Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria per l’Ambiente e il
Territorio
Confronto tra citometria di flusso e metodi
tradizionali per il monitoraggio della qualità
microbiologica dell'acqua potabile
Relatore: Prof. Ing. Manuela Antonelli Correlatore: Ing. Marco Gabrielli
Tesi di laurea di:
Cristina Baronchelli
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Un sentito grazie alla mia relatrice, Prof. Manuela Antonelli, per la fiducia riposta in me e per la disponibilità mostrata durante lo svolgimento.
Grazie anche al mio correlatore, Marco Gabrielli per i preziosi suggerimenti e consigli donati durante lo svolgimento e la stesura del lavoro di tesi.
Ringrazio tutto il personale della Salazzurra del CAP, con cui ho collaborato durante il progetto, per la gentilezza con cui mi hanno accolta e la pazienza con cui mi hanno insegnato.
Grazie alla mia famiglia, perché senza di loro non avrei potuto intraprendere questo percorso di studi.
Il grazie più sincero infine è per te, che hai aperto questa tesi solo per cercare il tuo nome in questo paragrafo.
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laboratorio per la ricerca di microorganismi indicatori di contaminazione patogena, come
E. coli e enterococchi, o indicatori di qualità, come la conta eterotrofa totale psicrofila e
mesofila (HPC). Tuttavia l’utilizzo di indicatori non è sempre rappresentativo della qualità dell’acqua, inoltre la ricerca della presenza di tali microorganismi è basata su conta su piastra, il che la rende un processo lento che fornisce indicazioni retrospettive. Ai fini di implementare metodi alternativi che permettano una valutazione qualitativa più veloce e un’analisi quantitativa più accurata, è stata valutata la funzionalità di una sonda basata sulla citometria di flusso per il monitoraggio della concentrazione batterica in acqua di rete e per l’identificazione di indicatori patogeni. In una prima fase la sonda ha monitorato per cinque mesi l’acqua di una rete di distribuzione di un comune italiano, in concomitanza con un piano di campionamento volto alla ricerca in laboratorio di indicatori di qualità microbiologica. In una seconda fase è stata valutata la capacità della sonda di identificare e quantificare la presenza in acqua indicatori patogeni, effettuando letture di acqua addizionata con ceppi batterici puri. In particolare si è cercato di identificare la presenza di E. coli in acqua potabile. Dai risultati della prima fase è emerso che la citometria fornisce risultati più accurati e permette una conoscenza sulla variazione cellulare in acqua che le conte tradizionali non forniscono. Attraverso l’analisi dei dati citometrici, in particolare della conta cellulare totale (TCC) e della percentuale di cellule ad alto contenuto di acido nucleico (HNA), è possibile avere un’idea della variazione dell’attività cellulare in acqua, correlata al distaccamento del biofilm o a una ricrescita batterica in rete. Dal confronto è inoltre risultato che non c’è una correlazione diretta significativa tra le HPC e i dati citometrici, sebbene gli andamenti mensili siano simili, infatti sia i dati citometrici che le analisi in laboratorio evidenziano un peggioramento di qualità nei mesi estivi e un parziale miglioramento da fine estate. Nella seconda fase è emerso che la sonda riesce a riconoscere caratteristiche tipiche di diversi ceppi batterici solo se questi sono presenti in acqua a una concentrazione elevata. Non è stato trovato un modo efficace per identificare la presenza di E. coli in acqua di rete.
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2.1. Qualità microbiologica delle acque di rete... 3
2.2. Microorganismi indicatori di contaminazione... 8
2.2.1. Cenni alla normativa italiana ... 10
2.3. Citometria di flusso come metodo di monitoraggio ... 11
3 CASO DI STUDIO E OBIETTIVO DEL LAVORO ... 17
3.1. Obiettivo del lavoro ... 17
3.2. Area di studio ... 18
4 MATERIALI E METODI ... 21
4.1. BactoSense® ... 21
4.2. Fase 1: monitoraggio in campo ... 24
4.3. Fase 2: Validazione in laboratorio ... 26
4.4. Metodi di analisi dei parametri microbiologici in laboratorio ... 29
4.5. Trattamento dei dati ... 31
4.5.1. Analisi dei dati citometrici ... 31
4.5.2. Test statistici effettuati ... 35
5 RISULTATI E DISCUSSIONE ... 36
5.1. Fase 1: monitoraggio in campo ... 36
5.1.1. Sotto-periodi stagionali e raggruppamenti orari ... 36
5.1.3. Misure della sonda BactoSense® ... 42
5.1.4. Confronto tra analisi citometriche e monitoraggio convenzionale ... 51
5.2. Valutazioni della risposta della sonda BactoSense® a indicatori specifici ... 53
6 CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI ... 60
