Ruolo dei probiotici nella nutrizione di Sparus aurata: aspetti istologico-enzimatici, resistenza allo stress e performance produttive

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Dipartimento Scienze Veterinarie

Corso di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie delle Produzioni Animali

Tesi di Laurea

Ruolo dei probiotici nella nutrizione di

Sparus aurata: aspetti istologico-enzimatici,

resistenza allo stress e performance produttive

Candidato

Relatore

Carbone Valentina

Dott. Fronte Baldassare

Correlatore

Dott. Pirone Andrea

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I

NDICE

1. RIASSUNTO

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2. INTRODUZIONE

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2.1 Meccanismi d’azione dei probiotici PAG. 6

 Produzione di composti inibitori  Competizione verso i siti di adesione

 Modulazione della risposta immunitaria dell’ospite  Competizione per i nutrienti

 Miglioramento della qualità dell’acqua  Attività antibatterica

2.2 Effetti dei probiotici sul metabolismo delle specie ittiche PAG.10  Sulle performance produttive di crescita

 Sull’indice epato-somatico  Sulla microflora intestinale  Sugli enzimi digestivi  Sui parametri immunologici  Sull’istologia

3. SCOPO DEL LAVORO

PAG.15

4. MATERIALI E METODI

PAG.16

4.1 Descrizione della prova sperimentale PAG.16

4.2 Operazioni di routine PAG.17

 Stress test

4.3 Campionamento e analisi di laboratorio PAG.20

 Microbiologia  Istologia

 Zimografia (elettroforesi per attività)

4.4 Analisi statistica PAG.25

5. RISULTATI

PAG.27

5.1 Analisi microbiologiche PAG.27

5.2 Performance produttive PAG.27

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 Esposizione alle alte salinità  Resistenza all’esposizione all’aria

5.4 Effetto della somministrazione di probiotici sulla densità di cellule mucipare

intestinali PAG. 34

5.5 Effetto della somministrazione di probiotici sull’attività protesica dell’intestino

tenue PAG.36

6. DISCUSSIONI

PAG.48

7. CONCLUSIONI

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8. BIBLIOGRAFIA

PAG.52

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3

1. RIASSUNTO

Presso il Centro di ricerca per le specie marine “Maricoltura di Rosignano Solvay” (MRS) ed in collaborazione con il Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa, è stata condotta la prova sperimentale oggetto del presente lavoro di tesi. Lo scopo è stato quello di comparare gli effetti di due miscele a base di probiotici, incluse in diete per giovanili di

Sparus aurata L.

A tale scopo sono stati predisposti tre gruppi sperimentali: Controllo, Gruppo A e Gruppo B. Nel gruppo di Controllo non era prevista alcuna somministrazione di probiotici, nel gruppo A è stato aggiunto Bacillus amyloliquefaciens alla dieta base, comune a tutti i gruppi e, infine, nel gruppo B è stata aggiunta una miscela composta da Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis e Bacillus pumilus. Nel corso del periodo sperimentale, durato in totale 63

giorni, sono stati rilevati i dati produttivi dei tre gruppi sperimentali, come l’accrescimento giornaliero, il peso del fegato, dei visceri, il consumo alimentare, e calcolati gli indici epato-somatici, viscero-somatici oltre che lo SGR (SpecificGrowth Rate) e l’FCR (Feed Conversion Rate). Inoltre, ulteriori “misurazioni” sono state effettuate in merito alla resistenza allo stress (esposizione ad alte salinità e all’aria), ad alcuni parametri istologici (densità delle cellule mucipare intestinali) ed enzimatici (zimografia su intestino tenue). Infine, anche le miscele probiotiche impiegate, contenenti probionti nella loro forma di spora, sono state analizzate per la determinazione della relativa concentrazione.

I risultati hanno permesso di evidenziare, in varia misura, effetti dei probiotici a diversi livelli suggerendo possibili effetti positivi sulle performance produttive, sulla resistenza allo stress, sulla densità di cellule mucipare a livello intestinale. Infine, l’uso dei probiotici sembra che abbia indotto modificazioni anche a livello di enzimatico a carico dell’intestino.

In conclusione, le informazioni raccolte grazie alla conduzione della prova sperimentale, sembrano confermare la positiva azione svolta dall’uso di probiotici nell’allevamento delle specie ittiche. La conduzione di ulteriori studi sono quindi necessari al fine di confermare i risultati osservati.

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2. INTRODUZIONE

Negli ultimi decenni l’itticoltura ha avuto un incremento notevole su scala mondiale. Secondo un rapporto dell’Organizzazione delle Nazioni Unite per l’Alimentazione e l’Agricoltura (FAO), il consumo medio pro capite dei prodotti da acquacoltura destinati al consumo umano è salito dal 14%, nel 1986, al 47% nel 2006 e ci si può aspettare di raggiungere il 50% nei prossimi anni (Desriac et al., 2010). Ovviamente, quando la produzione ittica è condotta in allevamento, il sovraffollamento di vasche e gabbie è una prassi piuttosto comune, soprattutto in quei paesi in cui gli aspetti qualitativi non sono presi in sufficiente considerazione. Queste condizioni, unitamente a fattori di stress quali temperature inadeguate, sbalzi di salinità e scarsa qualità dell’acqua, possono facilitare la diffusione rapida di patologie infettive, in particolare durante gli stadi larvali dei pesci. A differenza di altri vertebrati, molte specie di pesci (come nel caso di Sparus aurata L.) schiudono infatti ad uno stadio vitale precoce e, di conseguenza, già in questa fase devono difendersi contro una grande varietà di microrganismi che vivono nell’ambiente acquatico. Un sistema immunitario efficiente è quindi un prerequisito fondamentale per il mantenimento di un ottimale stato di salute, sia in ambiente selvatico che di allevamento. Il diffondersi di patologie batteriche e virali, in determinate condizioni ambientali, può portare alla distruzione di interi stock ittici. È stato ampiamente documentato che in acquacoltura, i fenomeni di stress derivanti da parametri biotici e abiotici rendono le specie allevate più sensibili al diffondersi di infezioni. Per limitare l’incidenza di queste patologie,in alcuni allevamenti vengono applicati di routine trattamenti chemioterapici, di vaccinazione o di immunostimolazione (Bertoni, 2008).

Per quanto riguarda i chemioterapici, gli interventi sono molto costosi e potenzialmente dannosi, poiché responsabili della selezione di ceppi batterici antibiotico-resistenti. La vaccinazione orale e l’uso di immunostimolanti somministrati per immersione risultano gli approcci maggiormente sostenibili, grazie alle modalità di somministrazione poco stressanti per gli animali. Gli immunostimolanti (quali β-glucani, probiotici, derivati fungini e algali) in forma di integratori dietetici possono migliorare i meccanismi di difesa innati, consentendo un aumento della resistenza ai patogeni e riducendo drasticamente il tasso di mortalità, in particolar modo nelle larve e nelle post-larve, prima che la risposta immunitaria di tipo adattativo(antigene-dipendente) sia matura ed efficace (Bertoni, 2008).

Per evitare il ricorso all’uso di sostanze inibenti, poco compatibili con i principi di sostenibilità ambientale,nuovi spazi di ricerca e sperimentazione si sono aperti di recente allo sviluppo di formulazioni dietetiche che si basano su principi di ecologia microbica, con

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5 l’obiettivo di potenziare i meccanismi endogeni di protezione e/o,nel migliore dei casi, sostituire o integrare l’impiego di antibiotici e chemioterapici (Bertoni, 2008).

I probiotici sono batteri in grado di migliorare il benessere dell’animale ospite e vengono somministrati in acquacoltura tramite la dieta o utilizzati come additivi nell’acqua di allevamento. In bibliografia, è ampiamente documentato come il loro utilizzo comporti un miglioramento nella sopravvivenza larvale, nella crescita e nello sviluppo degli organismi trattati, tramite ad esempio la modulazione del sistema immunitario, l’aumento della capacità digestiva ed il miglioramento della qualità dell’acqua. Dati della FAO riportano perdite dell’ordine di bilioni di dollari all’anno a causa dell’alta mortalità che riguarda soprattutto le prime fasi dell’allevamento larvale di pesci ed invertebrati. Per queste ragioni, risulta evidente la necessità di studi volti a comprendere quali siano i meccanismi coinvolti nel miglioramento del benessere degli animali trattati con probiotici (Avella, 2011).

L’utilizzo di batteri benefici che modificano la microflora intestinale, attraverso l'integrazione alimentare risulta essere quindi un nuovo approccio sia da un punto di vista nutrizionale che immunologico (Bertoni, 2008).

