Effetto della somministrazione di probiotici sull’attività proteasica dell’intestino tenue Per ogni trattamento sono state analizzate 3 repliche (1, 2, 3) Per ciascun gel elettroforetico la

prima linea è stata caricata con standard di riferimento per i pesi molecolari (marker low range, 97KDa, 66KDa, 45KDa, 30KDa, 20.1KDa, e 14.4KDa) e la seconda linea con 3µl di Tripsina 0.1mg/ml, le linee numero 3, 4 e 5 sono state caricate con campioni di repliche dello

37 stesso trattamento (C= Controllo, PF= Gruppo B, E= Gruppo A). Tutte le bande con attività proteasica emerse rappresentano delle proteinasi appartenenti alla famiglia delle gelatinasi in quanto tutte digeriscono gelatina porcina . Le bande che sono apparse comuni in tutti i gruppi (frecce rosse) sono state successivamente analizzate con il software Image J® (Rasband et al., 1997-2014; Abramof et al., 2004; Schneider et al., 2012) per avere una comparazione quantitativa tramite densità ottica delle differenze di attività tra le varie bande.

L’attività enzimatica al tempo 0, cioè all’inizio del periodo sperimentale, è descritta in Figura 20.

Figura 20: Zimografia di campioni di intestino tenue prelevati da esemplari di giovanili di Sparus aurata

all’inizio del trattamento sperimentale (giorno 0). C= Controllo; 1,2,3=numero della replica analizzata.

Osservando il risultato della zimografia al tempo 0 è possibile notare che le tre repliche considerate mostravano almeno una banda con attività protesica di peso molecolare tra 66 KDa e 97 KDa e una banda con attività protesica di peso molecolare tra 45 KDa e 66 KDa. (Figura 20).

Dall’osservazione delle zimografie relative ai campioni prelevati il giorno 21 di trattamento, non emergono differenze rilevanti, come si può osservare in Figura 21.

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Figura 21: Zimografia di campioni di intestino tenue prelevati da esemplari di Sparus aurata per i tre gruppi di

investigazione dopo 21 di trattamento sperimentale. C= Controllo, PF= Gruppo B, E= Gruppo A; 1,2,3=numero della replica analizzata; frecce rosse = bande comuni in tutti i gruppi, frecce gialle = bande presenti solo in gruppi C2 e PF1, frecce verdi = bande presenti solo in PF2, PF3, E2 ed E3.

Tutti i trattamenti considerati mostravano 2-3 bande con attività proteasica relativa a enzimi aventi un peso molecolare maggiore di 97 KDa, una banda relativa ad enzimi con peso molecolare compreso tra 66 e 97 KDa, una banda relativa ad enzimi con peso molecolare compreso tra 45 e 66 KDa e, infine, è stata osservata una banda, a volte due (in Gruppo B e in

Gruppo A),con attività proteasica relativa ad enzimi con peso molecolare tra 30 e 45 KDa

(frecce rosse in Figura 21); è stata poi osservata anche una banda relativa a proteasi con peso molecolare di 20,1 KDa, in Controllo (replica 2) e Gruppo B (replica1), bande evidenziate da frecce di colore giallo in Figura 21; infine,dalle zimografie sembra di poter rilevare la presenza di una banda di attività proteasica subito al di sotto di 45 KDa, nelle repliche 2 e 3 di entrambi i gruppi B ed A (freccia verde in Figura 21); al contrario, tali bande non si osservano in nessuna delle tre repliche del gruppo di Controllo.

Osservando le zimografie relative al campionamento effettuato al termine del periodo sperimentale (Figura 22) e cioè dopo 63 giorni di trattamento, differenze possono essere individuate soprattutto quando si effettuano dei confronti con i risultati ottenuti al precedente controllo (Figura 21).

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Figura 22: Zimografia di campioni di intestino tenue prelevati da esemplari di Sparus aurata, per i tre gruppi di

investigazione dopo 63 giorni di trattamento sperimentale. C= Controllo, PF= Gruppo B, E= Gruppo A; 1,2,3=numero della replica analizzata; frecce rosse = bande comuni in tutti i gruppi, frecce gialle = bande presenti solo in gruppi C2 e PF1, frecce verdi = bande presenti solo in PF2, PF3, E2 ed E3.