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Bouvier et al., 2007). ... 14 Figura 4.1 Fotografia BactoSense® interna ed esterna (Sigrist-Photometer AG). ... 22 Figura 4.2 Rappresentazione dei grafici BactoSense® che mettono in relazione FL1 e FL2 (a), FL1 e SSC (b) e l'istogramma di FL1 (c). ... 23 Figura 4.3 Rappresentazione della casetta e dei punti del modello di rete. ... 25 Figura 4.4 Boxplot giornaliero (a,c,e) e orario (b,d,f) di pressione (a,b), portata (c,d) e sforzo di taglio (e,f) forniti dal modello di rete nel punto 2 di figura 4.3. In rosso si evidenzia l’anomalia nel valore di sforzo di taglio del sabato, il picco di pressione delle 8:30 e i picchi di portata e sforzo di taglio delle 10:30. ... 26 Figura 4.5 Fingerprint dell'acqua MilliQ® (a) e dell'acqua sterile (b). ... 27 Figura 4.6 Fingerprint dell'acqua di rete dei quattro campioni prelevati in Fase 2. ... 27 Figura 4.7 Colonie di E. coli (a), enterococchi (b), P. aeruginosa (c) e coliformi totali (d). ... 30 Figura 4.8 Rappresentazione del GateTCC sul grafico FL1-FL2. ... 32 Figura 4.9 Grafico della densità di FL1 (a) e grafico FL1-SSC (b). ... 33 Figura 4.10 Grafico delle densità di FL1 nei mesi di maggio (a), giugno (b), luglio (c), agosto (d), settembre (e). ... 33 Figura 4.11 Fingerprint di acqua MilliQ® con rappresentazione di GateTCC. ... 34 Figura 4.12 Fingerprint di acqua MilliQ® addizionata con E. coli con rappresentazione di GateTCC (il trapezio) Gate70 (a) e Gate30 (b). ... 35 Figura 5.1 Andamento medio giornaliero della richiesta d’acqua per le diverse stagioni (adattata da Candalieri, 2017). Le linee continue rappresentano gli andamenti nei giorni lavorativi, quelle tratteggiate nei giorni festivi. Le linee rosse delimitano gli intervalli orari scelti per l’elaborazione dei dati raccolti in Fase 1. ... 37 Figura 5.2 Boxplot dei valori di THB a 22°C e THB a 37°C nei tre periodi (a) e negli orari (b) di campionamento. ... 40 Figura 5.3 Relazione tra i valori di THB a 22°C e THB a 37°C in funzione del tempo di incubazione. ... 42
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per gli intervalli orari (c,d). ... 45 Figura 5.6 Boxplot di TCC (a) e %HNA (b) nei diversi intervalli orari all’interno dei quattro periodi stagionali. ... 45 Figura 5.7 Valori di %HNA (a) e HNAC (b) in funzione di TCC. ... 49 Figura 5.8 Andamento di SSC_HNA e SSC_LNA. ... 51 Figura 5.9 Valori di TCC (a,b), %HNA (c,d) e HNAC (e,f) in funzione di THB con tempo di incubazione da protocollo (a,c,e) e di 7 giorni (b,d,f) con i rispettivi R2. ... 53 Figura 5.10 Fingerprint dell’acqua addizionata con E. faecalis (a), P. aeruginosa (b) e E.
coli per quattro diluizioni (da 1 a 4) riportate in Tabella 4.3. ... 54
Figura 5.11 Fingerprint di acqua MilliQ® addizionata con E. coli, con rapporto di diluizione 1:103 (a), 1:104 (b), 1:105 (c) e 1:106 (d). ... 55 Figura 5.12 Retta di calibrazione per E. coli in acqua microfiltrata su scala lineare (a) e logaritmica (b). ... 56 Figura 5.13- Retta di calibrazione per E. coli in acqua di rete su scala lineare. ... 57 Figura 5.14 Boxplot del rapporto tra la conta cellulare nel Gate70 e nel GateTCC. ... 58 Figura 5.15 Fingerprint autoctone dell'acqua con GateTCC (trapezio rosso) e Gate70 (contorni in nero). ... 59
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Tabella 2.3 Limiti legislativi (D. Lgs 31/2001 e s.m.i.)... 10 Tabella 3.1 Parametri medi ponderati dell'acqua di rete dell'area d'interesse per l’anno 2018 e 2019. ... 20 Tabella 3.2 Portata mensile (in m3) dei pozzi nell'area d'interesse... 20 Tabella 4.1 Specifiche tecniche BactoSense® (adattata da scheda tecnica SIGRIST). 22 Tabella 4.2 THB dei quattro campioni di acqua di rete prelevati in Fase 2. ... 28 Tabella 4.3 Numero di prove per ogni ceppo effettuate nella fase di laboratorio. ... 29 Tabella 4.4 Metodi, strumenti e prodotti utilizzati nelle conte batteriche in laboratorio. . 31 Tabella 5.1 Sotto-periodi della Fase 1, in relazione al prelievo di campioni per l’analisi di laboratorio e di operatività della sonda BactoSense®. ... 36 Tabella 5.2 Statistiche descrittive delle THB nei tre periodi stagionali (a) e nei quattro orari di campionamento (b). Valori di media, mediana, minimo e massimo e deviazione standard espressi in [UFC/ml], il coefficiente di variazione è adimensionale. ... 39 Tabella 5.3 Percentuale di superamento dei limiti normativi per THB 22°C e THB 37°C su n campioni raccolti nel corso della Fase 1. ... 40 Tabella 5.4 Valori di p-value nei tre periodi stagionali per THB 22 °C (a), THB 37°C (b), THB 22 °C dopo 7 giorni (c) e THB 37°C dopo 7 giorni (d). Vi è differenza significativa per p-value < 0,025 (celle in azzurro). ... 