Per verificare se la sonda BactoSense® fosse in grado di riconoscere differenti ceppi batterici, si sono lette quattro diluizioni di acqua MilliQ® addizionata con E.
54
faecalis, P. aeruginosa e E. coli. In Figura 5.10 sono riportati i fingerprint di una delle
prove effettuate. I ceppi batterici tendono a occupare gate diversi nel grafico, tuttavia tale differenza è evidente solo quando la concentrazione batterica nell’acqua è dell’ordine di 104 UFC/ml per E. faecalis e E. coli, e 105 UFC/ml per P. aeruginosa.
Figura 5.10 Fingerprint dell’acqua addizionata con E. faecalis (a), P. aeruginosa (b) e E. coli per quattro diluizioni (da 1 a 4) riportate in Tabella 4.3.
55
Le analisi successive sono state svolte solo con E. coli, con lo scopo di verificare se la sonda BactoSense® fosse in grado di rilevarne la presenza nell’acqua di rete. In Figura 5.11 sono rappresentati i 4 fingerprint dell’acqua addizionata con le 4 diverse diluizioni. Nei fingerprint a concentrazione maggiore si nota la presenza di due sottopopolazioni all’interno del ceppo puro usato, in accordo con quanto riportato nella scheda tecnica del ceppo.
Figura 5.11 Fingerprint di acqua MilliQ® addizionata con E. coli, con rapporto di diluizione 1:103 (a), 1:104 (b),
1:105 (c) e 1:106 (d).
Per prima cosa si è cercato quale dei due gate riportati nel paragrafo 4.5.1 (Gate70 e Gate30) delimitasse meglio l’area di collocamento dei batteri di E. coli. Dalle letture BactoSense® di acqua MilliQ® addizionata sono state quindi estratte le conte nei due gate e nel GateTCC. Tali valori sono stati confrontati con le concentrazioni di E. coli in acqua ricavate con conte su piastra. In Tabella 5.11 sono riportati i valori dei coefficienti di correlazione, mentre in Figura 5.12 sono riportate le rette di calibrazione, sia su scala lineare che logaritmica, con i rispettivi R2. Il Gate70 è quello che presenta il coefficiente di correlazione maggiore, perciò è
56
quello che meglio delimita l’area dove si posiziona il ceppo batterico. Il Gate30 ha un coefficiente di correlazione minore degli altri due gate e risulta quindi meno adatto. Le analisi successive sono state svolte solo con GateTCC e Gate70.
Tabella 5.11 Indici di correlazione di Pearson per verificare la correlazione tra le letture BactoSense® in acqua MilliQ® addizionata con E. coli e conte su piastra di E. coli nei medesimi campioni (p-value del t test <
0,05 per tutte le combinazioni)
Figura 5.12 Retta di calibrazione per E. coli in acqua microfiltrata su scala lineare (a) e logaritmica (b).
Passando quindi ai campioni di acqua di rete, dalle letture dell’acqua di rete addizionata e non, sono state contate le cellule nel GateTCC e nel Gate70. Le due conte sono state quindi confrontate con le conte su piastra di E. coli sui medesimi campioni. In Tabella 5.12 sono riportati i coefficienti di correlazione di Pearson, mentre in Figura 5.13 sono rappresentate le rette di calibrazione con i rispettivi R2.
GateTCC Gate70 Gate30
57
Tabella 5.12 Indici di correlazione di Pearson per verificare la correlazione tra le letture BactoSense® in acqua di rete addizionata con E. coli e le conte su piastra di E. coli sui medesimi campioni (p-value del t test <
0,05 per le due combinazioni).
Figura 5.13- Retta di calibrazione per E. coli in acqua di rete su scala lineare.
Si nota che il GateTCC ha un indice di correlazione più alto del Gate70, sembra quindi che il comportamento di E. coli in acqua in cui sono presenti altri batteri, sia diverso rispetto al comportamento in acqua MilliQ®.
Ipotizzando che il rapporto tra la conta nel Gate70 e nel GateTCC possa essere indice della percentuale di E. coli rispetto alle cellule totali, si è calcolato tale rapporto nei campioni addizionati, che è risultato essere maggiore del 35%. Per verificare l’affidabilità di tale indice, il rapporto è stato calcolato sulle letture di acqua di rete della Fase 1, per le quali era stata confermata l’assenza di E. coli. Nel 50% dei casi l’indice è risultato minore del 35% (Figura 5.14), d’altro canto questo indica il 50% di falsi positivi.
GateTCC Gate70 Piastra 0,99 0,97
58
Figura 5.14 Boxplot del rapporto tra la conta cellulare nel Gate70 e nel GateTCC.
