Sotto-periodi stagionali e raggruppamenti orari

Per studiare la variabilità mensile delle conte batteriche e delle letture BactoSense® è stato necessario suddividere la durata della Fase 1 in sotto-periodi, come riportato in Tabella 5.1.

Tabella 5.1 Sotto-periodi della Fase 1, in relazione al prelievo di campioni per l’analisi di laboratorio e di operatività della sonda BactoSense®.

Per quanto riguarda la variabilità giornaliera è stato necessario trovare intervalli orari che rispecchiassero le diverse condizioni idrauliche durante la giornata. Basandosi sul modello di richiesta d’acqua giornaliero a Milano, proposto da Candelieri (2017), rappresentato in Figura 5.1, sono stati individuati 6 raggruppamenti orari significativi di diverse condizioni di portata nella rete:

Laboratorio BactoSense® Primavera - 9 maggio - 31 maggio

Inizio estate 5 giugno - 20 giugno 1 giugno - 24 giugno

Estate 25 giugno - 20 agosto 25 giugno - 20 agosto

37 • Prima mattina (06 - 09) • Mattina (09 - 11) • Orario di pranzo (11 - 14) • Pomeriggio (14 - 19) • Orario di cena (19 - 21) • Sera (21 - 23) • Notte (23 - 06)

Figura 5.1 Andamento medio giornaliero della richiesta d’acqua per le diverse stagioni (adattata da Candalieri, 2017). Le linee continue rappresentano gli andamenti nei giorni lavorativi, quelle tratteggiate nei giorni festivi.

Le linee rosse delimitano gli intervalli orari scelti per l’elaborazione dei dati raccolti in Fase 1.

5.1.2. Monitoraggio mediante analisi convenzionali (conta in piastra)

Nel primo mese non è stata riscontrata la presenza di enterococchi, E. coli e coliformi totali, risultato atteso nel monitoraggio delle acque potabili (si ricorda che per il D. Lgs 31/2001 tali valori devono essere pari a 0 nelle acque destinate al consumo umano). Si è quindi deciso di non proseguire con queste analisi.

Sebbene non se ne fosse riscontrata la presenza, si è deciso di continuare a monitorare P. Aeruginosa. Infatti, come riportato nel paragrafo 2.2, P. Aeruginosa è un batterio biofilm-formatore e quindi può essere indicatore del distacco di biofilm.

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La presenza di P. aeruginosa è stata riscontrata in 12 campioni, 7 prelevati negli ultimi tre giorni del periodo “Estate”, 5 prelevati all’inizio del periodo “Fine estate”. Probabilmente ciò è dovuto al distacco di biofilm, cresciuto durante i mesi di luglio e agosto, per effetto delle variazioni di pressione o flusso nella rete.

I valori di pH e conducibilità non hanno mostrato variazioni significative (valore medio di pH pari a 7,89, di conducibilità pari a 606 µS/cm2_).

Le conte batteriche eterotrofe sono state effettuate dopo 2 e 3 giorni, come da protocollo, ma anche dopo 7 giorni in modo da permettere una maggior correlazione con la concentrazione di cellule totali misurate dalla sonda BactoSense®. Infatti, come riportato nel paragrafo 2.2, le cellule in grado di crescere in piastra sono circa l’1% di quelle effettivamente presenti, dunque un tempo di incubazione prolungato potrebbe portare a un risultato più rappresentativo.

Per quanto riguarda i valori di THB, in Tabella 5.2 sono riportate le statistiche descrittive (numero di dati, media, mediana, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo e massimo) delle quattro conte nei tre periodi e negli intervalli orari. I risultati sono rappresentati graficamente nei boxplot in Figura 5.2. Si può notare che il periodo “Estate” presenta i valori più alti (sia nella media che nella mediana che nei massimi), e una maggiore variabilità per tutte quattro le conte. I valori nel periodo “Inizio estate” e “Fine estate” sono invece simili, sebbene quest’ultimo periodo presenti valori leggermente superiori. Per quanto riguarda la variabilità oraria, si nota che i campionamenti serali presentano valori leggermente superiori agli altri.

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Tabella 5.2 Statistiche descrittive delle THB nei tre periodi stagionali (a) e nei quattro orari di campionamento (b). Valori di media, mediana, minimo e massimo e deviazione standard espressi in [UFC/ml], il coefficiente di

variazione è adimensionale.

n Media Mediana σ σ* Min Max

Inizio Estate 13 25 8 35,1 1,4 0 105 Estate 31 55 34 51,8 0,94 10 >300 Fine Estate 39 32 12 38,1 1,19 1 146 Inizio Estate 20 8 0 15,9 2,0 0 48 Estate 38 43 27 56,6 1,31 0 >300 Fine Estate 39 23 14 24,3 1,1 0 92 Inizio Estate 20 95 19 115,7 1,2 9 >300 Estate 39 135 120 97,3 0,72 21 >300 Fine Estate 38 66 55 43,2 0,7 15 187 Inizio Estate 18 86 3 136,7 1,6 0 >300 Estate 39 143 115 103,3 0,7 0 >300 Fine Estate 39 53 34 55,3 1,0 2 >300