Il termine “probiotici”, originato dalle parole greche “pro” e “bios” significa vita (Parker, 1974). Secondo la FAO, i probiotici possono essere definiti come microrganismi vivi, che somministrati in quantità adeguate conferiscono un effetto benefico all'ospite (FAO, 2001). Dopo la somministrazione di questi microorganismi utili all'ospite, essi sono in grado di colonizzare e moltiplicarsi nell'intestino dell'ospite e mostrare numerosi effetti benefici modulando vari sistemi biologici dei soggetti in esame (Cross, 2002). L'applicazione di probiotici ha ottenuto un particolare interesse grazie al loro aiuto nel favorire la flora microbica intestinale autoctona, e così aiutare a ripristinare l'equilibrio microbico (Cross, 2002; Morelliet al., 2003).

Importante è sapere che, in via preferenziale i batteri dovrebbero rimanere vitali, sia durante il loro stoccaggio che durante tutto il loro processo di lavorazione, affinché gli stessi possano svolgere la loro azione benefica; tuttavia, anche l'uso di cellule morte, disidratate al freddo, estratti cellulari liberi o spore,ha dimostrato un certo grado di successo (Merrifield et al., 2010). Le problematiche legate alla coltura di batteri vivi in condizioni di laboratorio controllate, ha ostacolato e limitato l'uso di probiotici nel settore dell'acquacoltura; pertanto, la somministrazione di spore o cellule liofilizzate, per la loro più pratica gestione, possono portare ad un maggiore impiego. Studi su questo argomento sono state effettuate da vari autori (Burr et al., 2005; Wang et al., 2008; Kesarcodi-Waston et al., 2008; Ringo et al., 2010). Inoltre, continuando a parlare della modalità di somministrazione dei probiotici, è necessario

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6 precisare che delle complicazioni potrebbero insorgere se i batteri utilizzati per le somministrazioni orali negli allevamenti ittici venissero introdotti vivi nell’ambiente. Questo è uno dei motivi per cui è stato considerato l’utilizzo di batteri inattivati e, quindi, incapaci di interagire per lungo tempo con l’ambiente acquatico. Inoltre, alcuni autori hanno ridefinito il termine probiotico come supplemento microbico, non necessariamente vivo, in grado di indurre effetti benefici sulla salute dell’ospite (Naidu et al., 1999;Salminen et al., 1999; Bertoni, 2008).

Molti studi sull’utilizzo di probiotici in acquacoltura, sono stati incentrati sulla valutazione degli effetti della somministrazione di un unico batterio in una o più dosi, mentre la valutazione comparativa delle formulazioni probiotiche multi-ceppo e multi-specifiche nei pesci è carente. Tra le questioni da risolvere c’è quella di dimostrare se la stimolazione del sistema immunitario indotta dalla somministrazione di formulazioni con due o più batteri risulti differente da quella promossa da una preparazione che ne utilizza uno soltanto. In tal senso e già stato dimostrato il potenziamento, a livello sistemico, dei parametri dell’immunità innata nell’orata (Sparus aurata L.) a seguito di somministrazione di ceppi probiotici vivi,

Lactobacillus delbrűeckii ssp. lactis e Bacillus subtilis, impiegati singolarmente o come

preparazione multispecie (Salinas et al., 2005). In un precedente lavoro di dottorato, svolto presso l’università di Ferrara (Bertoni, 2008), sono stati analizzati gli effetti della somministrazione (singola o combinata) di Lactobacillus delbrűeckii ssp. lactis e Bacillus

subtilis, inattivati con il calore, sul sistema immunitario dell’orata. Sono anche state fatte delle

considerazioni sull’utilizzo in acquacoltura di formulazioni mono-specie o multi-specie e sull’impiego di ceppi vivi o inattivati (Bertoni, 2008).

2.1 Meccanismi d’azione dei probiotici

I prebiotici sono definiti come ingredienti alimentari “non digeribili” che, tra l’altro, stimolano selettivamente la crescita e/o il metabolismo di batteri “salutari” nel tratto intestinale, migliorando in tal modo l'equilibrio intestinale di un organismo (Gibson e Roberfroid, 1995). Sono nella grande maggioranza carboidrati, in particolare oligosaccaridi. I prebiotici favoriscono la crescita e l'attività di Bifidobacterium e di Lactobacillus, specie batteriche importanti per la salute digestiva dell'organismo ospite.

Il termine probiotico è stato inizialmente definito da Parker (1974) come “organismi e sostanze che contribuiscono all’equilibrio microbico intestinale”.Fuller (1989) ha rielaborato la definizione di “integratore alimentare microbico diretto che incide beneficamente sull'ospite, migliorando l'equilibrio microbico intestinale”. Successivamente, Moriarty (1998)

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7 ha proposto di estendere la definizione di probiotici a microorganismi "additivi dell'acqua". La somministrazione di probiotici in acqua, ha dimostrato di migliorare la sua qualità riducendo le concentrazioni di azoto e fosforo (Wang et al., 2005). I probiotici più comuni che possono influenzare l’immunità dei pesci, resistenza alle malattie e di altre performance, appartengono al genere Bacillus e vari batteri acido lattici (Lactobacillus, Lactococcus,

Carnobacterium, Pediococcus, Enterococcus e Streptococcus). I batteri del genere Bacillus

sono Gram positivi e formano spore resistenti a varie condizioni ambientali. Bacillus subtillis,

B. licheniformis, B. circulans, B. coagulans, B. clausii, e B. megaterium, sono stati tutti

utilizzati con funzione probiotica. Lactobacillus rhamnosus, L. delbrüeckii, Carnobacterium

maltaromaticum, C. divergens, C. inhibens, ed Enterococcus faecium, sono altri batteri che

possono essere usati come probiotici. Anche lieviti come Candida e Saccharomyces

cerevisiae vengono studiati a tale scopo (Gatlin e Peredo, 2012).

I probiotici forniscono protezione attraverso la creazione di un ambiente ostile per patogeni mediante la produzione di composti inibitori, competendo per nutrienti e siti di adesione essenziali, o modulando la risposta immunitaria (Figura 1) (J.L.Balcázar et al., 2006).

Figura1: questo diagramma illustra come la complessa ecologia del tratto intestinale fornisca protezione contro i

patogeni. I probiotici forniscono protezione tramite la produzione di sostanze anti-microbiche (batteriocine), competono per i nutrienti essenziali e i siti di adesione, o modulano la risposta immunitaria (Balcázar et al., 2006).

Produzione di composti inibitori

I probiotici giocano un grande ruolo nella prevenzione dell’insorgenza di malattie tramite la produzione di composti inibitori che hanno un’azione antagonista nei confronti dei microrganismi patogeni; in tale modo, i probiotici ne contrastano la proliferazione nell’organismo dell’ospite (Tinh et al., 2007). L’attività anti-patogenica potrebbe essere dovuta alla singola o alla combinazione della produzione di antibiotici (Williams e Vickers,

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8 1986), batteriocine (Vanderbergh, 1993; Pybus et al., 1994; Panigrahi e Azad, 2007; Tinh et al., 2007), siderofori, lisozimi, proteinasi, perossido d’idrogeno e tramite l’alterazione dei livelli di pH (Sugita et al., 2009).

Competizione verso i siti di adesione

La competizione verso i siti di adesione e colonizzazione a livello dell’intestino e di altri tessuti è un'altra modalità d’azione tramite la quale i probiotici lottano contro i patogeni (Ringo et al., 2007). Infatti, la capacità di aderire alle mucose enteriche e alla superficie delle pareti intestinali è fondamentale per ogni patogeno per poter causare danni nell’ospite (Olsson et al., 1992; Vine et al., 2004). L’adesione dei probiotici può essere non specifica, sulla base di fattori fisico-chimici, o specifica, quando avviene grazie a specifici recettori esposti sulla superficie dei batteri endogeni e sui recettori delle cellule epiteliali (Salminen et al., 1996). Differenti strategie sono state avanzate per quanto riguarda l’adesione dei probiotici nel tratto gastro-intestinale, come ad esempio forze passive, interazioni elettrostatiche, idrofobiche, acidi lipoproteici, adesine e specifiche strutture di adesione (Lara-Flores e Aguirre-Guzman, 2009).