La maggiore difficoltà nell’identificazione di E. coli nell’acqua di rete è dovuta al fatto che il Gate70 si sovrappone alle fingerprint autoctone dell’acqua, come illustrato in Figura 5.15, in cui sono rappresentate due fingerprint di acqua di rete all’interno del GateTCC, e il confine del Gate70. Quindi, poiché le cellule naturalmente presenti si posizionano nel gate di E. coli, la sua identificazione risulta difficile.
Una seconda difficoltà è la sensibilità dello strumento alla presenza di rumore di fondo (sostanza organica, frammenti di cellule batteriche e particolato), presente anche in acqua MilliQ®. A tale rumore di fondo si aggiunge quello associato alle cellule non attive presenti nel brodo di coltura, che aumenta al crescere della quantità di batteri addizionati.
Infine la presenza delle due sottopopolazioni ha ulteriormente reso complessa la delimitazione dei gate.
Un aspetto che è bene sottolineare è il fatto che per ottenere rette di calibrazione adeguate è stato necessario lavorare con concentrazioni di E. coli molto elevate (da 102 a 105 UFC/ml), mentre in accordo con OMS una concentrazione in acqua pari a 10 UFC/100ml costituisce già un fattore di rischio (OMS, 2012). Tale scelta è stata
59
obbligata dai limiti dovuti alla sonda stessa. Il primo limite è dovuto alle soglie di rilevabilità e di quantificazione della sonda BactoSense® (rispettivamente pari a 100 cell/ml e 1000 cell/ml). Inoltre, i risultati forniti dalla sonda BactoSense® sono significativamente diversi tra loro soltanto se la differenza di concentrazione in termini di UFC del ceppo aggiunto è di almeno un ordine di grandezza.
60
6 CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
Lo studio ha dimostrato che i dati citometrici possono essere estremamente utili nel monitoraggio della qualità microbiologica dell’acqua potabile in rete, perché forniscono informazioni veloci e dettagliate che i metodi tradizionali non possono fornire. La sonda è, infatti, in grado di individuare variazioni nella concentrazione batterica nell’acqua che i metodi tradizionali non riescono a rilevare.
Nel monitoraggio della rete di distribuzione, la TCC presenta variazioni significative sia stagionali che giornaliere, in particolare cresce nel periodo estivo e presenta dei picchi giornalieri serali. La percentuale di HNA presenta anch’essa variazioni significative, cresce nel periodo estivo e presenta dei minimi nell’intervallo serale. L’aumento estivo è probabilmente dovuto alla crescita batterica favorita dall’aumento delle temperature e al ristagno nelle tubature dovuto a un abbassamento della richiesta idrica. Le variazioni giornaliere sono probabilmente dovute alle diverse condizioni idrauliche in rete e sono collegate alla crescita di biofilm e al suo parziale distacco.
Le analisi fornite dalla sonda BactoSense® sono qualitativamente concordi con i risultati delle conte batteriche, che hanno anch’esse evidenziato un deterioramento della qualità dell’acqua nel periodo estivo e un miglioramento a partire da settembre. Tuttavia nessuna correlazione significativa è stata riscontrata, il che rende l’uso della sonda BactoSense® utile nel monitoraggio della qualità microbiologica, ma non applicabile per la verifica del rispetto dei limiti normativi.
La sonda riesce a individuare la presenza di E. coli in acqua MilliQ® e a quantificare la variazione di concentrazione batterica sia in acqua MilliQ® che in acqua di rete. Tuttavia la concentrazione minima di rilevabilità della sonda è superiore alla dose minima infettante e la variazione di concentrazione deve essere elevata per essere individuata. In acqua di rete, dai risultati finora ottenuti, non è possibile identificare
61
la presenza di E. coli per la sovrapposizione della fingerprint di E. coli con le fingerprint autoctone.
Data la capacità della sonda BactoSense® di individuare variazioni di concentrazione batterica in acqua tramite TCC e data la possibilità di individuare l’origine di tali variazioni tramite l’analisi di %HNA, in futuro sarebbe utile effettuare uno studio in cui al monitoraggio di acqua di rete tramite sonda BactoSense® è affiancato un monitoraggio sulla variazione di temperatura, portata e pressione, oltre che di altri indici di formazione di biofilm.
Infine, data la capacità della sonda di individuare caratteristiche tipiche di ceppi batterici specifici, un interessante sviluppo potrebbe essere quello di implementare nuovi metodi per la loro identificazione.
62
BIBLIOGRAFIA
Ainsworth, R. (2013). Safe Piped Water: Managing Microbial Water Quality in Piped Distribution Systems. Water Intelligence Online, 12 doi:10.2166/9781780405841.