41 Tabella 5.5 Statistiche descrittive dei valori di TCC e di %HNA nei quattro periodi stagionali. Valori di media, mediana, minimo e massimo e deviazione standard espressi in [103 UFC/ml], il coefficiente di variazione è adimensionale. ... 44 Tabella 5.6 Valori di p-value nei quattro periodi stagionali per TCC (a) e %HNA (b. Vi è differenza significativa per p-value < 0,025 (celle in azzurro). ... 47 Tabella 5.7 Valori di p-value negli intervalli orari per TCC (a) e %HNA (b). Vi è differenza significativa per p-value < 0,025 (celle in azzurro). ... 47 Tabella 5.8 Valori di p-value nei quattro periodi suddivisi per intervallo orario per TCC (a) e %HNA (b). Vi è differenza significativa per p-value < 0,025 (celle in azzurro)... 48
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tra le THB (p-value del t test minori di 0,05 per tutte le combinazioni). ... 52 Tabella 5.11 Indici di correlazione di Pearson per verificare la correlazione tra le letture BactoSense® in acqua MilliQ® addizionata con E. coli e conte su piastra di E. coli nei medesimi campioni (p-value del t test < 0,05 per tutte le combinazioni) ... 56 Tabella 5.12 Indici di correlazione di Pearson per verificare la correlazione tra le letture BactoSense® in acqua di rete addizionata con E. coli e le conte su piastra di E. coli sui medesimi campioni (p-value del t test < 0,05 per le due combinazioni). ... 57
x FL1: Fluorescenza 1
FL2: Fluorescenza 2 FSC: Forward Scatter
GAC: Granular Activated Carbon HNA: High Nucleic Acid
HNAC: High Nucleic Acid Count HPC: Heterotrophic Plate Count LNA: Low Nucleic Acid
LNAC: Low Nucleic Acid Count
OMS: Organizzazione Mondiale della Sanità SSC: Side Scatter
SSC_LNA: SSC medio per la frazione LNA SSC_HNA: SSC medio per la frazione HNA TCC: Total Cell Count
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1 INTRODUZIONE
Il controllo della qualità microbiologica dell’acqua potabile nelle reti di distribuzione ha un’importanza fondamentale nella protezione della salute umana. Idealmente una volta che le acque sono immesse nella rete idrica non dovrebbero subire alcun cambiamento, tuttavia durante il trasporto la qualità dell’acqua può subire variazioni dovute a molteplici fattori, come ad esempio il materiale e lo stato delle tubature, le caratteristiche chimico-fisiche dell’acqua, il tipo di trattamento prima dell’immissione in rete e le condizioni ambientali esterne. Tali fattori e l’interazione tra di essi rendono la conoscenza della variazione di qualità poco prevedibile e poco controllabile. Attualmente il monitoraggio delle reti è basato sulla raccolta e successiva analisi in laboratorio di campioni d’acqua in punti strategici, con una frequenza dipendente dal volume d’acqua distribuito. L’analisi in laboratorio è finalizzata a ricercare la presenza di microorganismi indicatori di contaminazione patogena, per i quali sono fissati limiti di legge. Gli svantaggi di questo metodo consistono nel fatto che la presenza di indicatori può essere accertata solo dopo giorni dalla raccolta del campione, inoltre non sempre la loro assenza garantisce l’assenza di patogeni. Negli ultimi anni è nata quindi la necessità di implementare tecnologie che permettessero un monitoraggio continuo e veloce dell’acqua in rete, per avere un sistema a supporto della minimizzazione del rischio microbiologico. Tali sistemi di pre-allerta (o early-warning) hanno lo scopo di individuare la presenza di un rischio e permettere ai gestori di intervenire per tempo. In quest’ottica ha trovato applicazione l’utilizzo dei citometri di flusso come strumento per monitorare la presenza di cellule in acqua.
La presente tesi ha la finalità di indagare i pro e i contro dell’utilizzo di una sonda basata sulla citometria di flusso per il monitoraggio online della qualità microbiologica dell’acqua mediante il confronto con analisi di laboratorio (E
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psicrofila e mesofila). Nello specifico si sono analizzate le similitudini tra i dati forniti dalla sonda e gli indicatori microbiologici, per i quali sono fissati opportuni valori guida, e la capacità della sonda di identificare e quantificare la presenza in acqua di tali indicatori.
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2 STATO DELL’ARTE
Nel presente capitolo è trattato il problema della contaminazione microbiologica dell’acqua nelle reti di distribuzione e i metodi utilizzati per monitorare la qualità microbiologica dell’acqua di rete. Infine, sono descritti brevemente i principi della citometria di flusso e la sua applicabilità nel monitorare la qualità microbiologica dell’acqua potabile.
