Capitolo 4 Il sistema a rilascio controllato di farmaco basato su eritrocit
4.2 Sistema a rilascio controllato di farmaco basato su eritro-magneto-HA-virosom
Il sistema a rilascio controllato di farmaco su cui si basa il seguente lavoro di tesi è stato sviluppato presso l’Istituto di Fisiologia Clinica di Siena da Cinti et al. Si tratta di un sistema innovativo ottenuto legando una glicoproteina filamentosa di origine virale con proprietà fusogeniche, l’emoagglutinina, alla membrana di un eritrocita e incapsulando nanoparticelle superparamagnetiche e farmaco all’interno del globulo rosso. È stato cosi ottenuto un sistema, detto eritro-magneto-HA-virosoma (EMHV), basato su eritrociti ingegnerizzati, che è possibile localizzare in maniera specifica e controllata grazie all’uso di un campo magnetico esterno e che mostra una elevata capacità di fusione con le cellule bersaglio, grazie alla presenza della glicoproteina di origine virale [Cinti 2011].
Il sistema è stato ottenuto isolando eritrociti provenienti dal sangue di un un donatore umano sano. Essi sono stati trattati con soluzione ipotonica in modo da indurre
55 l’apertura dei pori della membrana e e il rilascio dell’emoglobina. In seguito, durante il processo di richiusura dei pori della membrana, sono stati aggiunti l’emoagglutinina, nanoparticelle fluorescenti verdi con proprietà superparamagnetiche e il composto terapeutico. Grazie all’elevata affinità per le membrane, la glicoproteina virale si lega alla membrana dell’eritrocita, mentre le nanoparticelle magnetiche e il farmaco penetrano attraverso i pori all’interno dell’eritrocita [Cinti 2011] (Fig. 40b).
Fig.40. (a) Struttura di un globulo rosso (b) Eritrociti ingenerizzati contenenti nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti verdi e farmaco [Cinti 2011]
Il sistema sviluppato da Cinti et al. può essere utilizzato per la cura di patologie cardiovascolari, di malattie di origine virale o per il trattamento di tumori, a seconda del farmaco incapsulato al suo interno. Per verificare l’efficienza e l’efficacia del sistema Cinti et al. [Cinti 2011] hanno utilizzato il farmaco antitumorale 5-Aza-2-dC e hanno trattato cellule tumorali HeLa in vitro sia con il farmaco da solo che con il farmaco incapsulato all’interno degli eritrociti. Circa 500000 cellule tumorali HeLa sono state trattate con 1800 ng di farmaco da solo, corrispondente ad una concentrazione di 2.5 mM, che in diversi studi ha mostrato un effetto teraputico in vitro, e con eritrociti contenenti una concentrazione di farmaco dieci volte inferiore (180 ng).
È stato analizzato il meccanismo di rilascio del farmaco antitumorale all’interno del citoplasma della cellula tumorale (Fig. 41). L’eritrocita ingegnerizzato si lega alla cellula bersaglio attraverso l’interazione dell’emoagglutinina con i residui di acido sialico presenti sulla superficie della cellula target. L’integrazione dell’eritrocita nella cellula si verifica presumibilmente attraverso endocitosi mediata da recettore.
56 Nella prima ora è ancora possibile distinguere gli eritrociti ingegnerizzati che iniziano a legarsi con la membrana della cellula bersaglio. Dopo circa sei ore le cellule mostrano gran parte degli eritrociti incapsulati al loro interno, sotto forma di endosomi. La membrana dell’eritrocita inizia a fondersi con la membrana della cellula tumorale nell’arco di 12-24 ore ed in seguito le nanoparticelle fluorescenti e il farmaco iniziano a diffondere all’interno del citoplasma della cellula. Dopo 24 ore tutte le cellule tumorali mostrano una forte fluorescenza nel citoplasma e alcune hanno una morfologia tipica della prima fase dell’apoptosi. Dopo 96 ore gran parte delle cellule tumorali sono in apoptosi.
Attraverso un meccanismo di rilascio di questo tipo il farmaco incapsulato all’interno dell’eritrocita non fa sentire il suo effetto fino a quando non raggiunge la cellula bersaglio. Questo aspetto è di considerevole importanza nel caso di farmaci con un tempo di vita basso o con elevata tossicità, come i farmaci chemioterapici.