n Media Mediana σ σ* Min Max

8:30 26 37 17 53,4 1,5 0 >300 10:30 28 33 17 36,5 1,1 0 141 12:30 23 48 27 46,8 1,0 1 147 18:30 8 27 49 26,9 1,0 7 86 8:30 28 19 7 28,7 1,2 0 >300 10:30 33 23 12 30,1 1,3 0 134 12:30 29 32 29 30,7 0,9 0 133 18:30 8 42 42 35,9 0,8 5 101 8:30 25 81 59 64,9 0,8 9 >300 10:30 32 66 52 53,8 0,8 10 >300 12:30 25 80 59 65,8 0,8 9 >300 18:30 8 106 84 81,7 0,8 32 214 8:30 24 61 24 69,2 1,1 0 >300 10:30 30 49 32 49,4 1,0 0 >300 12:30 23 76 68 72,1 0,9 0 >300 18:30 8 61 41 55,1 0,9 11 >300 (a) THB 22 °C THB 37 °C THB 22 °C 7 giorni THB 37 °C 7 giorni THB 37 °C THB 22 °C THB 37 °C 7 giorni THB 22 °C 7 giorni (b)

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Figura 5.2 Boxplot dei valori di THB a 22°C e THB a 37°C nei tre periodi (a) e negli orari (b) di campionamento.

Ricordando i limiti imposti sull’acqua in bottiglia dalla normativa italiana per i THB (Tabella 2.3), si sono calcolate le soglie di superamento di tali valori in ogni periodo, per avere un’indicazione della variazione di qualità dell’acqua (Tabella 5.3). Nel periodo “Estate” e “Fine estate” la percentuale di superamento dei limiti è piuttosto alta, soprattutto per le conte a 37°C in “Estate”.

Tabella 5.3 Percentuale di superamento dei limiti normativi per THB 22°C e THB 37°C su n campioni raccolti nel corso della Fase 1.

Per capire se vi fosse differenza significativa tra i diversi periodi e orari sono stati effettuati i test statistici riportati nella sezione 4.5.2. Per tutti i raggruppamenti, sia orari che stagionali, è risultata una non normalità dei campioni. L’omogeneità delle varianze vale sempre nei raggruppamenti orari, mentre per i raggruppamenti

n % THB 22°C > 100 UFC/ml n %THB 37°C > 20 UFC/ml Inizio estate 13 8 20 20 Estate 31 19 38 59 Fine estate 39 31 39 24

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stagionali questo vale solo per i valori di THB a 22°C. Dal p-value del test di Kruskal- Wallis sui raggruppamenti orari è risultato che non c’è variazione significativa (p- value pari a 0,508). Dai p-value del test di Kruskal-Wallis e di Welch sui tre periodi stagionali è risultato che c’è una variazione significativa, perciò si sono effettuati i test a posteriori di Dunn e di Conover. I valori dei p-value di questi ultimi due test sono riportati in Tabella 5.4. Si nota che il periodo “Estate” si differenzia significativamente dagli altri due periodi per tutte le cariche batteriche. Inoltre, il primo e il terzo periodo non presentano differenze significative, ad eccezione della carica mesofila dopo due giorni.

Tabella 5.4 Valori di p-value nei tre periodi stagionali per THB 22 °C (a), THB 37°C (b), THB 22 °C dopo 7 giorni (c) e THB 37°C dopo 7 giorni (d). Vi è differenza significativa per p-value < 0,025 (celle in azzurro).

Dall’analisi sugli andamenti delle conte e dai risultati dei test, ricordando che le THB danno indicazioni sulla ricrescita batterica e sulla pulizia e integrità dei sistemi di distribuzione (Carter, 2000; OMS, 2011), si deduce che c'è un peggioramento della qualità dell’acqua in rete in “Estate” rispetto a “Inizio estate”, e un leggero miglioramento a “Fine estate”, sebbene non ci sia un ritorno completo ai valori precedenti.

Per quanto riguarda le relazioni esistenti tra i THB, si nota in generale che più basse temperature e più alti tempi di incubazione portano a conte maggiori in accordo con lo studio di Reasoner (2004). Inoltre, dai grafici in Figura 5.3, che mettono in

Periodo Inizio estate Estate Periodo Inizio estate Estate

Estate 0,003 Estate 0

Fin estate 0,370 0,009 Fin estate 0 0,035

Periodo Inizio estate Estate Periodo Inizio estate Estate Estate 0,003 Estate 0,001

Fin estate 0,679 0,007 Fin estate 0,323 0,001

(b)

(c) (d)

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evidenza la relazione tra le conte, si nota una molto debole correlazione sia tra le conte con tempo di incubazione da protocollo e dopo 7 giorni, sia tra le conte mesofile e psicrofile. Ciò dimostra che le diverse temperature e i diversi tempi di incubazione portano allo sviluppo di popolazioni diverse, in accordo con lo studio di Bartram, in cui si riporta che la popolazione ritrovata dalle HPC differisce in modo significativo a seconda del metodo utilizzato (Bartram, 2013).

Figura 5.3 Relazione tra i valori di THB a 22°C e THB a 37°C in funzione del tempo di incubazione.