2.1. Qualità microbiologica delle acque di rete
Dal punto di vista microbiologico, la qualità dell’acqua è determinata dalla presenza di microorganismi a una concentrazione tale da rappresentare un pericolo per la salute umana. L’acqua potabile contiene normalmente batteri che non costituiscono un pericolo, il rischio nasce quando alcuni di essi trovano le condizioni per moltiplicarsi in maniera incontrollata o quando l’acqua potabile entra in contatto con una sorgente di contaminazione. La presenza di microorganismi patogeni costituisce il rischio più comune e diffuso associato all’acqua potabile (OMS, 2011). I microorganismi patogeni che possono essere trasmessi attraverso l'acqua potabile contaminata sono innumerevoli, diversi per caratteristiche, comportamento e resistenza.
I maggiori rischi microbiologici sono associati all'ingestione di acqua contaminata da feci di esseri umani o animali, che possono contenere batteri patogeni, virus, protozoi ed elminti. Esistono anche rischi associati a microorganismi patogeni non fecali, che si possono trovare naturalmente nell’ambiente acquatico o che crescono sulle superfici a contatto con l’acqua (es.: Legionella spp., Pseudomonas
aeruginosa) (Ashbolt, 2004). In Tabella 2.1 sono elencate informazioni generali
sugli agenti patogeni rilevanti per la gestione dell’approvvigionamento di acqua potabile (OMS, 2011).
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Tabella 2.1 Patogeni trasmettibili attraverso l'acqua potabile (adattata da OMS, 2011).
Per rendere l’acqua potabile priva di rischio e per prevenire la contaminazione microbiologica o per ridurla a livelli non dannosi per la salute, si devono adottare misure basate su un approccio multi-barriera, che includono la protezione delle risorse idriche, la corretta selezione e funzionamento di una serie di fasi di trattamento e un’adeguata gestione dei sistemi di distribuzione. È inoltre necessario
Patogeno Impatto sulla salutea Permanenza in acquab Resistenza al cloroc Infettività
relativad Fonte animale Batteri
Burkholderia pseudomallei Alto Può moltiplicarsi Bassa Bassa No
Campylobacter jejuni, C. Alto Moderata Bassa Moderata Sì
E. Coli - Patogeno Alto Moderata Bassa Bassa Sì
E. coli – Enteromorragico Alto Moderata Bassa Alta Sì
Francisella tularensis Alto Lunga Moderata Alta Sì
Legionella spp. Alto Può moltiplicarsi Bassa Moderata No
Leptospira Alto Lunga Bassa Alta Sì
Mycobacteria Basso Può moltiplicarsi Alta Bassa No
Salmonella Typhi Alto Moderata Bassa Bassa No
Altre salmonella Alto Può moltiplicarsi Bassa Bassa Sì
Shigella spp. Alto Corta Bassa Alta No
Vibrio cholerae Alto Da corta a lunga Bassa Bassa No
Virus
Adenovirus Moderato Lunga Moderata Alta No
Astrovirus Moderato Lunga Moderata Alta No
Enterovirus Alto Lunga Moderata Alta No
Virus epatite A Alto Lunga Moderata Alta No
Virus epatite E Alto Lunga Moderata Alta Potenziale Norovirus Alto Lunga Moderata Alta Potenziale
Rotaviruses Alto Lunga Moderata Alta No
Sapovirus Alto Lunga Moderata Alta Potenziale
Protozoi
Acanthamoeba spp. Alto Può moltiplicarsi Alta Alta No
Cryptosporidium hominis/
parvum Alto Lunga Alta Alta Sì
Cyclospora cayetanensis Alto Lunga Alta Alta No
Entamoeba histolytica Alto Moderata Alta Alta No
Giardia intestinalis Alto Moderata Alta Alta Sì
Naegleria fowleri Alto Può moltiplicarsi Alta Moderata No
Elminiti
Dracunculus medinensis Alto Moderata Moderata Alta No
Schistosoma spp. Alto Corta Moderata Alta Sì
a L'impatto sulla salute si riferisce all'incidenza e alla gravità della malattia, inclusa l'associazione con epidemie
b Permanenza dello stadio infettivo in acqua a 20°C: breve, fino a 1 settimana; moderata, da 1 settimana a 1 mese; lunga, oltre 1 mese c Bassa significa inattivazione del 99% a 20 ° C generalmente in <1 min, moderato 1–30 min e alto > 30 min.