L’efficacia degli eritrociti ingegnerizzati nel promuovere l’apoptosi delle cellule tumorali rispetto al farmaco immesso da solo in circolo è mostrata in Fig. 42. Dopo 24 ore è visibile apoptosi significativa solo con il sistema a rilascio controllato di farmaco, mentre nessun effetto è visibile con farmaco da solo. Dopo 96 ore solo il 12.6% delle cellule Hela trattate con il farmaco libero appaiono in apoptosi rispetto al 96% delle cellule trattate con gli eritrociti ingegnerizzati. Queste osservazioni mostrano che utilizzando gli eritrociti ingegnerizzati si ha un aumento dell’effetto anti-neoplastico del farmaco 5-Aza-2-dC rispetto al farmaco usato da solo e una diminuzione della dose richiesta rispetto alla terapia convenzionale.
Per valutare eventuali effetti tossici del sistema sulle cellule tumorali, le cellule HeLa sono state coltivate anche in presenza di eritrociti contenenti solo le nanoparticelle magnetiche e non sono stati osservati effetti tossici sulla proliferazione cellulare.
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Fig.41. Meccanismo di fusione dell’eritrocita contenente nanoparticelle magnetiche fluorescenti verdi e 5- Aza-2-dC [Cinti 2011]
Fig.42. Analisi del trattamento delle cellule HeLa dopo 24 ore (a) e 96 ore (b) Ctrl (controllo): cellule HeLa non trattate; Aza: cellule HeLa trattate solo con 5-Aza-2-dC;
58 Diversi studi sono stati compiuti in vivo e in vitro per valutare l’efficacia degli eritrociti ingegnerizzati EMHV nel trasportare agenti terapeutici. Lande et al. [Lande 2011] ad esempio hanno testato la capacità degli eritrociti ingegnerizzati EMHV di origine suina di rilasciare frammenti oligonucleotidici sintetiti (DNA Elk-1) all’interno di cellule muscolari lisce vascolari al fine di ostacolare la restenosi vascolare. Durante procedure chirurgiche di angioplastica coronarica transluminale, volte all’eliminazione di placche aterosclerotiche e all’inserimento di uno stent per ristabilire un flusso sanguigno adeguato, si può assistere al danneggiamento della parete vascolare con il rischio di nuove occlusioni vascolari. Le cellule muscolari lisce vascolari danneggiate possono rimanere esposte a fattori di crescita, citochine e agenti infiammatori che circolano nel sangue. Questo può innescare una cascata di eventi intracellulari che può causare un cambiamento del fenotipo delle cellule muscolari lisce, le quali acquistano la capacità di proliferare e migrare causando la riparazione e la riocclusione del vaso sanguigno. Inserendo i frammenti oligonucleotidici all’interno degli eritrociti ingegnerizzati EMHV è stato possibile guidarli, sotto l’applicazione di un campo magnetico esterno, in corrispondenza delle cellule muscolari lisce, in modo che rilasciassero il loro contenuto in maniera selettiva. Attraverso l’emoagglutinina i globuli rossi hanno potuto attraversare la membrana delle cellule muscolari lisce e riversare i frammenti nucleotidici in corrispondenza dell’area danneggiata, in modo che andassero a bloccare i fattori di trascrizione di geni coinvolti nei processi di migrazione e proliferazione cellulare. Studi in vitro hanno mostrato che il frammento nucleotidico Elk-1 è in grado di inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. Una riduzione del 55% dell’attività migratoria delle cellule muscolari è evidente nell’area trattata con EMHV contenenti Elk-1 mentre nessuna riduzione statistica è stata osservata nelle cellule trattate con EMHV privi dei frammenti oligonucleotidici (Fig. 43). Inoltre è stato visto che gli eritrociti ingegnerizzati EMHV sono molto più efficienti rispetto ad altri sistemi di trasporto nel rilascio dei