Modulazione della risposta immunitaria dell’ospite

I probiotici forniscono protezione contro gli agenti patogeni e potrebbero quindi aiutare, limitandone l’uso, le conseguenze nocive provocate dall’impiego di antibiotici e chemioterapici. Essi, inoltre, aiutano nella realizzazione della resistenza naturale e inducono un’alta sopravvivenza delle larve e dei giovanili di pesci, dovuta ad una maggiore immunità degli animali. In modi differenti i probiotici hanno diversi effetti stimolanti sul sistema immunitario dei pesci, vale a dire, effetti nelle cellule immunitarie, anticorpi, fosfatasi acide, lisozima e peptidi antimicrobici (Nayak, 2010). L’addizione di questo tipo di batteri nella dieta delle larve di merluzzo e aringhe, ha indotto una stimolazione del sistema immunitario e quindi una maggior resistenza contro gli agenti patogeni (Olafsen, 1998).

Competizione per i nutrienti

Di norma, i microrganismi probiotici costituiscono una parte della microflora endogena; mediante l’adesione alle mucose del tratto gastrointestinale, essi contribuiscono al mantenimento di buone condizioni generali di salute e al benessere dell’ospite (Gatesoupe, 1999; Farzanfar, 2006). La capacità di adesione di alcuni batteri è stata testata sia in vitro che

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9 in vivo, e i risultati suggeriscono che l’effetto positivo svolto dai probiotici sia basato sulla competizione per i nutrienti essenziali, per lo spazio, ecc. (Verschuere et al., 2000b); in pratica, sembra che i probiotici utilizzano le sostanze nutritive altrimenti consumate ad opera dei microorganismi patogeni. I microorganismi utili, a loro volta, servono come fonte supplementare di alimento e di attività microbica supplementare a livello del tratto digestivo, oltre ad essere fonti di vitamine e amminoacidi essenziali. È stato visto che alcune specie di

Bacteroides e Clostridium contribuiscono alla nutrizione dell’ospite fornendo soprattutto acidi

grassi e vitamine (Sakata, 1990).

Miglioramento della qualità dell’acqua

Batteri gram positivi, come quelli del genere Bacillus, oltre a migliorare le condizioni del sistema immunitario degli animali, svolgono un ruolo positivo nel miglioramento della qualità dell’acqua di allevamento. I suddetti microorganismi, agiscono in modo molto efficiente nella conversione di materiale organico in diossido di carbonio, in confronto a quanto facciano i batteri gram negativi; questi ultimi, infatti,convertono gran parte del materiale organico in biomassa batterica o melma. L’introduzione di specie Bacillus in prossimità degli aeratori di laghi, riduce la domanda chimica di ossigeno (Prubcan, 1991). Alcuni ceppi di probiotici hanno un forte effetto alghicida su molte specie di microalghe (Fukami et al., 1997). I problemi principali di qualità dell’acqua sono legati alla tossicità di ammoniaca e nitriti e l’impiego di colture nitrificanti in stagni e laghi potrebbe migliorare le condizioni generali (Lewis e Morris, 1986). Da questo punto di vista, infatti, i probiotici sono frequentemente impiegati negli allevamenti acquatici in quanto, migliorando la composizione delle specie microbiche ambientali, si ottengono dei benefici in termini di qualità dell’acqua. La temperatura, il pH, l’ossigeno disciolto, i livelli di ammoniaca e di idrogeno solforato sono stati trovati migliori in prove dove erano stati usati probiotici. Inoltre, se somministrati quotidianamente, inducono il mantenimento di un ambiente sano e più propizio per l’allevamento di gamberi e gamberetti, soprattutto nelle fasi larvali delle acque verdi (Banerjee et al., 2010).

Attività antibatterica

L’antagonismo batterico è un fenomeno comune in natura; pertanto le interazioni batteriche giocano un ruolo fondamentale nell’equilibrio tra batteri competitori benefici e potenzialmente patogeni (Balcázar et al., 2004). È stato dimostrato che alimentando i rotiferi

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10 con additivi alimentari,contenenti batteri acido lattici vivi o spore di Bacillus, diminuisce il numero di patogeni del genere Vibrio nel loro sistema di allevamento. La somministrazione di

Clostridium butirricum nell’allevamento della trota iridea, ha dimostrato di migliorare la

resistenza degli animali nei confronti della vibriosi (Sakai et al., 1999). È stato inoltre riportato che Lactobacillus mostra una maggiore capacità antagonista nei confronti di E. coli e

Pseudomonas aeruginosa (Oyetayo, 2004). B. subtilis ha dimostrato di ridurre

significativamente il numero di Aeromonas¸ Pseudomonas e Coliformi in alcuni pesci ornamentali d’acqua dolce (Ghosh et al., 2008). B. pumilus, B. firmus e C. freundii, hanno mostrato invece un effetto inibitorio nei confronti di Aeromonas hidrophila in soggetti di tilapia del Nilo (Aly et al., 2008a).

2.2 Effetti dei probiotici sul metabolismo delle specie ittiche

L’effetto dei probiotici è correlato a diversi fattori come ad esempio la forma di somministrazione, il “vettore” tramite il quale vengono somministrati, il dosaggio e la durata della somministrazione (Mohapatra et al., 2012). Più comunemente, e in particolare quando utilizzati a scopo sperimentale,i batteri utilizzati vengono sprayzzati o aspersi sulla superficie di alimenti che compongono la dieta di base (Balcázar et al., 2007a, b; Vendrell et al., 2008; Merrifield et al., 2010a, b, c, 2011). Inoltre possono essere somministrati in forma disidratata e liofilizzata (Panigrahi et al., 2007), spenta (Irianto e Austin, 2005; Newaj–Fyzul et al., 2007), disgregata (Brunt e Austin, 2005; Newaj–Fyzul et al., 2007), come cellule libere sovranatanti (Brunt e Austin, 2005;Newaj–Fyzul et al., 2007) e sottoforma di spore (Raida et al., 2003; Bagheri et al., 2008), dimostrando tutti un certo grado di successo.

Sulle performance produttive di crescita

L’uso di probiotici per migliorare i parametri di crescita e la resistenza alle malattie è stato ben documentato in acquacoltura (Robertson et al., 2000; Bjornsdottir et al., 2010); un miglioramento della sopravvivenza e relativo accrescimento è stato documentato in larve di halibut dopo un trattamento con prede vive unite ad una selezione di batteri autoctoni. In effetti, numerosi studi hanno dimostrato che l’impiego di probiotici può migliorare la conversione degli alimenti, il tasso di crescita e l’incremento di peso dei pesci, tra cui i salmonidi (Taoka et al., 2006; Bagheri et al., 2008; Wang et al., 2008b). L’aggiunta di probiotici nella dieta di carpe comuni ha dimostrato di poter migliorare la conversione alimentare. Su avannotti di trota iridea, Bagheri et al. (2008), riportano come l’aggiunta di

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Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis migliora significativamente l’FCR, ma influenza

positivamente anche il tasso di crescita giornaliero (SGR), il peso vivo finale e il tasso di efficienza proteica (PER),solo dopo due mesi di alimentazione con dieta contenente 3,8x109 cfu/g. Miglioramenti nella crescita di larve di gamberi e una riduzione sia dell’incidenza che della gravità delle malattie, è stata osservata in seguito a prolungata somministrazione di probiotici, quando utilizzati nelle vasche di allevamento larvale (Garriques e Arevalo, 1995). Uma et al. (1999) osservarono un significativo incremento di FCR, PER e FER (Rapporto di Efficienza Alimentare) in larve di gamberi quando alimentati con L. plantarum bioincapsulati in Artemia. Osservazioni simili sono state fatte da Suralikar e Sahu (2001) quando il probiotico L. cremoris, in quantità di 8,5x1011 cfu/g, è stato somministrato con l’alimento nella fase post larvale di gamberi di acqua fredda (Macrobrachium rosenbergii).

Sull’indice epato-somatico

L’indice epato-somatico consiste nel rapporto tra il peso del fegato e il peso corporeo del soggetto in esame e fornisce un’indicazione relativa alle riserve energetiche dell’animale. Infatti, in condizioni di allevamento caratterizzate da bassi livelli nutritivi, i pesci presentano un fegato di dimensioni ridotte a causa di una riduzione dell’accumulo di riserve energetiche (Chellappa et al., 1995). Alcuni ricercatori propongono questo indice anche come possibile “misura” della risposta dell'organismo ad uno stress non specifico. Esso può essere considerato tra gli indicatori biologici che si manifestano a livello fisiologico nell'organismo ed assume generalmente valori più elevati in organismi che vivono in condizioni più stressanti (Ada e Ayotunde, 2013,Perin, 2004, Sindhe e Kulkarni, 2004).