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un piano di controllo attivo in tutte le fasi, dalla captazione alla distribuzione. La protezione delle risorse idriche e la corretta gestione di un piano di captazione costituiscono la prima barriera. In alcuni casi le acque sotterranee provenienti da falde acquifere confinate non hanno bisogno di trattamenti (OMS, 2011). Nella maggior parte dei casi, tuttavia, sono necessari trattamenti specifici per inattivare o rimuovere i microrganismi patogeni. Il processo di disinfezione è specificatamente utilizzato per inattivare i microorganismi patogeni, in genere è un passaggio fondamentale nella produzione di acqua potabile; si può avere sia una disinfezione principale, sia una disinfezione di copertura, per mantenere la qualità dell’acqua nella rete di distribuzione (OMS, 2011). I principali disinfettanti utilizzati in disinfezione principale sono i cloro-derivati (cloro gas, ipoclorito di sodio e ipoclorito di calcio), il biossido di cloro, l’ozono e la radiazione UV. La disinfezione di copertura necessita di disinfettanti persistenti, come i cloro-derivati o il biossido di cloro. La scelta del disinfettante più appropriato e la dose dipendono dagli obiettivi di qualità, dal rischio di formazione di sottoprodotti e dall’interazione del disinfettante con i materiali delle tubature (Gagnon et al., 2006).
A seguito dei trattamenti la qualità delle acque immesse in rete non dovrebbe subire alcuna variazione, ma diversi studi dimostrano che un suo deterioramento è inevitabile a causa di molteplici fattori interconnessi tra di loro, oltre che difficilmente prevedibili e controllabili (Controllo et al., 2000). In uno studio americano è stato stimato che le carenze nei sistemi di distribuzione o nell’impianto idraulico sono causa del 18% delle epidemie diffuse tramite acqua potabile dal 1971 al 2006 (Craun et al., 2010).
La presenza indesiderata di batteri nell’acqua di rete è dovuta a due problematiche principali: la prima è legata a guasti meccanici, come ad esempio crepe nelle tubature che permettono l’intrusione di materiale contaminato, la seconda problematica racchiude tutte le condizioni interne che favoriscono la crescita di batteri (Momba et al., 2000). Tale crescita può dipendere dal fatto che alcuni batteri
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sopravvivono alla disinfezione e, se le condizioni lo permettono, proliferano in acqua, oppure dal fatto che alcuni batteri, in determinate condizioni, sono in grado di riparare i danni subiti e moltiplicarsi. Inoltre l’interfaccia tra l’acqua e la parete del tubo è un sito privilegiato per l’accumulo di cellule e materia organica e per la moltiplicazione batterica (Batté et al., 2003), che determinano la formazione di biofilm. Il biofilm rappresenta un ecosistema protetto nel quale i batteri crescono in maniera incontrollata e nel quale si instaurano condizioni favorevoli di crescita anche per batteri potenzialmente patogeni (Legionella spp., Pseudomonas,
Salmonella typhimurium), batteri fecali (coliformi e Escherichia coli) e in alcuni casi
anche per funghi e alghe (Momba et al., 2000). Le condizioni che favoriscono la formazione di biofilm dipendono dalle caratteristiche chimico-fisiche dell’acqua, come la temperatura e il contenuto di sostanza organica biodegradabile, dal tipo di disinfettante usato e dal materiale di cui sono costituite le tubature (Momba et al., 2000). In particolare, dalla scabrezza e bagnabilità del materiale dipende l’efficienza di adesione, inoltre alcuni materiali potrebbero rilasciare materiale organico, che influenza la formazione di biofilm. Infine più un materiale è soggetto a corrosione più si creano siti protetti in cui i batteri proliferano al sicuro dall’azione del disinfettante (Batté et al., 2003; Hyun-Jung et al., 2011). I risultati di uno studio svolto su diversi materiali dimostrano che la plastica supporta meno biomassa rispetto al cemento o ai materiali ferrosi, e che quest’ultimi, essendo più soggetti a corrosione, favoriscono lo sviluppo di biofilm (Niquette et al., 2000). Oltre che dal tipo di materiale, la corrosione dipende dall’aggressività dell’acqua che a sua volta dipende dalle sue caratteristiche chimiche e dal tipo di disinfettante di copertura usato. Il biofilm che si forma sulle pareti è stabile e si rimuove difficilmente, tuttavia è soggetto a erosione e sgretolamento, a causa del cambiamento nelle condizioni idrodinamiche della rete o dei cambiamenti nel tipo di disinfettante, che portano al trasporto di un’eccessiva quantità di batteri nell’acqua (Momba et al., 2000).
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Un’ultima problematica legata alla qualità dell’acqua in rete è la possibile contaminazione nel punto di consegna, che può essere residenziale, industriale o agricolo. Infatti, spesso l’acqua viene trasferita all’interno delle proprietà e conservata in serbatoi, dai quali si potrebbe verificare un potenziale flusso di ritorno nella rete, dovuto ad esempio a un calo di pressione causato da un calo nella richiesta idrica. Un evento di questo tipo causa un rischio sanitario nel caso in cui l’acqua, prima del ritorno in rete, entra in contatto con una fonte di contaminazione. (Ainsworth, 2013).
