figura) indicano dati combinati; i punti di dati vuoti (non in figura) indicano dati da singoli pozzetti.
Selezione del canale o dei canali da visualizzare
Opzioni dell'asse Y2:
None: asse Y2 non visualizzato Ch2: visualizza la concentrazione Ch2 CNV: visualizza il numero di copie (solo analisi CNV)
Ratio(a/b): rapporto (a/b) sconosciuto:riferimento Fractional Abundance (a/a+b): rapporto (a/[a+b]) sconosciuto:riferimento;
abbondanza
Inverse: inverso del rapporto o dell'abbondanza frazionaria
Nella colonna Copies/µL Well è visualizzata la quantità totale di materiale di partenza nel campione ddPCR. I valori mostrati corrispondono al prodotto tra la concentrazione (in copie per µL) e i 20 µL di reazione ddPCR utilizzati per creare le goccioline. Tale valore non viene visualizzato nel caso dei dati da pozzetti combinati.
Questa colonna viene esportata anche nel file *.csv. La colonna della concentrazione originale e i calcoli non subiscono modifiche.
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3.3.4 Visualizzazione dei dati del numero di copie (Copy Number)
Fare clic su Copy Number per visualizzare il numero di copie per i pozzetti/campioni selezionati.
3.3.5 Visualizzazione dei dati del rapporto (Ratio)
Fare clic su Ratio per visualizzare i dati del rapporto per i pozzetti/campioni selezionati. Utilizzare i pulsanti di opzione per selezionare un grafico Ratio (sconosciuto:riferimento) o Fractional Abundance (% di campione);
selezionare Inverse per invertire i rapporti.
Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
Attivazione/disattivazione della visualizzazione di pozzetto, nome o etichetta
Visualizzazione dei dati del numero di copie. Passare il puntatore del mouse sui punti di dati per visualizzare l'identità del pozzetto, la concentrazione e i limiti di confidenza di Poisson. I punti di dati pieni (non in figura) indicano dati combinati; i punti di dati vuoti (in figura) indicano dati da singoli pozzetti.
Visualizzazione di dati del rapporto. Sono mostrati i dati da una quantificazione assoluta. Passare il puntatore del mouse sui punti di dati per visualizzare l'identità del pozzetto, la concentrazione e i limiti di confidenza di Poisson. Selezionare y log per convertire l'asse y alla scala logaritmica (in figura). I punti di dati pieni (non in figura) indicano dati combinati; i punti di dati vuoti (in figura) indicano dati da singoli pozzetti.
Attivazione/disattivazione della visualizzazione di pozzetto, nome o etichetta
Selezione del grafico del rapporto o dell'abbondanza, inversione dei rapporti
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34_man_left header/footer Fill in Chapter Name Here on Master Page Capitolo 3 Utilizzo del software QuantaSoft
3.3.7 Modalità di simulazione
Quando si installa il software QuantaSoft versione 1.5 o successiva, nel menu Start di Windows (ma non sul desktop) compare un ulteriore programma denominato QuantaSoft-Simulation. Aprire questa modalità dal menu Start; in caso contrario, i file si aprono automaticamente nella versione normale di QuantaSoft.
Dal menu in alto a destra della modalità di simulazione è possibile eseguire funzioni altrimenti abilitate soltanto quando è collegato un lettore di goccioline. Per esempio, è possibile visualizzare in anteprima funzioni comuni quali un lavaggio del sistema o un'acquisizione di calibrazione del colore. La modalità di simulazione consente inoltre di caricare una piastra dimostrativa o di creare un nuovo modello e simulare un'acquisizione ddPCR.■
3.3.6 Visualizzazione di eventi
Fare clic su Events per visualizzare il numero di eventi goccioline conteggiati per i pozzetti/campioni selezionati.
Utilizzare i pulsanti di opzione per selezionare i canali visualizzati. Visualizzare i conteggi delle goccioline positive, negative o totali oppure una qualsiasi loro combinazione.
Visualizzazione di dati degli eventi. Sono mostrati i dati da una quantificazione assoluta.
Attivazione/disattivazione della visualizzazione di pozzetto, nome o etichetta
Selezione degli eventi da visualizzare Selezione del canale o dei canali da visualizzare
Modalità di simulazione (schermata principale).