Sulla microflora intestinale

L’intestino è l’organo principale dove i probiotici si instaurano e svolgono la propria funzione benefica. Pertanto la discussione relativa alle relazioni tra probiotici e l’ambiente intestinale,da luogo a un profondo dibattito nell’ambito della comunità scientifica. La continuativa somministrazione di cellule batteriche (LAB, Bacillus spp. e alcune specie Gram-) nei salmonidi sembra portare ad un alto livello di colonizzazione e alla modulazione della microflora intestinale (Irianto e Austin, 2002b; Kim e Austin, 2006a; Balcázar et al., 2007a, b; Bagheri et al., 2008; Merrifield et al., 2010a, b, c, 2011). Diversi lavori suggeriscono che molti dei probiotici esercitano il loro effetto tramite la colonizzazione dell’ospite e la secrezione di numerosi nutrienti che favoriscono un miglioramento delle

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12 performance di accrescimento (Bagheri et al., 2008). Mohapatra et al. (2012), in una sperimentazione condotta su Labeorohita (pesce d'acqua dolce appartenente alla famiglia

Cyprinidae, tipico nei paesi orientali), hanno osservato riduzioni significative sui batteri

eterotrofi totali a vantaggio di una maggiore colonizzazione da parte dei batteri somministrati con la dieta, con il risultato finale di un miglioramento degli accrescimenti e dell’immunità.

Sugli enzimi digestivi

Gli organi digestivi sono davvero molto sensibili alla composizione alimentare e gli alimenti possono modificare molto rapidamente l’attività di molti enzimi digestivi (Bolasina et al., 2006; Shane et al., 2008); tali modifiche, talvolta, hanno ripercussioni importanti sulla salute e sulla crescita dei pesci. Gli enzimi liberati dai probionti, collaborano all’incremento della digestione e dell’utilizzo di alimento oltre che alla disintossicazione da metaboliti dannosi liberati dalla microflora patogena. Inoltre, l’attività enzimatica può anche influenzare il metabolismo microbico, sia quando questa aumenta che quando diminuisce. Le amilasi e le

lipasi sono i principali enzimi correlati con la digestione dei carboidrati e dei grassi. Tovar et al. (2002), riportano un aumento della secrezione di amilasi e tripsina in larve di spigola (Dicentrarchus labrax) quando venivano somministrati lieviti vivi (Debaryomices hansenii). Inoltre, Mohapatra et al. (2002) hanno notato un elevato livello di attività di enzimi digestivi (proteasi, lipasi ed amilasi) in Labeorohita,quando alimentato con un mix di Bacillus subtilis,

Lactococcus lactis e Saccharomyces cerevisiae. I batteri inoltre secernono proteasi che

digeriscono i legami peptidici delle proteine, scomponendole in monomeri e aminoacidi liberi, che a loro volta possono risultare benefici allo stato nutrizionale dell’animale. Una maggiore attività delle fosfatasi alcaline è stata osservata in Oreochromis niloticus quando alimentato con probiotici, ciò suggerendo un maggiore sviluppo delle ciglia (brush border membrane) sulla membrana degli enterociti; a sua volta, il maggiore sviluppo delle ciglia, è correlato ad un miglior assorbimento di carboidrati e di lipidi (Lara–Flores e Aguirre–Guzman, 2009). Le specie di Bacillus isolate da Cyprinus carpio ha considerevoli attività amilolitiche, cellulolitiche, proteolitiche e lipolitiche (Bairagi et al., 2002). I probiotici inoltre hanno un effetto davvero positivo sia sui processi digestivi che in relazione all’assimilazione dei componenti alimentari (Irianto e Austin, 2002b). Tale incremento nella digeribilità dei nutrienti è possibile che sia indotto da una migliore disponibilità di esoenzimi prodotti dai probiotici (Vine et al., 2006) o da migliori condizioni di salute (Mohapatra et al., 2012).

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13 Sui parametri immunologici

Tra i numerosi effetti benefici dei probiotici, la modulazione del sistema immunitario è uno dei più importanti. Il sistema immunitario dei pesci teleostei appare un efficiente mezzo con cui l’ospite si protegge e sfida i patogeni. La collaborazione esistente tra cellule della mucosa epiteliale dell’intestino, il muco, i prodotti antibatterici, i batteri commensali residenti nel tratto intestinale e le cellule immunitarie presenti nella mucosa e sub-mucosa sono di vitale importanza per la salute e il benessere dei pesci. La microflora endogena gioca un ruolo fondamentale per quanto riguarda l’attivazione del sistema immunitario. È stato riportato che molti composti batterici agiscono come immunostimolanti in pesci e gamberetti (Sakay, 1999). Salinaset al. (2006), riportano che l’attività di burst respiratorio (o attivazione metabolica, tipica dei leucociti) nei pesci teleostei (Sparus aurata L.) aumenta in vitro dopo l’aggiunta di Lactobacillus delbrueckiis ssp. Lactis inattivati al calore. Risultati simili sono stati osservati da Nikoskelainen et al. (2003), il quale riporta che alimentando soggetti di trota iridea con L. rhamnosus (8x104 cfu/g) per due settimane induce un significativo incremento dell’attività di burst respiratorio se comparato al gruppo di controllo. I probiotici sono responsabili del miglioramento dell’attività del complemento naturale nei pesci (Panigrahi et al., 2007; Salinas et al., 2008). Un aumento dell’attività del complemento è stata registrata in soggetti di trota iridea dopo la quarta settimana di alimentazione con probiotici inattivati attraverso il calore (Choi e Yoon, 2008).

I probiotici, inoltre, hanno un impatto molto forte sia sul sistema immunitario innato, sia su quello specifico delle specie ittiche (Nikoskelainen et al., 2003). La somministrazione orale di

L. delbrueckii spp. Lactis e B. subtilis, inattivati al calore, combinati tra loro o impiegati

singolarmente, incrementa le IgM nel siero, a livello intestinale e i granulociti acidofili in esemplari di orata (Salina set al., 2008).

Sull’istologia

Sono stati studiati gli effetti a livello istologico e sull’ecologia microbica nell’intestino di orata (Sparus aurata), in seguito a somministrazione di probiotici e microalghe con la dieta. Ad esempio, Cerezuela et al. (2012) hanno condotto diverse sperimentazioni alimentando i pesci con diete arricchite con Tetraselmis chuii, Phaeodactylum tricornutum liofilizzate, e

Bacillus subtilis vivo, singolarmente o combinati tra loro. Gli effetti delle differenti diete sono

stati evidenziati tramite microscopio ottico, valutando numerosi parametri legati al tratto intestinale quali, l’area, l’altezza ed il diametro dei villi intestinali e anche la densità cellule

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14 mucipare. Per quanto riguarda i risultati relativi a quest’ultimo parametro, si evidenza che il gruppo trattato con Phaeodactylum tricornutum e Bacillus subtilis presentava un aumento nel numero di cellule mucipare PAS+ rispetto al gruppo di controllo (Cerezuela et al., 2012). È tuttavia noto che le cellule mucipare secernono numerose varietà di sostanze mucoidi e che queste siano indicative della differente capacità di assorbimento (Sarasquete et al., 1995; Garcia Hernandez et al., 2001). In definitiva, è evidente che sono necessari ancora numerosi studi morfo-funzionali per comprendere le relazioni esistenti tra alimentazione e istologia, e tra questa e la funzione di difesa immunitaria svolta a livello intestinale nelle specie ittiche (Cerezuela et al., 2012).

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15

3. SCOPO DEL LAVORO

Come visto precedentemente, gli effetti dei probiotici sulle specie ittiche sono molteplici e non ancora del tutto chiari in quanto dipendenti dal tipo di batterio utilizzato, dalla forma d’impiego, dalla durata di somministrazione, dalla specie per la quale vengono impiegati ecc. Migliori accrescimenti e conversione alimentare, migliore resistenza allo stress e ad agenti patogeni, cambiamenti a livello di flora microbica intestinale, effetti a livello intestinale da un punto di vista enzimatico ed istologico, modulazione del sistema immunitario sono solo alcuni degli effetti riscontrati finora. Ottenere migliori performance produttive, collegate ad un migliore stato di salute dell’ospite, senza l’impiego di prodotti chemioterapici è uno degli aspetti che destano maggiore interesse. Per questi motivi il presente lavoro si aveva lo scopo di testare due diverse “miscele” a base di probiotici, in giovanili di Sparus aurata L. In particolare, è stato utilizzato un approccio multidisciplinare, al fine di ottenere una visione quanto più esauriente possibile, in merito agli effetti su diversi organi e funzioni fisiologiche. Il progetto è stato realizzato grazie alla collaborazione con il Centro di ricerca per le specie marine “Maricoltura di Rosignano Solvay” (situato in provincia di Livorno), appartenente al gruppo INVE Technologies©, ed il Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa.