Antonelli, M., Carminati, M., Foschi, J., Mauro, M. Di, Mezzera, L., Tizzoni, M., & Turolla, A. (2019). Un progetto per il monitoraggio intelligente dell ’ acqua nelle reti di distribuzione, (c), 1–4.
APAT-IRSA-CNR. (2003a). 6000 - Metodi Microbiologici. Metodi Analitici per Le Acque.
APAT-IRSA-CNR. (2003b). 7000 - Metodi Per La Determinazione Di Microorganismi Indicatori Di Inquinamento E Di Patogeni. Metodi Analitici per Le Acque.
Ashbolt, N. J. (2004). Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology, 198(1–3), 229–238.
Baran, Y., & Nalbant, A. (2017). Flow cytometry : basic principles and applications, 8551(2), 163–176.
Bartram, J. (2013). Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety: The Significance of HPCs for Water Quality and Human Health. Water Intelligence Online, 12 doi:10.2166/9781780405940.
Batté, M., Appenzeller, B. M. R., Grandjean, D., Fass, S., Gauthier, V., Jorand, F., … Block, J. C. (2003). Biofilms in drinking water distribution systems. Reviews in Environmental
Science and Biotechnology, 2(2–4), 147–168.
Berry, D., Xi, C., & Raskin, L. (2006). Microbial ecology of drinking water distribution systems doi:10.1016/j.copbio.2006.05.007.
Besner, M. C., Gauthier, V., Barbeau, B., Millette, R., Chapleau, R., & Prevost, M. (2001). Understanding distribution system water quality. Journal / American Water Works
Association, 93(7), 101–114.
Bonadonna L, Ottaviani M (Ed.) (2007). Metodi analitici di riferimento per le acque destinate al consumo umano ai sensi del DL.vo 31/2001. Metodi microbiologici. Roma: Istituto
63
Superiore di Sanità. (Rapporti ISTISAN 07/5).
Bonadonna L., Briancesco, R., & Della Libera, S. (2005). Biofilm microbici nelle reti idriche: implicazioni di carattere sanitario e tecnologico, 18 Retrieved from http://old.iss.it/binary/mabi/cont/Notiziario ISS novembre 2005.1161337657.pdf.
Bouvier, T., Giorgio, P. A., & Gasol, J. M. (2007). A comparative study of the cytometric characteristics of High and Low nucleic-acid bacterioplankton cells from different aquatic ecosystems, 9, 2050–2066.
Briancesco, R. (2005). Indicatori microbiologici e valutazione della qualità delle acque superficiali. Annali Dell’Istituto Superiore Di Sanita, 41(3), 353–358.
Bushon, R. N., Brady, A. M., Likirdopulos, C. A., & Cireddu, J. V. (2009). Rapid detection of Escherichia coli and enterococci in recreational water using an immunomagnetic separation ⁄ adenosine triphosphate technique, 106, 432–441.
Cabral, J. P. S. (2010). Water microbiology. Bacterial pathogens and water. International
Journal of Environmental Research and Public Health, 7(10), 3657–3703.
Candelieri, A. (2017). Clustering and support vector regression for water demand forecasting and anomaly detection. Water (Switzerland), 9(3) doi:10.3390/w9030224.
Carter, J. T., Rice, E. W., Buchberger, S. G., & Lee, Y. (2000). Relationships between levels of heterotrophic bacteria and water quality parameters in a drinking water distribution system. Water Research doi:10.1016/S0043-1354(99)00310-3.
Clark, B. R. M., & Hess, A. F. (1993). American Water Works Association ( AWWA ), Distribution Systems Sym-, 119(2), 349–364.
Controllo, A. D. I., & Ermini, R. (2000). Standard di qualità in reti idriche di distribuzione e possibili alternative di controllo, (September) Retrieved from https://www.researchgate.net/profile/Ruggero_Ermini/publication/301777125_STAND ARD_DI_QUALITA_IN_RETI_IDRICHE_DI_DISTRIBUZIONE_E_POSSIBILI_ALTE RNATIVE_DI_CONTROLLO/links/57276acf08aef9c00b8b473c.pdf.
64
Craun, G. F., Brunkard, J. M., Yoder, J. S., Roberts, V. A., Carpenter, J., Wade, T., … Roy, S. L. (2010). Causes of Outbreaks Associated with Drinking Water in the United States from 1971 to 2006, 23(3), 507–528.
DECRETO LEGISLATIVO 2 febbraio 2001, n. 31 «Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualita` delle acque destinate al consumo umano»
DECRETO 14 giugno 2017 . Recepimento della direttiva (UE) 2015/1787 che modifica gli allegati II e III della direttiva 98/83/CE sulla qualità delle.