frammenti oligonucleotidici. Di conseguenza una dose minore di Elk-1 è sufficiente per inibire il processo di restenosi. Naldi et al. [Naldi 2014] hanno inserito una bassa dose di 5-Aza-2’-dC all’interno degli eritrociti ingegnerizzati EMHV, contenenti nanoparticelle superparamagnetiche di tipologia Nano-screenMAG, da utilizzare nel trattamento di un modello di xenotrapianto di cellule tumorali prostatiche. Una quantità pari a EMHV è stata iniettata nella vena caudale di un gruppo di topi che sono stati sottoposti per 30 minuti ad un campo magnetico statico, generato da due magneti permanenti al
59 Neodimio posizionati nella parte inferiore dell’addome. I magneti al Neodimio utilizzati avevano un raggio di 5 mm e una forza coercitiva di circa 1000 kOe. In un gruppo di controllo sono stati iniettati gli eritrociti ingegnerizzati senza l’applicazione di un campo magnetico esterno. Un’ora dopo l’iniezione, immagini radiografiche mostravano una localizzazione specifica degli eritrociti ingegnerizzati nei topi sottoposti al campo magnetico esterno, in corrispondenza del sito di applicazione dei magneti (Fig. 44b, 44d). Non era evidente nessun accumulo significativo di eritrotici ingegnerizzati nel gruppo di controllo e una distribuzione piuttosto rada di nanoparticelle era visibile nell’addome degli animali, nelle vicinanze del fegato e dei reni (Fig 44a, 44c).
Quanto studiato da Naldi et al. è stato testato anche mediante simulazioni attraverso Comsol 5.2a, come è illustrato nel Capitolo 5.
Fig.43. Effetto della somministrazione del frammento oligonucleotidico Elk-1 sulla migrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. (a) invasione delle cellule mscolari dopo 24 ore dal trattamento con EMHV contenenti Elk-1(destra) e EMHV di controllo vuote(sinistra) (b) istogramma dell’area riparata dalle cellule non trattate, trattate con EMHV vuote e trattate con Elk-1 contenuto negli EMHV [Lande
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Fig.44. Localizzazione degli EMHV dopo la somministrazione nella vena caudale del topo. (a, c) Immagini radiografiche del topo in assenza di campo magnetico esterno
(b, d) Immagini radiografiche del topo dopo esposizione a campo magnetico esterno [Naldi 2014]
Taranta et al. [Taranta 2011] hanno effettuato studi sulla possibilità di utilizzare gli eritrociti ingegnerizzati EMHV come bioreattori. Hanno dimostrato che incapsulando il profarmaco 5-Aza-dC al loro interno, essi erano in grado di metabolizzarlo nella forma attiva fosforilata 5-Aza-dCTP e hanno mostrato quindi come tale sistema fosse in grado di rilasciare molecole terapeutiche attivate nelle cellule bersaglio, senza la necessità di ulteriore modifiche da parte di queste ultime. Inoltre hanno osservato come l’utilizzo di eritrociti omologhi ingegnerizzati in topi non causassero nessuna risposta immunitaria, sebbene tali vettori farmacologici presentino una proteina immunogenica di origine virale (l’emoagglutinina) sulla loro superficie.
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Capitolo 5 Risposta degli eritrociti ingegnerizzati ad un
campo magnetico esterno
5.1 Caratterizzazione magnetica degli eritrociti ingegnerizzati
Presso l’Istituto di Fisiologia Clinica di Siena sono stati preparati quattro campioni di eritrociti ingegnerizzati EMHV, costituiti da eritrociti contenenti nanoparticelle superparamagnetiche (SPION) e farmaco 5-Aza-2-dC (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Le nanoparticelle superparamagnetiche inserite all’interno degli eritrociti di ciascun campione sono particelle Nanocs, di geometria approssimativamente sferica, con diametro e densità .