Uno studio effettuato nel 2017 da Moreira et al. sulle epidemie causate dalla contaminazione dell’acqua potabile in Europa, Nord America e Nuova Zelanda, dal 2000 al 2014, ha identificato che dei 68 eventi registrati 26 sono dovuti a contaminazione nelle reti di distribuzione. La contaminazione dell'acqua potabile avvenuta nei punti di consegna ha causato più eventi, mentre l’infiltrazione di acque reflue o liquami industriali ha causato il maggior numero di casi di malattia. Altre cause sono dovute alla rottura delle tubature e a contaminazione avvenuta durante la manutenzione delle reti. Gli agenti patogeni causa di più epidemie sono stati norovirus, Cryptosporidium e Campylobacter, mentre E. coli, Giardia e Salmonella hanno causato un’epidemia ciascuno. Norovirus e Campylobacter sono gli agenti che hanno causato più casi di malattia. Nel caso in cui tra gli agenti coinvolti vi fosse
E. coli, la causa di contaminazione era legata all’infiltrazione di acque reflue.
Data la complessità dei fattori che determinano la variazione di qualità nelle acque di rete, le azioni preventive adottate per evitare contaminazione non sono sempre efficaci, diventa quindi fondamentale avere un sistema di monitoraggio efficiente per garantire la qualità al consumatore.
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2.2. Microorganismi indicatori di contaminazione
Ad oggi il monitoraggio della qualità delle acque in rete si basa principalmente sulla ricerca di microorganismi indicatori di contaminazione in campioni prelevati in punti strategici. L’ipotesi alla base è che la presenza degli indicatori nell’acqua sia indice dell’eventuale contemporanea presenza di patogeni. Alcuni degli indicatori di inquinamento più utilizzati nel monitoraggio sono riassunti in Tabella 2.2 (OMS, 2011). Ognuno degli indicatori è indice di un diverso problema, perciò è utile nel monitoraggio verificare la presenza contemporanea di più indicatori.
Gli indicatori di contaminazione fecale più utilizzati sono enterococchi, E. coli e alcuni batteriofagi, ovvero virus che utilizzano solo i batteri come ospite.
Un buon indicatore di qualità microbiologica dell’acqua è il conteggio delle colonie su agar (HPC, Hetrotrophic Plate Count), che identifica la presenza di batteri eterotrofi (THB, Total Heterotrophic Bacteria). La popolazione ritrovata tramite HPC si differenzia a seconda del metodo utilizzato per la conta. Infatti, sebbene ci siano metodi standard, non esiste un metodo universale per la determinazione della HPC, ma la temperatura di incubazione può variare dai 20°C ai 37°C, il tempo da qualche ora a 7 giorni, inoltre la crescita dipende dal tipo di agar utilizzato. Sebbene non esistano evidenze che dimostrino che i risultati ottenuti dalla determinazione dell’HPC siano correlati con i rischi per la salute, i livelli di THB possono essere utilizzati per valutare la crescita microbica sui materiali utilizzati nei sistemi di distribuzione dell'acqua e per misurare la ricrescita batterica nell’acqua distribuita (Carter et al., 2000; Iss, 2001). Le HPC possono quindi dare indicazioni sui cambiamenti della qualità durante lo stoccaggio e durante la distribuzione. Le linee guida dell’OMS del 1996 per la qualità dell’acqua potabile elencano i THB come un indicatore del contenuto batterico generale dell’acqua a temperature di incubazione di 22°C e 37°C. L’uso di temperature diverse permette di mettere in evidenza microrganismi mesofili (a 37°C) e psicrofili (a 22°C). In uno studio del 2004 è stato
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inoltre dimostrato che temperature d’incubazione minori e tempi di incubazione maggiori portano a conte più alte (Reasoner, 2004). In particolare, i risultati delle conte a 22°C sono descritti come di scarso valore sanitario, ma sono una buona indicazione della pulizia e integrità del sistema di distribuzione, un aumento dei batteri a 37°C può essere un primo segno di inquinamento, soprattutto se non è accompagnato da un aumento simile nei THB a 22°C. Misurazioni elevate possono verificarsi durante un evento di contaminazione, anche se in questa situazione gli indicatori fecali, come E. coli, sono indicatori migliori della recente contaminazione, poiché non sono in grado di crescere nel sistema (Bartram, 2003).
Tabella 2.2 Indicatori di inquinamento (adattata da OMS, 2011).
Un altro utile indicatore alternativo è P. aerugionosa. Questo microorganismo può causare infezioni, ma raramente causa gravi malattie in soggetti sani (OMS, 2012). È sensibile alla disinfezione, ma ha la capacità di persistere in ambienti acquatici e può moltiplicarsi sulle superfici di materiali idonei a contatto con l’acqua. Questa capacità è associata alla formazione di biofilm e rende P. aerugionosa un indicatore del distacco di biofilm (Mann et al., 2012).