Della, F. (2017). relazione all ’ evoluzione delle competenze tecnico-scien- tifiche o in esecuzione di disposizioni adottate in materia in sede comunitaria , attribuisce al Ministero della sanità , Decreta :, 14–19.
Gagnon, G., Volk, C. J., Chauret, C., Murphy, H. M., O’Leary, K. C., & Andrews, R. C. (2006). Changes in microbiological quality in model distribution systems after switching from chlorine or chloramines to chlorine dioxide. Journal of Water Supply: Research
and Technology - AQUA, 55(5), 301–311.
Gunnarsdottir, M. J., Gardarsson, S. M., Figueras, M. J., Puigdomènech, C., Juárez, R., Saucedo, G., … Hunter, P. (2020). Water safety plan enhancements with improved drinking water quality detection techniques. Science of the Total Environment,
698(August 2019), 134185.
Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., & Egli, T. (2008). Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes, 42, 269–277.
Hammes, F., & Egli, T. (2010). Cytometric methods for measuring bacteria in water: Advantages, pitfalls and applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 397(3), 1083–1095.
Hyun-Jung, J., Choi, Y. J., & Ka, J. O. (2011). Effects of diverse water pipe materials on bacterial communities and water quality in the annular reactor. Journal of Microbiology
65
Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., & Susann, M. (n.d.). CHIC 2 2 An Automated Approach for the Detection of Dynamic Variations in Complex Microbial Communities doi:10.1002/cyto.a.22286.
Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., & Müller, S. (2014). Cytometric fingerprints : evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics, 5 (June), 1–12.
LeChevallier, M. W., Babcock, T. M., & Lee, R. G. (1987). Examination and characterization of distribution system biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 53(12), 2714– 2724.
Lehtola, M. J., Miettinen, I. T., Keinänen, M. M., Kekki, T. K., Laine, O., Hirvonen, A., Martikainen, P. J. (2004). Microbiology, chemistry and biofilm development in a pilot drinking water distribution system with copper and plastic pipes. Water Research,
38(17), 3769–3779.
Li, P., & Wu, J. (2019). Drinking Water Quality and Public Health. Exposure and Health,
11(2), 73–79.
Liang, L., Goh, S. G., Vergara, G. G. R. V., Fang, H. M., Rezaeinejad, S., Chang, S. Y., … Gin, K. Y. H. (2015). Alternative fecal indicators and their empirical relationships with enteric viruses, Salmonella enterica, and Pseudomonas aeruginosa in surface waters of a tropical urban catchment. Applied and Environmental Microbiology, 81(3), 850– 860.
Liu, G., Van Der Mark, E. J., Verberk, J. Q. J. C., & Van Dijk, J. C. (2013). Flow cytometry total cell counts: A field study assessing microbiological water quality and growth in unchlorinated drinking water distribution systems. BioMed Research International,
2013, 11–14.
Logsdon, G. S. (1991). Water quality in distribution systems. Proceedings - AWWA Annual
Conference, 81–85.
Mahmoodi, S. N., & Khadem, S. E. (2003). Development of vibration analysis using Wigner distribution for machinery fault diagnosis. Proceedings of the Tenth International
66
Congress on Sound and Vibration, 1291–1298.
Mann, E. E., & Wozniak, D. J. (2012). Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiology Reviews, 36(4), 893–916.
Momba, M. N. B., Kfir, R., Venter, S. N., & Cloete, T. E. (2000). An overview of biofilm formation in distribution systems and its impact on the deterioration of water quality.
Water SA, 26(1), 59–66.
Moreira, N. A., & Bondelind, M. (2017). Safe drinking water and waterborne outbreaks, 83– 96.
Niquette, P., Servais, P., & Savoir, R. (2000). Impacts of pipe materials on densities of fixed bacterial biomass in a drinking water distribution system. Water Research, 34(6), 1952–1956.
Noble, R. T., Blackwood, A. D., Griffith, J. F., Mcgee, C. D., Weisberg, S. B., Al, N. E. T., & Icrobiol, A. P. P. L. E. N. M. (2010). Comparison of Rapid Quantitative PCR-Based and Conventional Culture-Based Methods for Enumeration of Enterococcus spp . and Escherichia coli in Recreational Waters ᰔ, 76(22), 7437–7443.
Organizzazione Mondiale della Sanità - OMS (1980). Guidelines for drinking-water quality - 4th ed.
Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., & Wales, D. S. (1998). Biofilm development on stainless steel in mains water. Water Research doi:10.1016/S0043-1354(97)00132-2.