Per la preparazione dei campioni sono stati isolati i globuli rossi dal sangue di un donatore sano umano. Due dei quattro campioni sono stati realizzati prelevando circa eritrociti, che sono stati sottoposti ad un lavaggio in PBS (1X PBS, costituito da 1.37 M di NaCl, 57 mM di KCl, 54 mM di , 45mM di a pH 7.4) e centrifugati. In seguito è stato eliminato il surnatante ed è stata aggiunto lisis buffer (costituito da 10 mM di TRIS, 0.1 mM di EDTA, 1 mM di a pH 7.2), una soluzione ipotonica che determina una lisi osmotica degli eritrociti e quindi della loro membrana. Dopo aver lasciato gli eritrociti in ghiaccio per 55 minuti, sono stati sottoposti nuovamente a centrifugazione, è stato rimosso il surnatante e sono stati risospesi gli eritrociti in lisis buffer. Quindi sono stati aggiunti in agitazione l’emoagglutinina, 20 microlitri di nanoparticelle, farmaco, una soluzione di cloruro di magnesio, con concentrazione pari a 15 mM, e PBS per far in modo che la membrana eritrocitica si richiudesse. Il tutto è stato lasciato in incubazione e in agitazione a 37°C per 45 minuti, per poi essere sottoposto ad una serie ripetuta di lavaggi con PBS. In tutti i passaggi gli eritrociti sono stati mantenuti ad una temperatura di circa 4°C, ad eccezione delle fasi di incubazione e di purificazione degli eritrociti dal resto del sangue, che sono avvenute a temperatura ambiente.
Per la preparazione degli altri due campioni è stata seguita la stessa procedura ma sono stati impiegati circa eritrociti e 10 microlitri di nanoparticelle superparamagnetiche. I campioni di eritrociti ingegnerizzati sono stati in seguito sottoposti, presso il Laboratorio di Magnetismo Molecolare di Firenze, ad analisi magnetometrica, con magnetometro a massa vibrante (PPMS 6000, Quantum Design Ltd), da cui è stato
62 possibile effettuare, attraverso le curve di magnetizzazione ottenute, una caratterizzazione magnetica dei campioni e ricavare la quantità in grammi di nanoparticelle contenute in ciascun campione.
Per l’analisi magnetometrica quattro campioni, due contenenti eritrociti e due contenenti eritrociti, sono stati prelevati dalle vials ed essiccati direttamente nel portacampione di misura. Essi sono stati sottoposti ad analisi magnetometrica dopo un giorno e dopo una settimana dalla loro preparazione.
In particolare i campioni analizzati sono stati i seguenti:
Campione 1WNP, contenente eritrociti e analizzato ad una settimana dalla preparazione
Campione 2WNP, contenente eritrociti e analizzato ad una settimana dalla preparazione
Campione 1DNP, contenente eritrociti e analizzato ad un giorno dalla preparazione
Campione 2DNP, contenente eritrociti e analizzato ad un giorno dalla preparazione
Sono stati sottoposti ad analisi magnetometrica anche campioni costituiti solo da 20 μl di nanoparticelle superparamagnetiche.
Per stimare la massa delle nanoparticelle contenute all’interno di ciascun campione è stata dapprima misurata, attraverso magnetometro, a temperatura di 300 K, la magnetizzazione delle sole nanoparticelle ed è stata ottenuta la curva di magnetizzazione in funzione del campo magnetico applicato H [Oe] delle nanoparticelle (Fig.46a). Dai valori ottenuti è possibile osservare che il valore della magnetizzazione di saturazione del campione di nanoparticelle superparamagnetiche risulta pari a . Esso è nettamente inferiore al valore di magnetizzazione di saturazione delle SPION riportato in letteratura, pari a . Si presuppone quindi che le nanoparticelle utilizzate per la preparazione dei campioni di EMHV contengano un’elevata quantità di materiale organico al loro interno, che va ad abbassare, per effetto diamagnetico, la magnetizzazione.
In seguito è stata misurata, attraverso magnetometro, a temperatura di 300 K, la magnetizzazione del campione di eritrociti ingegnerizzati ottenendo così la curva di magnetizzazione [emu] in funzione del campo magnetico applicato H [Oe]. In
63 figura 46b è mostrato l’andamento della curva di magnetizzazione di uno dei quattro campioni analizzati. È possibile notare come il comportamento diamagnetico relativo al materiale organico presente nel campione faccia si che la magnetizzazione non raggiunga un massimo, come avviene nel caso delle nanoparticelle, ma si abbassi. È stata allora effettuata una correzione del contributo diamagnetico così da poter sovrapporre la curva di magnetizzazione dei campioni alla curva di magnetizzazione delle nanoparticelle di riferimento. La correzione è stata effettuata secondo la formula:
(20)
dove il fattore di scala è stato calcolato per un campo magnetico H=1500 Oe. I grammi di nanoparticelle nei quattro campioni sono stati allora ottenuti dal rapporto:
(21)
I risultati ottenuti per i quattro campioni sono riportati in tabella 1.