Opzioni disponibili in modalità di simulazione
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Chapter Title Here Specifiche e
manutenzione
4
4.1 Specifiche
Peso 26 kg (56,6 lb)
Dimensioni (L x P x H) 660 x 521 x 292 cm (26 x 20,5 x 11,5")
Requisiti elettrici 100-240 V, 50/60 Hz, 1 A; le variazioni di tensione non devono superare di oltre +10% le specifiche nominali (per l'alimentatore esterno in dotazione);
fusibile: T5AV, 250 V
Temperatura 18-30 ºC
Altitudine 0-2.000 m (0-6.560 ft)
Umidità 85% max (senza condensa)
Livello di inquinamento 2 (uso in interni)
Categoria di installazione II (alimentatore esterno collegato a una presa AC standard)
Requisiti di ventilazione Spazio libero di 12 cm (5") a sinistra e a destra dell'unità e di 25 cm (10") sul retro per consentire una ventilazione adeguata
292 mm (11,5 in)
660 mm (26 in)
521 cm (20,5 in)
DIR ID 10000052067/Z03/000/A 2015-12-11 Released CM# 500000002967
Fill in Chapter Name Here on Master Page Capitolo 4 Specifiche e manutenzione
Specifiche delle prestazioni
Dimensioni iniziali del campione, µL 20 Capacità dell'unità QX200
Droplet Generator, IVD 1-8 campioni/cartuccia Goccioline per campione di 20 µL 20.000
Capacità dell'unità QX200
Droplet Reader, IVD 1-96 campioni
Illuminazione del campione Diodi a emissione luminosa Rivelazione del campione Contatore di fotoni multi-pixel Canali di rivelazione FAM (EvaGreen), HEX (VIC) Intervallo dinamico lineare 5 ordini di grandezza
Precisione ±10%
Goccioline per piastra
a 96 pozzetti, in milioni ~1,5
La calibrazione del sistema Droplet Reader viene eseguita utilizzando una piastra standard con goccioline di dimensioni note contenenti coloranti standard FAM e VIC. Queste goccioline già pronte all'uso sono impiegate nelle regolazioni del fotomoltiplicatore, nella calibrazione del colore e nella verifica delle corrette prestazioni fluidiche.
4.2 Manutenzione
4.2.1 Procedure di manutenzione generale
L'unità QX200 Droplet Reader, IVD è verificata da Bio-Rad che ne certifica il funzionamento conforme alle specifiche del produttore all'installazione. Si consiglia di sottoporre l'unità QX200 Droplet Reader, IVD alla manutenzione preventiva annuale offerta da Bio-Rad per ottenere una continuità di funzionamento in conformità alle specifiche di produzione.
In caso di malfunzionamento e/o variazioni nelle prestazioni analitiche del dispositivo, rivolgersi all'assistenza tecnica Bio-Rad (1-800-424-6723).
Le superfici dello strumento possono richiedere una pulizia generica. Utilizzare acqua deionizzata/distillata per la pulizia generica con un panno leggermente inumidito. Per eseguire la decontaminazione, è possibile utilizzare candeggina al 10% e quindi etanolo al 70% e/o acqua deionizzata/distillata. Non utilizzare acetone o acqua di rubinetto.
Ispezionare con regolarità l'apparecchiatura per individuare eventuali danni al cablaggio o ai componenti esterni.
Non utilizzare l'unità se è danneggiata.
Adottare pratiche standard OSHA e MSDS (scheda di dati di sicurezza dei materiali) per la manipolazione e lo smaltimento dei rifiuti prodotti.
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QX200 Droplet Reader, IVD and QuantaSoft Software Instruction Manual Capitolo 4 Specifiche e manutenzione
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 25
Capitolo 4 Specifiche e manutenzione
I liquidi Bio-Rad per lettori e per la generazione di goccioline sono a base di idrocarburi fluorurati e devono essere smaltiti in conformità alle normative istituzionali, statali e locali. Tali liquidi non infiammabili sono inerti e possiedono un basso impatto ambientale e una bassa tossicità. Raccogliere i rifiuti in un contenitore di polietilene e smaltire entro un mese.
Le goccioline prodotte con il master mix Bio-Rad possiedono proprietà antimicrobiche, ma la crescita microbica è comunque possibile. Il profilo dei rifiuti deve contenere quanto segue: idrocarburi fluorurati, acqua, colorante fluorescente (dalle sonde), proteina e acidi nucleici. Non sostituire il cavo di alimentazione rimovibile con un cavo non certificato o privo delle caratteristiche corrette.
4.2.2 Cambio dell'olio del lettore di goccioline e rimozione dei rifiuti
Cambiare l'olio del lettore di goccioline e svuotare il contenitore dei rifiuti secondo necessità. Utilizzare la maniglia integrata nel comparto laterale per estrarre il carrello:
■
■ Utilizzare i flaconi di olio vuoti come nuovi flaconi dei rifiuti. Aggiungere 50 mL di candeggina al 10% nel flacone dei rifiuti per prevenire la crescita microbica e apporre allo stesso tempo un'etichetta al flacone dei rifiuti.