Pianetti, A., Falcioni, T., Bruscolini, F., Sabatini, L., Sisti, E., & Papa, S. (2005). Determination of the viability of Aeromonas hydrophila in different types of water by flow cytometry, and comparison with classical methods. Applied and Environmental
Microbiology, 71(12), 7948–7954.
Prest, E. I., Hammes, F., Ko, S., & Loosdrecht, M. C. M. Van. (2013). ScienceDirect Monitoring microbiological changes in drinking water systems using a fast and reproducible flow cytometric method, 7 doi:10.1016/j.watres.2013.07.051.
67
Proctor, C. R., & Hammes, F. (2015). Drinking water microbiology-from measurement to management. Current Opinion in Biotechnology, 33(Figure 1), 87–94.
Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., & Boon, N. (2016). Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry, (Ackermann 2015), 1376– 1385.
Reasoner, D. J. (2004). Heterotrophic plate count methodology in the United States.
International Journal of Food Microbiology, 92(3), 307–315.
Rende, A. (2011). Acquedotto di:, 1500, 2011.
Richard A. Haugland, Shawn C. Siefring, Larry J. Wymer, Kristen P. Brenner, Alfred P. Dufour (2005). Comparison of Enterococcus measurements in freshwater at two recreational beaches by quantitative polymerase chain reaction and membrane filter culture analysis, 39, 559–568.
River, E., Liu, J., Hao, Z., Ma, L., Ji, Y., Bartlam, M., & Wang, Y. (2016). Spatio-Temporal Variations of High and Low Nucleic Acid Content Bacteria in an Spatio-Temporal Variations of High and Low Nucleic Acid Content Bacteria in an Exorheic River, (April) doi:10.1371/journal.pone.0153678.
Sadiq, R., Kleiner, Y., & Rajani, B. (2004). Aggregative risk analysis for water quality failure in distribution networks. Journal of Water Supply: Research and Technology - AQUA,
53(4), 241–261.
Safford, H. R., & Bischel, H. N. (2019). Flow cytometry applications in water treatment , distribution , and reuse : A review. Water Research, 151, 110–133.
Schleich, C., Chan, S., Pullerits, K., Besmer, M. D., Paul, C. J., Rådström, P., & Keucken, A. (2019). Mapping dynamics of bacterial communities in a full-scale drinking water distribution system using flow cytometry. Water (Switzerland), 11(10), 1–14.
Scoglio, M. E., Grillo, O. C., Munaò, F., Di Pietro, A., & Squeri, L. (1989). Water quality and microbiological status of the distribution system: traditional parameters and emerging
68
parameters | Qualità dell’acqua e stato microbiologico alla distribuzione: parametri tradizionali e parametri emergenti. Annali Di Igiene : Medicina Preventiva e Di
Comunita, 1(5), 1243–1254.
Sekar, R., Deines, P., Machell, J., Osborn, A. M., Biggs, C. A., & Boxall, J. B. (2012). Bacterial water quality and network hydraulic characteristics : a field study of a small , looped water distribution system using culture-independent molecular methods, 1220– 1234.
Standridge, J. (2008). E. coli as a public health indicator of drinking water quality. Journal /
American Water Works Association, 100(2), 65–75.
Stoodley, P., Wilson, S., Hall-stoodley, L., Boyle, J. D., Lappin-scott, H. M., & Costerton, J. W. (2001). Growth and Detachment of Cell Clusters from Mature Mixed-Species Biofilms, 67(12), 5608–5613.
Tsvetanova, Z. (n.d.). Study of Biofilm Formation on Different Pipe, 463–468.
Turolla, A., Mauro, M. Di, Mezzera, L., Antonelli, M., & Carminati, M. (2019). Sensors and Actuators B : Chemical Development of a Miniaturized and Selective Impedance Sensor for Real- Time Slime Monitoring in Pipes and Tanks. Sensors & Actuators: B.
Chemical, 281(October 2018), 288–295.
Van Der Wielen, P. W. J. J., & Lut, M. C. (2016). Distribution of microbial activity and specific microorganisms across sediment size fractions and pipe wall biofilm in a drinking water distribution system. Water Science and Technology: Water Supply, 16(4), 896–904.
Vital, M., Hammes, F., & Egli, T. (2012). Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research,
46(19), 6279–6290.
Wang, J., Qiu, S., Fuentes, C. A., Zhang, D., Wang, X., Vuure, A. W. Van, & Seveno, D. (2017). Application Report, 1–3.
69
quantification of bacterial cells in freshwater by using a microfluidic device for on-chip staining and counting. Applied and Environmental Microbiology, 77(4), 1536–1539.