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16

4. MATERIALI E METODI

4.1 Descrizione della prova sperimentale

La prova sperimentale oggetto del presente lavoro di tesi è stata condotta, nel periodo compreso tra settembre 2013 e novembre 2013. Lo studio, è stato promosso da INVE Technologies© e condotto presso il proprio Centro di ricerca per le specie marine “Maricoltura di Rosignano Solvay” (MRS), situato in Rosignano Solvay (LI). Per la conduzione della sperimentazione, è stata chiesta la collaborazione scientifica del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa (Responsabile scientifico del progetto Dott. Baldassare Fronte).

Come già accennato, lo studio consisteva in una prova comparativa di due prodotti su giovanili di Sparus aurata.

A tale scopo sono stati predisposti 3 gruppi (Controllo, Gruppo B ed Gruppo A), ciascuno con 4 repliche e 75 soggetti per replica; il peso medio iniziale dei soggetti, a 150 giorni di età, era di g 3,59 ± 0,01 (m ± es) per il gruppo di Controllo e per il Gruppo A e di g 3,6 ± 0,01 per il Gruppo B; la densità media di allevamento era di 1,34 ± 0,01 kg/m3 per il gruppo di

Controllo, di 1,37±0,02 kg/m3 per il Gruppo B e di 1,35±0,01 kg/m3 per il Gruppo A.

Tutti i gruppi ricevevano una dieta base (Perla MP-T®, Skretting) da preingrasso, suddivisa in 5 somministrazioni giornaliere; la razione iniziale, di circa 6 g per replica, è stata successivamente adeguata, con cadenza settimanale, in base agli accrescimenti dei soggetti. In definitiva, i gruppi erano così composti:

− Gruppo di Controllo: dieta base senza alcuna somministrazione di probiotici.

− Gruppo A: dieta base e aggiunta di probiotici nella misura di 0,2 g/kg di mangime; questo prodotto, era composto da spore di Bacillus amyloliquefaciens ad una concentrazione pari a 5x1010 ufc/g.

− Gruppo B: dieta base e aggiunta di probiotici nella misura di 2 g/kg di mangime; tale prodotto conteneva spore di: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e Bacillus

pumilus, con una concentrazione dichiarata in cartellino di 1x1010 ufc/g.

Durante il periodo sperimentale, settimanalmente sono state registrati sia il consumo di mangime che il peso vivo dei soggetti di ciascuna replica; attraverso questi, poi, per ciascuna replica sono stati calcolati il “Daily Growth Rate” (DGR) come differenza di peso tra due

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17 pesate successive diviso il numero di giorni, e il “Feed Conversion Rate” (FCR) come rapporto tra il consumo giornaliero e l’accrescimento giornaliero.

Preparazione del mangime: al fine di includere i prodotti da testare nella dieta base, quantità di mangime sufficienti per 7 giorni sono stati addizionati con 3 ml di olio di pesce e successivamente con 2 g di prodotto a base di probiotici utilizzati per il gruppo B, in un caso, e 0,2 g di prodotto nel gruppo A. L’aggiunta dell’olio di pesce, aveva il solo scopo di favorire l’adesione delle spore batteriche al pellet. Tutto il procedimento, ovviamente, è stato condotto mentre il mangime veniva continuamente miscelato grazie ad un apposito mixer. Una volta conclusa la preparazione dell’alimento sperimentale, lo stesso veniva conservato in ambiente refrigerato (4 °C) e al riparo dalla luce.

Le altre condizioni generali di allevamento, comuni a tutti i gruppi, sono riportate di seguito: − salinità dell’acqua: 38‰

− ricambio acqua: 800% al giorno

− temperatura: da circa 23 °C ad inizio prova a circa 17 °C a fine prova − ossigeno disciolto: maggiore di 6 mg/L

− fotoperiodo:14 ore di luce e 10 ore di buio − volume delle vasche: 200 L.

4.2 Operazioni di routine

Quotidianamente, mattina e pomeriggio,venivano fatte le operazioni di routine quali: − pulizia di tutte le vasche

− rilevamento livello di ossigeno disciolto − rilevamento temperatura

− somministrazione alimento

Settimanalmente sono stati effettuati il controllo della salinità dell’acqua e pH, oltre ai livelli di:

− nitriti (NO2)

− nitrati (NO3)

− ammoniaca (NH4)

Questi tipi di analisi sono stati effettuati sia sull’acqua in ingresso che sull’acqua delle vasche, tramite l’utilizzo di particolari kit commerciali (Spectroquant®, Merek) e di uno spettrofotometro (Nova 60®, Merek).

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18 Stress test

Gli stress test hanno come unico obiettivo quello di porre soggetti allevati in condizioni sub-ottimali, stressanti che solo quando prolungati nel tempo possono causare mortalità. Il corretto “dosaggio” dello stress “somministrato”, risulta essere determinante per il buon esito del test che, come unico obiettivo, ha quello di evidenziare eventuali differenze tra trattamenti in termini di resistenza a fattori stressogeni. Infatti, solo quando i soggetti testati vengono posti in condizioni estreme ma non immediatamente letali, il grado di resistenza di soggetti trattati diversamente potrà essere in qualche modo confrontato e “stimato” attraverso i seguenti parametri:

1. curva di sopravvivenza;

2. tempo medio di sopravvivenza; 3. sopravvivenza finale.

Inoltre, prima di eseguire i test, sono stati eseguiti appositi pre-test per determinare l’intensità dello stress da somministrare che più di altre era in grado di far rilevare possibili differenze tra i gruppi; tali pre-test, ovviamente sono stati condotti su un pool limitato di soggetti. Questa operazione risulta essenziale in quanto la sensibilità dei soggetti ad un determinato fattore stressogeno può variare al variare sia di condizioni ambientali (ad es. temperatura e qualità dell’acqua, pH, ecc.), sia in funzione dell’età dei soggetti.

Durante la prova sono stati effettuati diversi stress test, in particolare al giorno 42 e 63 di trattamento. A questo scopo sono stati eseguiti due differenti test:

1. Salinità (resistenza ad alte concentrazioni di salinità) 2. Esposizione all’aria (resistenza all’esposizione all’aria).

Il test di resistenza ad alte salinità, è stato ripetuto 2 volte nel corso del periodo sperimentale. Per il primo test (giorno 42 di prova sperimentale) all’acqua1 di mare sono stati addizionati 64 g di sale da cucina, ottenendo così una salinità pari al 102‰2; nel secondo test (giorno 63 di

1

L’acqua utilizzata per il test proviene dal circuito utilizzato per l’allevamento dei soggetti in esame, in modo tale da mantenere la stessa temperatura d’allevamento.

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Calcolo della salinità: essendo noto che 1 g di sale equivale ad 1 ‰ e che l’acqua di mare ha un livello di salinità pari a 38 ‰, una volta definito il quantitativo di salinità richiesto per il test si ottengono i grammi di sale da addizionare all’acqua per semplice differenza. Salinità desiderata (X ‰) – salinità dell’acqua (38 ‰) = grammi di sale necessari.

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19 prova sperimentale), invece, sono stati aggiunti 87 g di sale, per una salinità finale pari al 125‰. Per eseguire i test, da ogni replica sono stati prelevati 10 soggetti e trasferiti in secchi da 12 L, contenenti l’acqua alla salinità desiderata.

Successivamente, ogni 3 minuti, sono stati registrati i morti e durante tutta la prova i livelli di ossigeno e temperatura sono stati monitorati. La durata complessiva del test è stata di 60 minuti nel primo caso e 90 nel secondo.

Figure 2, 3, 4: allestimento e conduzione del test di resistenza ad alta salinità.

1. Test di resistenza all’esposizione all’aria

Anche in questo caso appositi pre-test sono stati eseguiti per determinare la più idonea combinazione, tra tempo di esposizione all’aria e tempo di recupero in acqua, in grado di permettere il rilevamento di possibili differenze tra i gruppi. I gruppi, predisposti seguendo le stesse modalità descritte in precedenza, fatta eccezione per l’aggiunta del sale, sono stati sottoposti al test come segue:

a. esposizione all’aria3 per 6 minuti e re immissione in acqua per 3 minuti b. conteggio dei morti allo scadere dei 3 minuti

c. riesposizione all’aria per ulteriori 8 minuti d. recupero in acqua per ulteriori 3 minuti e. conteggio dei morti allo scadere dei 3 minuti f. esposizione all’aria per 10 minuti

g. recupero in acqua per ulteriori 3 minuti

h. conteggio dei morti allo scadere dei 3 minuti finali.