È possibile osservare che tutti i trattamenti considerati, mostravano 2-3 bande con attività proteasica con peso molecolare maggiore di 97 KDa, una banda relativa a proteasi con peso molecolare compreso tra 66 e 97 KDa, una banda relativa a proteasi con peso molecolare compreso tra 45 e 66 KDa ed infine è stata osservata una banda, con attività proteasica relativa ad enzimi con peso molecolare di 20,1 KDa (frecce rosse in Figura 22). Dai risultati ottenuti potremmo supporre che la somministrazione delle diete contenenti probiotici, nei gruppi B ed A, possa in qualche modo andare a indurre una attività protesica maggiore rispetto al Controllo. Infatti, nelle repliche dei gruppi B ed A si riscontrano ulteriori differenze e in particolare la presenza di:

− una banda di attività relativa a proteasi con peso molecolare maggiore di 97 KDa;

− due bande di attività relativa a proteasi con peso molecolare compreso tra 30 e 45 KDa;

− una banda con attività relativa a proteasi con peso molecolare tra 14.4 e 21.1 KDa che, in particolare, in precedenza non è mai stata osservata in nessun caso (frecce verdi in Figura 22).

Si osserva inoltre che, nei gruppi B ed A le bande con peso molecolare di circa 45 KDa presentano un incremento dell’attività protesica, rispetto alle bande corrispondenti nei

40 campioni del gruppo di Controllo, manifestando dei margini irregolari (Figura 22). Quest’ultimo aspetto era già emerso in un precedente lavoro di tesi relativo all’utilizzo degli stessi ceppi batterici in alimentazione di giovanili di orata (Breschi, 2014).

Analizzando quindi le differenze esistenti, tra la zimografia effettuata dopo 21 giorni di trattamento e quella effettuata dopo 63 giorni, è possibile osservare che:

− dopo 63 giorni di trattamento appaiono delle ulteriori bande relative a proteasi con peso molecolare maggiore di 97 KDa nei gruppi B ed A, che, a 21 giorni di trattamento non sembravano essere presenti;

− osservando la presenza di bande relative a proteasi con peso molecolare compreso tra 30 KDa e 45 KDa è possibile notare che a 21 giorni erano presenti in tutti i gruppi sperimentali, mentre dopo 63 giorni di trattamento risultano essere presenti solo per i gruppi B ed A;

− le bande relative a proteasi con peso molecolare di 20,1 KDa a 21 giorni di trattamento erano presenti solo nel Controllo (replica 2) e Gruppo B (replica 1) mentre al giorno 63 di trattamento sono presenti in ugual maniera in tutte le repliche dei tre gruppi sperimentali;

− dopo 63 giorni di trattamento appaiono delle bande relative a proteasi con peso molecolare compreso tra 14,4 KDa e 20,1 KDa solo nei gruppi B ed A, bande mai osservate a 21 giorni di sperimentazione.

Per mezzo del software Image J® (Abramoff et al., 2004; Rasband, 2007-2014; Shneider et al., 2012) è stata misurata la densità ottica relativa ad ogni banda, che presentava attività proteasica con uguale peso molecolare comune tra i tre gruppi d’indagine. Per facilitare la “lettura” dei dati, le bande in esame sono state evidenziate con lo stesso colore utilizzato nei relativi grafici esplicativi (Figura 23 e 24).

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Figura 23: Zimografia di campioni di intestino tenue prelevati da esemplari di Sparus aurata, per i tre gruppi di

investigazione, dopo 21 giorni di trattamento sperimentale, sottoposta a misurazione della densità ottica. C=

Controllo, PF= Gruppo B, E= Gruppo A; 1,2,3=numero della replica analizzata; ad uguale colore corrisponde la

presenza di banda/e con uguale peso molecolare emersa/e in tutti i gruppi.

La densità ottica delle bande di attività proteasica rilevate a 21 giorni di trattamento (Figura 23) sono rappresentate nei Grafici 11, 12, 13, 14, riportati di seguito. Dalla loro osservazione è possibile notare che valori numericamente più alti sono attribuibili al gruppo B, mentre

Gruppo A e Controllo presentano valori molto vicini tra loro; in ogni caso, queste differenze

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