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L’utilizzo dei batteri indicatori presenta tuttavia diversi limiti. Per prima cosa è bene sottolineare che l’utilizzo di indicatori non è un metodo diretto per la quantificazione di patogeni, ma permette una valutazione sulla probabilità di presenza (Briancesco, 2005), fornendo quindi indicazioni solo qualitative. Inoltre l’assenza di un indicatore non riflette l’assenza di una minaccia per la salute umana, infatti non garantisce l’assenza di altri batteri o virus con strategie di sopravvivenza diverse (Gunnarsdottir et al., 2020). Un altro dei limiti principali dell’utilizzo degli indicatori, è che l’identificazione tramite conta può avvenire solo dopo giorni dal prelievo (24 h per
E. coli, 48 h per enterococchi e dai 2 ai 7 giorni per THB), dando quindi informazioni
retrospettive e tardive. Con il metodo di conta su piastra inoltre possono crescere solo i batteri coltivabili, che rappresentano solo una piccola percentuale di tutti quelli presenti in acqua (si stima circa l’1%) (Safford et al., 2019).
2.2.1. Cenni alla normativa italiana
In Italia la qualità delle acque destinate al consumo umano è disciplinata dal D. Lgs. 31/2001 e s.m.i.. In Tabella 2.3 sono riportati i limiti legislativi per la presenza di indicatori in acqua potabile.
Tabella 2.3 Limiti legislativi (D. Lgs 31/2001 e s.m.i.).
Parametro Valore E. Coli 0/100 ml Enterococchi 0/100 ml Parametro Valore Enterococchi 0/250 ml P. aeruginosa 0/250 ml THB 22°C 100/ml THB 37°C 20/ml
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La normativa impone inoltre che vadano fatti controlli di routine sul conteggio delle colonie a 22 °C, e che queste non debbano presentare variazioni anomale. Per garantire la qualità dell’acqua al consumatore il decreto impone che per le acque fornite attraverso una rete di distribuzione i requisiti minimi debbano essere rispettati “nel punto di consegna ovvero, ove sconsigliabile per difficoltà tecniche o pericolo di inquinamento del campione, in un punto prossimo della rete di distribuzione rappresentativo e nel punto in cui queste fuoriescono dai rubinetti utilizzati per il consumo umano” (Art. 5, comma 1).
La modifica del 2017 delinea inoltre indicazioni per il programma di controllo, specificando che questo debba “verificare che le misure previste per contenere i rischi per la salute umana, in tutta la filiera idro-potabile, siano efficaci e che le acque siano salubri e pulite nel punto in cui i valori devono essere rispettati, […] individuare le misure più adeguate a mitigare i rischi per la salute umana” (Parte A, comma 1). Inoltre, impone che i programmi di controllo consistano o in prelievo e analisi di campioni discreti delle acque; oppure misurazioni acquisite attraverso un processo di controllo continuo (Parte A, comma 2).
2.3. Citometria di flusso come metodo di monitoraggio
A causa dell’impossibilità di prevedere ciò che succede nelle reti di distribuzione e dei limiti del monitoraggio tramite indicatori, è necessario un sistema di monitoraggio in grado di fornire un’immagine in tempo reale dell’aumento di batteri in acqua. Per cercare di implementare tale sistema negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi alternativi per il monitoraggio della presenza microbica in acqua. Mentre i metodi attualmente utilizzati si basano sulla crescita batterica i nuovi metodi misurano direttamente il DNA, l’RNA o le proprietà immunologiche della cellula (Noble et al., 2010).
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Una delle metodologie che ha trovato più applicazione in questo campo è la citometria di flusso.
La citometria di flusso (FCM) è una tecnica di laboratorio ad alto rendimento per l’analisi delle caratteristiche ottiche delle cellule (Koch et al., 2014). In Figura 2.1 sono rappresentati i componenti base di un citometro di flusso. In breve, lo strumento preleva il campione d’acqua e lo sospinge in una camera di messa a fuoco che forza le particelle sospese ad allinearsi, in tale camera ogni cellula viene attraversata da una fonte di luce (in genere laser) e interagisce con essa. I rilevatori leggono la misura in cui ciascuna particella disperde la luce nelle direzioni anteriore (FSC) e laterale (SSC) e inviano queste misurazioni a un computer per la visualizzazione e l'elaborazione. In generale, i segnali di FSC sono correlati alla dimensione delle cellule, mentre i segnali SSC sono correlati alla complessità e granularità delle cellule (Safford et al., 2019). Inoltre in uno studio effettuato su analisi citometriche di campioni provenienti da diversi sistemi acquatici, si ipotizza che i cambiamenti nella composizione batterica possano potenzialmente avere un forte impatto sul SSC medio (Bouvier et al., 2007). Il citometro rileva inoltre la fluorescenza emessa da ogni cellula, che si verifica quando alcune molecole emettono luce in seguito all'eccitazione di un raggio luminoso di una lunghezza d'onda compatibile. L’autofluorescenza della cellula da sola non è sufficiente per distinguere popolazioni specifiche di batteri ed esaminare parametri di interesse, è quindi pratica standard miscelare l’acqua con uno o più fluorocromi che si legano ad alcune componenti della cellula (Safford et al., 2019). Esistono diversi tipi di fluorocromi che evidenziano funzioni cellulari diverse, a seconda di quale componente cellulare marcano. In genere un fluorocromo è in grado di produrre più di una fluorescenza (FL1, FL2). Per quantificare il numero di cellule totali (TCC) si usano in genere marcatori che si legano agli acidi nucleici, unicamente presenti negli esseri viventi. Tra i fluorocromi tipici impiegati per l’identificazione delle cellule totali si citano l’arancio di acridina e il SYBR-Green I (Safford et al., 2019). Il numero
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di cellule identificate rappresenta sia quelle vive che quelle morte, attive e non attive, danneggiate e sane.