3

Esposizione all’aria: per effettuare tale operazione sono stati utilizzati dei semplici retini all’interno dei quali i soggetti da testare rimanevano per il tempo dovuto, prima di essere poi re immessi in acqua.

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20

Figura 5, 6: svolgimento del test di esposizione all’aria.

Entrambi i test sopra descritti, rappresentano una attività routinaria in centri di ricerca e/o allevamenti di specie ittiche; gli stessi, infatti, vengono di regola condotti al fine di saggiare la qualità dei prodotti utilizzati, ovviamente da un punto di vista strettamente zootecnico e di welfare generale.

4.3 Campionamento e analisi di laboratorio

Al giorno 0, 21, 42 e 63 di prova sperimentale, 3 soggetti per replica sono stati sacrificati al fine di effettuare campionamenti del pacchetto gastro-intestinale ed epatico. A tale scopo, ciascun esemplare è stato anestetizzato (in liquido anestetico MS222), pesato, e infine, previa incisione ventro-laterale i diversi organi (visceri e fegato) sono stati a loro volta, estratti, pesati e preparati per il trasporto ai diversi laboratori di competenza; il rilevamento di tali pesi, ha permesso il successivo calcolo degli indici epato- e viscero-somatici medi per ciascuna replica. Inoltre, i campioni prelevati sono stati sottoposte alle seguenti analisi:

a. istologiche sull’intestino

b. enzimatiche (zimografie, elettroforesi per attività), sull’intestino tenue.

Figure 7, 8, 9, 10: sequenza di operazioni necessarie alla preparazione dei campioni da inviare ai vari laboratori

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21 Inoltre, i prodotti testati nei due gruppi sperimentali, sono stati analizzati allo scopo di determinarne l’esatta concentrazione batterica (ufc/g).

Microbiologia

Allo scopo di verificare la concentrazione di probionti presenti nei prodotti testati, dei campioni dei prodotti, utilizzati nei due gruppi sperimentali A e B, sono stati prelevati e sottoposti ad analisi microbiologiche.

Le analisi dei campioni sono state condotte presso il “Laboratorio di Malattie Infettive degli Animali Domestici del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa”.

Le analisi sono state effettuate adottando la seguente procedura:

− 1 grammo del prodotto liofilizzato è stato ricostituito in soluzione fisiologica sterile; − per ogni campione sono state eseguite diluizioni scalari in base 10 sempre in soluzione

fisiologica sterile da 1x10-1 a 1x10-12;

− le diluizioni ottenute sono state seminate in doppio su terreno APC4 (Plate Count Agar) e incubate poi a 30 °C per 3 giorni;

− l’enumerazione delle colonie è stata effettuata calcolando la media aritmetica delle colonie cresciute su due piastre, seminate con diluizioni consecutive, che presentassero un numero di colonie compreso tra 30 e 300.

Istologia

Indagini istologiche sono state effettuate a livello dell’intestino, al fine di valutare eventuali differenze indotte dall’impiego dei prodotti sopra descritti; in particolare è stata misurata la densità delle cellule mucipare (Sarasquete et al., 1995; Garcia Hernandez et al., 2001; Cerezuela et al., 2012).

A tale scopo, sono stati effettuati prelievi di intestino da due soggetti per replica, per un totale di 12 soggetti per gruppo; i campioni prelevati, venivano immediatamente fissati in formalina tamponata al 10% pH 7.4 e successivamente trasportati in laboratorio.

4

Plate Conut Agar: terreno di colore ambra chiaro utilizzato per il conteggio della carica microbica totale a base di triptone, estratto di lievito, glucosio e agar batteriologico. pH del terreno pronto per l’uso a 25°C: 7,0 ± 0,2.(http://www.sinergieanalitiche.it/public/prodotti/Plate%20Count%20Agar%20m144.pdf).

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22

Figure 11, 12, 13, 14: preparazione dei campioni destinati alle indagini istologiche.

Una volta giunti in laboratorio, i campioni sono stati trattati come segue:

1. lavaggio 2. ridimensionamento 3. disidratazione in alcol 4. diafanizzazione in xilolo 5. infiltrazione 6. inclusione in paraffina 7. taglio 8. colorazione

9. esame al microscopio ottico

Le suddette fasi sono state svolte presso il “Laboratorio di Istologia ed Anatomia del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa”.

1. Lavaggio

Prima di procedere alla disidratazione i campioni sono stati posti in acqua corrente al fine di eliminare il fissativo in eccesso che non si è legato ai componenti tissutali.

2. Ridimensionamento

Per una migliore inclusione, dopo il lavaggio, si è proceduto ad effettuare il taglio dell’intestino creando diverse sezioni. Sono state riposte poi all’interno di apposite formelle in materiale plastico in modo da poter effettuare poi i successivi passaggi.

3. Disidratazione

Compito della disidratazione è quello di rimuovere completamente l’acqua presente nei campioni. L’acqua non permetterebbe alla paraffina di permeare il tessuto. E’ stata utilizzata una serie ascendente di alcool (70°, 80°, 95°e 100°).

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23 4. Diafanizzazione in xilolo

Il processo di diafanizzazione o chiarificazione rende il tessuto più trasparente e permette alla paraffina (successivo passaggio di infiltrazione) di permeare il tessuto. Viene impiegato lo xilolo che è appunto un solvente della paraffina.

5. Infiltrazione

I campioni sono immersi in paraffina liquida: abbiamo usato una paraffina con punto di fusione a 58°C. Durante questo processo la paraffina si sostituisce allo xilolo permeando completamente il tessuto.

6. Inclusione

I campioni sono stati messi in appositi contenitori di metallo riempiti con paraffina liquida ed immediatamente collocati su di una piastra refrigerata per permettere alla paraffina una rapida solidificazione.

7. Taglio

I blocchetti di paraffina sono stati tagliati al microtomo, dopo essere stati raffreddati su un’apposita piastra, in sezioni di 5 μm di spessore che venivano posizionate in bagno contenente acqua distillata a 42°C e, successivamente, raccolte su un vetrino porta oggetti. Le sezioni sono state poi asciugate a 37°per una notte.

8. Colorazione con Ematossilina-Eosina (EE)

Passaggio fondamentale prima della colorazione è l’eliminazione della paraffina dalla sezione attraverso 2 passaggi in xilolo. Per procedere alla colorazione, essendo sia l’ematossilina che l’eosina delle soluzioni acquose, i vetrini venivano reidratati mediante l’immersione in una serie decrescente di alcoli (xilolo, 100%, 95%, 80%, 70%). Una volta idratati i vetrini venivano colorati con ematossilina-eosina.

Soluzioni coloranti: Ematossilina di Mayer (Carlo Erba) ed Eosina all’1% in soluzione acquosa (Carlo Erba).

Metodo di colorazione: porre le sezioni in Ematossilina di Mayer per 10 minuti, quindi lavare in acqua di fonte per 15-20 minuti. Passare le sezioni in Eosina per 5 minuti. Infine sciacquare in acqua distillata, disidratare in alcol, chiarificare in xilolo e montare in balsamo (DPX Montante per Istologia - Carlo Erba) con un vetrino copri oggetto.

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24 9. Esame al microscopio ottico

L’osservazione e l’analisi dei preparati è stata condotta con l’ausilio di un microscopio ottico “Leitz Diaplan” collegato ad un sistema di “Acquisizione dell’immagine in digitale”(Nikon-digital sight DS-U1).

Per ogni vetrino ottenuto sono state osservate 10 immagini, con ingrandimento a 25x, in modo da avere un campionamento più attendibile, sulle quali sono è stata effettuata l’operazione di conta delle cellule mucipare (goblet cell).

Zimografia (elettroforesi per attività)

Campioni dell’intestino tenue, sono stati prelevati allo scopo di effettuare analisi zimografiche allo scopo di evidenziare possibili differenze sia in termini di “pattern enzimatico”, sia in termini di attività protesica (Mohapatra et al., 2002; Tovar et al., 2002; Vine et al., 2006). Anche in questo caso sono stati effettuati prelievi di intestino tenue da due soggetti per vasca, per un totale di 12 soggetti per gruppo; in questo caso, i campioni prelevati sono stati immediatamente congelati (- 20 °C) e trasportati poi in laboratorio all’interno di provette eppendorf.