Per i campioni di tipologia WNP si osserva che la quantità di nanoparticelle nella preparativa 2WNP a eritrociti è poco più del doppio della quantità di nanoparticelle contenuta nella preparativa 1WNP a eritrociti. Per i campioni di tipologia DNP si vede che la quantità di nanoparticelle è pari alla metà della quantità di nanoparticelle contenute nei campioni WNP. Questo è dovuto probabilmente ad un errore in fase di preparazione dei campioni: durante la preparazione infatti è stato notato che i campioni di tipologia DNP apparivano più chiari dei campioni di tipologia WNP (Fig.47). campione NP [mg/ml] 1WNP 0.043 2 WNP 0.098 1DNP 0.024 2DNP 0.047
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(a) (b)
Fig.46. (a) Curva di magnetizzazione delle nanoparticelle superparamagnetiche NP
(b) Curve di magnetizzazione del campione di EMHV con e senza contributo diamagnetico
Fig.47. Campioni WNP e DNP di tipologia B
5.1.1 Calcolo della suscettività magnetica degli eritrociti ingegnerizzati
A partire dalle curve di magnetizzazione dei quattro campioni di eritrociti ingegnerizzati EMHV ricavate dall’analisi magnetometrica (Fig. 48), è stato possibile calcolare la suscettività magnetica di volume di ciascun campione. Attraverso un’operazione di media tra i valori ottenuti è stato possibile ricavare un valore di suscettività magnetica volumetrica medio, che è stato poi usato per quantificare la risposta degli eritrociti ingegnerizzati all’applicazione di un campo magnetico esterno. In Tabella 2 sono riassunte le quattro tipologie di campioni considerate.
Come si vede dalla figura 48, il campione 2WNP presenta valori di magnetizzazione più alti di quelli del campione 1WNP, a parità di campo magnetico applicato, a causa di una
65 maggiore quantità di nanoparticelle contenute al suo interno. Nel caso dei campioni di tipologia DNP invece, a seguito degli errori compiuti in fase di preparazione, i valori di magnetizzazione, a parità di campo magnetico applicato, sono gli stessi per i due campioni. campione contenuto 1WNP eritrociti SPION (0.043 mg/ml) Farmaco
Analizzato ad una settimana dalla preparazione
2WNP
eritrociti SPION (0.098 mg/ml)
Farmaco
Analizzato ad una settimana dalla preparazione
1DNP
eritrociti SPION (0.024 mg/ml)
Farmaco
Analizzato ad un giorno dalla preparazione
2DNP
eritrociti SPION (0.047 mg/ml)
Farmaco
Analizzato ad un giorno dalla preparazione
66
Fig.48. Curve di magnetizzazione dei quattro campioni EMHV ottenute da analisi magnetometrica del Laboratorio di Magnetismo Molecolare di Firenze con Matlab 7.9
A partire dalle curve di magnetizzazione è stata possibile calcolare la suscettività magnetica volumetrica di ciascun campione.
Sia la massa totale dell’i-esimo campione, definita come
(22)
dove è la massa totale delle nanoparticelle contenute nell’i-esimo campione, è la massa totale degli eritrociti contenuti nell’i-esimo campione e è
la massa del farmaco inserito nel campione i.
Considerando trascurabili e rispetto a è possibile scrivere:
(23)
Dividendo i valori di magnetizzazione m [emu] forniti dalla curva di magnetizzazione dell’i-esimo campione (Fig. 49) per la massa totale degli eritrociti contenuti nell’i-esimo campione , è stata ottenuta una curva di magnetizzazione M [ ] in funzione del campo magnetico applicato H [Oe] (Fig. 50).