■
■ Collocare il nuovo flacone di olio nella posizione per l'olio e avvitare il tappo. Nel software QuantaSoft™, alla voce Instrument Routines nella finestra Setup, fare clic su Prime per riempire le linee con l'olio prima di mettere in funzione il sistema
■
■ Se lo strumento non è stato utilizzato per più di una settimana, sottoporre il sistema a una funzione Prime prima di acquisire una piastra
Cambio dell'olio del lettore di goccioline e rimozione dei rifiuti. Estrarre il carrello contenente l'olio del lettore di goccioline e il contenitore dei rifiuti per rimuovere e sostituire i flaconi (a sinistra). Dopo aver cambiato l'olio, fare clic su Prime (a destra) per riempire le linee; le altre routine di manutenzione dello strumento sono destinate all'uso esclusivo da parte dei tecnici specializzati di assistenza sul campo.
DIR ID 10000052067/Z03/000/A 2015-12-11 Released CM# 500000002967
Capitolo 4 Specifiche e manutenzione
4.2.3 Routine di manutenzione
Quando il lettore di goccioline è acceso e collegato al software QuantaSoft, in alto a destra il software presenta le opzioni per la manutenzione. Utilizzare le seguenti opzioni per la calibrazione e manutenzione di routine:
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■ Fare clic su Prime per sottoporre a priming le siringhe, le linee dei fluidi e così via utilizzando l'olio del lettore di goccioline, oltre che per rimuovere l'aria dal sistema
(per esempio dopo il cambio dell'olio del lettore di goccioline)
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■ Fare clic su Color Calibration per calibrare il sistema o selezionare una nuova serie di sonde (vedere sotto) utilizzando una configurazione della piastra per la calibrazione del colore
Le altre opzioni sono utilizzate principalmente dai tecnici di assistenza sul campo durante la configurazione o la risoluzione dei problemi del sistema:
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■ Flush System: per svuotare le siringhe e le linee dei fluidi qualora sia possibile la presenza di un'ostruzione
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■ Move to Waste: per spostare l'ago dei campioni nel contenitore dei rifiuti
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■ Custom: per eseguire una routine personalizzata (*.qtl); questa opzione è protetta da password
Capitolo 4 Specifiche e manutenzione
QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni QX200 Droplet Reader, IVD e software QuantaSoft Manuale di istruzioni | 27
Appendice A
Informazioni per l'ordinazione
Sistema QX200
™ddPCR
™, IVD
N. catalogo Descrizione
17000034 Sistema QX200™ Droplet Digital™ PCR, IVD, include generatore di goccioline, lettore di goccioline, computer laptop, software, materiali di consumo per i componenti associati 12001049 QX200 Droplet Generator, IVD, include
generatore di goccioline, 1 scatola di 24 cartucce, 1 confezione da 24 guarnizioni,2 supporti della cartuccia, 1 cavo di alimentazione
12001045 QX200 Droplet Reader, IVD, include lettore di goccioline, manuale ddPCR, 2 supporti per piastre, cavo USB, cavo di alimentazione
186-4007 Droplet Generator Cartridges and Gaskets, include 5 confezioni da 24 cartucce DG8™, 5 confezioni da 24 guarnizioni DG8
186-4008 DG8 Cartridges for QX100™/QX200 Droplet Generator, 1 confezione da 24 cartucce
186-3009 DG8 Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator, 1 confezione da 24 guarnizioni
186-3051 DG8 Cartridge Holder 29711024 Droplet Reader Plate Holder
186-3005 Droplet Generation Oil for Probes, 10 x 7 mL
186-4005 Droplet Generation Oil for EvaGreen, 2 x 7 mL
186-4006 Droplet Generation Oil for EvaGreen, 10 x 7 mL
186-3004 ddPCR Droplet Reader Oil, 2 x 1 L 186-3007 Laptop Computer with QuantaSoft
Software
Reagenti per ddPCR
186-3023 ddPCR Supermix for Probes (No dUTP), 2 mL (2 x 1 mL), supermix 2x 186-3024 ddPCR Supermix for Probes (No
dUTP), 5 mL (5 x 1 mL), supermix 2x 186-3025 ddPCR Supermix for Probes (No
dUTP), 25 mL (5 x 5 mL), supermix 2x 186-3026 ddPCR Supermix for Probes, 2 mL
(2 x 1 mL), supermix 2x
186-3010 ddPCR Supermix for Probes, 5 mL (5 x 1 mL), supermix 2x
186-3027 ddPCR Supermix for Probes, 25 mL (5 x 5 mL), supermix 2x