Figure 15, 16: sequenza di operazioni atte alla preparazione dei campioni destinati alle indagini zimografiche.

Le analisi dei campioni sono state svolte presso il “Laboratorio di Biochimica del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa”.

La preparazione dei campioni per l’esecuzione delle analisi zimografiche (estrazione e quantificazione delle proteine) è di seguito descritta:

− ai campioni sono stati aggiunti 300 μl di tampone fosfato 50 mM pH 7.2 e incubate per 15 minuti a -20 °C;

(26)

25 − in seguito allo scongelamento i campioni sono stati omogeneizzati con un pestello di

Teflon e vi sono stati aggiunti 300 μl di tampone fosfato 50 mM pH 7.2 ;

− infine i campioni sono stati incubati a -20 °C per almeno 16 ore e successivamene centrifugati a 14000rpm a 4 °C per 30 minuti;

− il supernatante è stato raccolto e ne è stata misurata la concentrazione proteica totale per mezzo del fluorimetro QBit 2.0 (Invitrogen, Life Technology);

− i campioni sono stati conservati a -20 °C fino al momento dell’esecuzione dell’elettroforesi per attività. Per campione è stata eseguita una corsa elettroforetica in condizioni non denaturanti secondo la tecnica di Laemmli (1970).

L’elettroforesi per attività è stata eseguita col seguente protocollo:

− lo strumento utilizzato per l’elettroforesi è stato mini vertical unit SE260 electrophoresis system (Amersham Bioscience);

− l’attività proteolitica delle proteine contenute nel campione è stata messa in evidenza mediante corsa elettroforetica su gel al 12% contenente gelatina porcina allo 1% (Heussen and Dowdle, 1980), 20 mÅ/gel a 15°C (Felicioli et al, 2004; Piccolomini et al, 2006);

− per ciascun campione sono stati caricati 1.7 μg di proteine diluite con Sample buffer senza β-mercaptanolo in un rapporto 1:1;

− sono stati utilizzati degli standard come riferimento per i pesi molecolari (marker low range 14,4-97 KDa, GE healthcare);

− dopo l’elettroforesi i gel sono stati sottoposti a lavaggio, agitando lentamente per 30 minuti, in 100 mL di soluzione al 2% di Triton X-100 per rimuovere l’SDS e ripristinare la piena attività enzimatica;

− i gel sono stati poi incubati a 37˚C per 1 ora immersi in 100 mM di Tris-HCl buffer pH 8 e quindi colorati con Coomassie Blue R250;

− la decolorazione infine è stata eseguita con una soluzione di metanolo al 40% e acido acetico al 10%.

4.4 Analisi statistica

Per determinare l’effetto del trattamento sulle misure è stata usata l’analisi della varianza seguita dal test di comparazione multipla di Tukey, per mettere in evidenza differenze esistenti rispetto al controllo o fra ogni singolo gruppo. Per quanto riguarda l’analisi dei dati

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26 di enumerazione, espressi come tasso di mortalità, è stato utilizzato il test di Kaplan-Mayer seguito da Chi2 per controllare se la differenza era dovuta al valore finale o al diverso andamento della stessa tra le diverse tesi. In tutti gli esperimenti le differenze sono state considerate significative quando p <0,05 (SAS, 2009).

(28)

27

5. RISULTATI

5.1 Analisi microbiologiche

Come accennato in precedenza, i prodotti a base di probiotici oggetto della prova sperimentale, sono stati analizzati per la determinazione del loro contenuto in batteri ed i risultati sono descritti di seguito:

− Gruppo A: 5x1010 ufc/g

− Gruppo B: 1,05x109 ufc/g

5.2 Performance produttive

Per quanto riguarda il peso vivo, durante l’intero periodo di sperimentazione non è stata osservata nessuna differenza significativa tra gruppi considerati (Tabella 1). Ciononostante, se si considera il peso finale (m±es), il Gruppo A ha fatto registrare il peso più alto (18,321±0,6833), seguito dal Gruppo B (17,766±0,6833) e infine dal Controllo (16,656±0,6833); tale andamento è rappresentato graficamente nel sottostante Grafico 1.

Tabella 1: Andamento del peso vivo (g) in funzione del trattamento e della sua durata

*lettere diverse sulla stessa riga ma in colonne diverse, indicano differenze statisticamente significative per p<0.05.

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28

Grafico 1: Andamento del peso vivo medio (g) durante il periodo sperimentale, in funzione dei trattamenti

considerati.

Anche per quanto riguarda il peso dei visceri, del fegato e degli indici viscero-somatici (Tabella 2), non si sono registrate differenze significative tra gruppi; per contro, a 21 giorni di trattamento, l’indice epato-somatico è risultato essere maggiore nel gruppo A con solo la differenza tra il primo e l’ultimo gruppo risultata statisticamente significativa (p<0,05).

Tabella 2: Peso (g) di visceri, fegato e relativi indici, in funzione del trattamento e della sua durata

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29 Tabella 3: Consumo alimentare (g/d) ed indici SGR (g) e FCR, in funzione del trattamento e della sua durata

Giorno Trattamento Parametro Controllo Gruppo A Gruppo B 0 - 7 Ingestione Alim. (g/d) 4,02 N.S. 4,03 N.S. 3,97 N.S. SGR (g) 4,76 N.S. 4,68 N.S. 4,76 N.S. FCR 0,84 N.S. 0,86 N.S. 0,83 N.S. 8 - 14 Ingestione Alim. (g/d) 4,01 N.S. 4,06 N.S. 4,03 N.S. SGR (g) 3,76 N.S. 3,44 N.S. 3,62 N.S. FCR 1,07 N.S. 1,18 N.S. 1,11 N.S. 15 - 21 Ingestione Alim. (g/d) 3,88 N.S. 3,82 N.S. 3,88 N.S. SGR (g) 2,65 N.S. 2,79 N.S. 2,71 N.S. FCR 1,46 N.S. 1,37 N.S. 1,43 N.S. 22 - 28 Ingestione Alim. (g/d) 3,42 N.S. 3,40 N.S. 3,36 N.S. SGR (g) 2,77 N.S. 2,71 N.S. 2,78 N.S. FCR 1,24 N.S. 1,25 N.S. 1,21 N.S. 29 - 35 Ingestione Alim. (g/d) 3,28 N.S. 3,30 N.S. 3,27 N.S. SGR (g) 2,55 N.S. 2,63 N.S. 2,65 N.S. FCR 1,29 N.S. 1,26 N.S. 1,24 N.S. 36 - 42 Ingestione Alim. (g/d) 2,97 N.S. 2,97 N.S. 2,96 N.S. SGR (g) 2,61 N.S. 2,55 N.S. 2,60 N.S. FCR 1,14 N.S. 1,17 N.S. 1,14 N.S. 43 - 49 Ingestione Alim. (g/d) 3,27 N.S. 2,83 N.S. 2,80 N.S. SGR (g) 2,13 N.S. 2,78 N.S. 2,90 N.S. FCR 1,53 N.S. 1,02 N.S. 0,97 N.S. 50 - 56 Ingestione Alim. (g/d) 2,33 N.S. 2,30 N.S. 2,28 N.S. SGR (g) 1,35 N.S. 1,32 N.S. 1,13 N.S. FCR 1,73 N.S. 1,74 N.S. 2,02 N.S. 57 - 63 Ingestione Alim. (g/d) 2,35 N.S. 1,59 N.S. 2,08 N.S. SGR (g) 1,17 N.S. 1,61 N.S. 1,81 N.S. FCR 2,01 N.S. 0,99 N.S. 1,15 N.S. 1 - 63 Ingestione Alim. (g/d) 3,28 N.S. 3,14 N.S. 3,18 N.S. SGR (g) 2,64 N.S. 2,72 N.S. 2,77 N.S. FCR 1,37 N.S. 1,20 N.S. 1,23 N.S.