A partire dalla curva ottenuta è stato possibile calcolare il valore di suscettività magnetica di massa dell’i-esimo campione. È stato considerato il primo tratto della
67 curva di magnetizzazione ottenuta, corrispondente ai valori di campo magnetico H compresi tra 0 Oe e 100 Oe (Fig. 51). È stato scelto un valore massimo di campo magnetico H pari a100 Oe in quanto diversi studi presenti in letteratura hanno mostrato valori simili di campo magnetico per la guida delle nanoparticelle magnetiche [Kummer 2010, Palagi 2012, Lucarini 2014].
È stata così calcolata l’equazione della retta che meglio approssima il primo tratto della curva di magnetizzazione, ossia tale per cui il coefficiente di determinazione relativo alla retta di regressione sia:
(24)
dove sono i valori di magnetizzazione osservati, la loro media e sono i dati stimati dal modello ottenuto dalla regressione.
Dal coefficiente angolare della retta è stato ottenuto il valore di suscettività magnetica di massa [
] dell’i-esimo campione, espresso nel sistema di misura CGS.
Il valore di suscettività magnetica di massa [ ] è stato convertito nel valore
di suscettività magnetica di massa [ ] espresso nel sistema internazione di misura SI secondo il seguente fattore di conversione:
(25)
Il valore di suscettività magnetica volumetrica adimensionae dell’i-esimo campione è stato ottenuto moltiplicando per la densità della soluzione
definita come:
(26)
dove è la massa della singola nanoparticella pari a , è la massa
del singolo eritrocita pari a , è il volume della singola nanoparticella pari a e è il volume del singolo eritrocita pari a
68 . È importante sottolineare che per il calcolo del volume del singolo
eritrocita è stato considerato un globulo rosso di raggio , la cui geometria è stata approssimata ad una sfera.
e sono rispettivamente la frazione di massa e la frazione di volume relative alle nanoparticelle dell’i-esimo campione e e sono rispettivamente la frazione di massa e la frazione di volume degli eritrociti dell’i-esimo campione. Esse sono definite come:
(27) (28) (29) (30)
dove e sono rispettivamente il volome totale delle nanoparticelle
contenute nell’i-esimo campione e il volume totale di eritrociti contenuti nell’i-esimo campione.
Poiché
(31)
(32)
si può scrivere che
(33)
69 e la densità della soluzione diventa
(35)
dove è la densità dei globuli rossi pari a 1100 .
Allora il valore di suscettività magnetica volumetrica dell’i-esimo campione è stato ottenuto come:
(36)
I risultati ottenuti per ogni campione sono riassunti in Tabella 3 e in Tabella 4. Come si vede dalla Tabella 4 mentre i valori di suscettività volumetrica ottenuti per i campioni 1WNP e 2WNP sono piuttosto simili, c’è una certa variabilità tra i risultati ottenuti per i campioni di tipologia 1DNP e 2DNP. Questo è probabilmente dovuto agli errori compiuti in fase di preparazione dei campioni DNP.
Campione i
1WNP 0.1976
2WNP 0.3951
1DNP 0.1976
2DNP 0.3951
Tabella 3. Valori di massa e volume della nanoparticelle superparamagnetiche e degli eritrociti contenuti nei campioni WNP e DNP
Per il calcolo della suscettività magnetica volumetrica media sono stati considerati solo i valori di suscettività magnetica di volume del campione 1WNP e 2WNP, pari
70 Campione i 1WNP 2WNP 1DNP 2DNP
Tabella 4. Valori di suscettività magnetica dei quattro campioni EMHV
A partire da questi valori, attraverso un’operazione di media, è stato ottenuto il seguente valore di suscettività magnetica volumetrica media degli eritrociti ingegnerizzati:
(37)
Un procedimento analogo a quello descritto per il calcolo della suscettività magnetica di volume degli eritrociti ingegnerizzati è stato seguito per il calcolo della suscettività magnetica di volume delle nanoparticelle superparamagnetiche contenute nei campioni di EMHV.
A partire dalle curve di magnetizzazione dei quattro campioni è stato possibile calcolare la suscettività magnetica volumetrica delle nanoparticelle e attraverso un’operazione di media tra i quattro valori ottenuti è stato calcolato un valore medio di suscettività magnetica di volume.
Dividendo i valori di magnetizzazione m [emu] forniti dalla curva di magnetizzazione dell’i-esimo campione (Fig. 49) per la massa totale di nanoparticelle contenuta nell’i-