Per quanto riguarda il consumo alimentare e gli indici SGR e FCR, durante tutte le fasi del periodo sperimentale non sono state osservate differenze statisticamente significative (p>0.05). Ciononostante, si è osservata una tendenza positiva nei gruppi trattati rispetto al controllo; infatti, se si considera la media dell’intero periodo sperimentale, si osserva che l’ingestione alimentare è stata di 3,28±0,214 g/d per il Controllo, 3,18±0,238 g/d per il

Gruppo B e 3,14±0,274 g/d per il Gruppo A

;

l’SGR è stato pari a 2,64±0,370 g per il

Controllo, 2,77±0,341 g per il Gruppo B e 2,72±0,324 g per il gruppo A. Anche i valori di

FCR confermano tale tendenza con 1,37±0,119 per il Controllo, di 1,23±0,112 per il Gruppo

(31)

30 mediamente ingerita dai soggetti appartenenti ai diversi gruppi è stata pari a 6,13x106 ufc

Gruppo B e 3,06x107 ufc Gruppo A.

5.3 Resistenza allo stress

Esposizione alle alte salinità

Come accennato in precedenza, una stima della resistenza allo stress, rappresentato da un repentino innalzamento del livello di salinità dell’acqua (da 38‰ a 102‰ e 125‰), è fornita dall’esame dei seguenti parametri:

1. curva di sopravvivenza (Grafico 2 e 3) 2. sopravvivenza media (Tabella 4) 3. sopravvivenza finale (Tabella 4)

Le curve di sopravvivenza (Grafico 2) osservate in occasione del test “alta salinità” (102‰) condotto a 42 giorni di trattamento, non hanno evidenziato differenze significative (p>0,05), così come per la sopravvivenza media (minuti) e per la sopravvivenza finale (numero di soggetti sopravvissuti al termine del test) (Tabella 4).

Grafico 2: Esposizione ad alta salinità a 42 giorni

di trattamento. Curve di sopravvivenza.

Log-Rank:

− Chi2= 3,2565, − DF = 2,

− Prob>Chi2 = 0,1964.

Per contro, la curva di sopravvivenza (Grafico 3) relativa all’esposizione ad alta salinità (125‰), test condotto a 63 giorni di trattamento, ha evidenziato differenze statisticamente significative tra i trattamenti considerati (p<0,05).

(32)

31

Grafico 3: Esposizione ad alta salinità a 63 giorni

di trattamento. Curve di sopravvivenza.

Log-Rank:

− Chi2 square = 9,1905, − DF = 2,

− Prob>Chi2 = 0,0101.

Anche la sopravvivenza media osservata per il gruppo di Controllo risulta essere maggiore (87,49±0,02 minuti) e diversa in maniera statisticamente significativa, rispetto al Gruppo B (56,08±0,02 minuti), ma non rispetto al Gruppo A (64,73±0,02 minuti) (Tabella 4).

Tabella 4: Sopravvivenza media e finale in funzione del trattamento e della sua durata

Resistenza all’esposizione all’aria

Per quanto riguarda il test effettuato a 42 giorni di trattamento è possibile notare che dopo 6 minuti di esposizione all’aria e allo scadere dei tre minuti di recupero in acqua (cioè a 9 minuti dall’inizio del test), nei gruppi Controllo e Gruppo B non si è registrato nessun caso di mortalità mentre nel Gruppo A si è registrato il decesso di 2 soggetti e, quindi, la sopravvivenza di 38 soggetti su 40 (Grafico 4). Al passo successivo, cioè a seguito di 8 minuti di esposizione all’aria e ulteriori 3 minuti di recupero in acqua (20 minuti complessivi dall’inizio del test), i sopravvissuti nei gruppi Controllo ed Gruppo A erano 31, mentre nel gruppo B erano 29 vivi su 40 (Grafico 5). Infine, al terzo passo del test, cioè dopo 10 minuti di esposizione all’aria e gli ulteriori 3 minuti di recupero in acqua, Controllo e Gruppo B

(33)

32 concludono il test con 5 soggetti sopravvissuti su 40, mentre il Gruppo A (che nella lettura precedente risultava essere numericamente uguale al gruppo Controllo), presenta il numero di soggetti sopravvissuti più alto con 11 vivi su 40 (Grafico 6). In ogni caso, nessuna delle differenze descritte è risultata essere statisticamente significativa (p>0,05).

Grafico 4: Test di resistenza all’esposizione all’aria

– sopravvivenza alla prima fase (6 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

– sopravvivenza alla seconda fase (8 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

– sopravvivenza alla terza ed ultima fase (10 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

(34)

33 Per quanto riguarda il test effettuato a fine prova (63 giorni di trattamento) è possibile notare che dopo i primi 6 minuti di esposizione all’aria (più 3 di recupero in acqua), i soggetti del gruppo Controllo e Gruppo B non hanno presentato alcuna mortalità (40 vivi su 40 soggetti totali) mentre nel gruppo trattato con Gruppo A si può notare una sopravvivenza di 39 soggetti su 40 totali (Grafico 7). Dopo i successivi 8 minuti di esposizione ed i relativi 3 minuti di recupero in acqua, nel Gruppo B il numero di sopravvissuti è sempre pari al 100% (40 vivi su 40) mentre nel Controllo si ha un numero di vivi pari a 39 su 40 e nel Gruppo A di 37 vivi su 40 (Grafico 8). Infine, i dati rilevati dopo gli ultimi 10 minuti di esposizione all’aria (più i 3 di recupero in acqua) mostrano che i soggetti sopravvissuti nel gruppo di

Controllo erano solo 25 su 40, nel gruppo Gruppo A erano 33 su 40 e nel Gruppo B erano 35

su 40 (Grafico 9). Anche in questo caso, i risultati sembrano indicare un chiaro “trend” nonostante le limitate differenze statisticamente significative, che sono state rilevate esclusivamente tra il (Grafico 9) Gruppo B ed il gruppo di Controllo (P<0.05).

– sopravvivenza alla prima fase (6 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

– sopravvivenza alla seconda fase (8 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

(35)

34

– sopravvivenza alla terza ed ultima fase (10 minuti di esposizione e 3 di recupero in acqua).

*lettere diverse indicano differenze statisticamente significative per p<0.05.

5.4 Effetto della somministrazione di probiotici sulla densità di cellule

mucipare intestinali

All’inizio del periodo sperimentale, cioè prima dell’inizio della somministrazione delle diete sperimentali, il numero medio di cellule mucipare per cm2 era pari a 354±46,3 (m±es). Al giorno 21 di trattamento, il Controllo (608±48,5) presentava una densità (n/cm2) di cellule mucipare maggiore rispetto al Gruppo B (464±53,4) ed infine il Gruppo A (439±48,5); tali differenze sono però risultate significative solamente tra il gruppo di Controllo ed il Gruppo A (p<0,05). Andando avanti con la sperimentazione, i risultati ottenuti dopo 42 giorni di trattamento mostrano che ci sono delle differenze numeriche, oltre che significative (p<0,05), tra le tre tesi; i gruppi trattati con probiotici, e cioè Gruppo A (557±120,8) e Gruppo B (282±120,8), presentano un numero di cellule mucipare per unità di superficie maggiore rispetto al gruppo di Controllo (253±120,8). Infine, a termine prova si osserva che il Gruppo

A (525±27,6) segue mostrando valori di cellule mucipare più elevati mentre Gruppo B

(395±27,6) e Controllo (396±27,6) presentano valori molto vicini tra loro ma di livello inferiori; anche in questo caso, le differenze osservate sono risultate essere statisticamente significative (p<0,05).

(36)

35

Figura 17: Gruppo Controllo (63 giorni di trattamento) prima (a) e dopo (b) l’esame al microscopio ottico.

Risultano essere presenti 77 cellule mucipare (CM) su 483 cm2.

Figura 18: Gruppo B (63 giorni di trattamento) prima (a) e dopo (b) l’esame al microscopio ottico. Risultano

essere presenti 87 cellule mucipare (CM) su 578 cm2.

Figura 19: Gruppo A (63 giorni di trattamento) prima (a) e dopo (b) l’elaborazione al microscopio ottico.

(37)

36 Tabella 8: Densità (n/cm2) delle cellule mucipare a livello intestinale in funzione del trattamento e della sua durata.

Grafico 10: Densità (n/cm2) delle cellule mucipare a livello intestinale in funzione del trattamento e della sua

durata.

*lettere diverse indicano differenze statisticamente significative per p<0.05.

5.5 Effetto della somministrazione di probiotici sull’attività proteasica dell’intestino tenue Per ogni trattamento sono state analizzate 3 repliche (1, 2, 3). Per ciascun gel elettroforetico la prima linea è stata caricata con standard di riferimento per i pesi molecolari (marker low range, 97KDa, 66KDa, 45KDa, 30KDa, 20.1KDa, e 14.4KDa) e la seconda linea con 3µl di Tripsina 0.1mg/ml, le linee numero 3, 4 e 5 sono state caricate con campioni di repliche dello