Figura 2.1 Schema di un citometro di flusso (adattata da Safford et al., 2019).
L’analisi dei dati della citometria è fondamentale e spesso difficile, l’obiettivo dell'analisi dei dati è quantificare le celle vive e identificare quelle d’interesse. Questo metodo di identificazione è chiamato gating, un gate può essere definito come un insieme di punti accuratamente selezionati che determina un’area su un grafico, in genere si utilizzano i grafici che mettono in relazione due fluorescenze o che mettono in relazione una fluorescenza con il SSC. Diverse regioni possono essere definite sullo stesso grafico (Baran et al., 2017).
Uno dei risultati più interessanti emersi dagli studi citometrici è che le cellule tendono a raggrupparsi in frazioni distinte in base alle differenze nella fluorescenza (correlata al contenuto di acido nucleico) e nel segnale di dispersione della luce (SSC), con almeno due grandi frazioni: cellule con alto contenuto di acido nucleico (HNA) e cellule con basso contenuto di acido nucleico (LNA) (Bouvier et al., 2007). La relazione e le interazioni che esistono tra questi due raggruppamenti non sono ancora chiare. Uno studio effettuato nel 2007 da Bouvier suggerisce uno scenario in cui, sebbene ogni frazione abbia una struttura e caratteristiche proprie, esista un legame dinamico tra le due frazioni. In particolare conclude che questo
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collegamento non sia unidirezionale, ma operi attraverso l’attivazione e l’inattivazione, la crescita, il danno e la morte cellulare (Figura 2.2) (Bouvier et al., 2007).
Figura 2.2 Rappresentazione delle dinamiche esistenti tra HNA e LNA (adattata da Bouvier et al., 2007).
In diversi studi è riportato che i batteri HNA tendono a crescere in un ambiente eutrofico, mentre i batteri LNA in ambienti oligotrofici (River et al., 2016). In uno studio effettuato nel 2016 sulla variazione di HNA e LNA in campioni d’acqua di un fiume, è risultato che i principali fattori che influiscono sulla crescita delle due fazioni sono la salinità, la temperatura, la conducibilità, il fosforo totale e i solidi sospesi totali (River et al., 2016). Nello stesso studio è stata inoltre analizzato il SSC e in particolare la differenza tra il SSC medio delle due fazioni (SSC_HNA e SSC_LNA). È risultato che SSC_HNA è sempre maggiore di SSC_LNA, e gli autori ipotizzano che la variazione dei valori di SSC e di FL1 possa essere collegata alla sensibilità alle variazioni ambientali (River et al., 2016).
Diversi studi effettuati sul monitoraggio della qualità microbiologica con FCM hanno dimostrato la sua validità nel rilevare cambiamenti nelle comunità microbiologiche, che difficilmente sarebbero rilevabili in altri modi (Safford et al., 2019).
In uno studio effettuato nel 2013 sul monitoraggio dei cambiamenti microbiologici in acqua potabile, è stato dimostrato come le analisi citometriche, in aggiunta ai metodi tradizionali, siano essenziali per una quantificazione affidabile dei batteri e per il rilevamento dei cambiamenti nelle comunità batteriche. In particolare ha evidenziato
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come la TCC è in grado di individuare piccoli cambiamenti nella qualità dell’acqua di rete, come la crescita batterica dovuta al ristagno, la contaminazione, la miscelazione di due tipi d’acqua diversi (Prest et al., 2013). Uno studio del 2013 inoltre dimostra come la TCC possa essere utilizzata per rilevare piccoli cambiamenti nella biomassa e come il valore di TCC cambi significativamente al variare della temperatura, in particolare si osservano valori molto più alti per temperature superiori ai 15°C (Liu et al., 2013).
Uno studio effettuato nel 2019 su un monitoraggio annuale delle comunità batteriche in un sistema di distribuzione mediante FCM ha evidenziato la relazione tra TCC e percentuale di HNAC (%HNA) rispetto alla stagione, al tempo di residenza dell’acqua in rete e all’area di contatto tra acqua e biofilm (determinata calcolando la frazione tra superficie laterale dei tubi e volume d’acqua). Lo studio ha osservato che si verifica un aumento di TCC simultaneo a un calo di %HNA nel periodo estivo e con l’aumento del tempo di residenza e dell’area di contatto. Si suppone che tali comportamenti siano dovuti alla crescita batterica favorita dalle temperature estive maggiori e alle interazioni tra acqua e biofilm. In particolare, poiché aumentando il tempo di residenza e l’area di contatto si accresce la probabilità di sviluppo di biofilm e di conseguente distacco, l’aumento di TCC concomitante al calo di %HNA può essere considerato indicatore dello sviluppo di biofilm. Infatti gli autori ipotizzano che i batteri che fanno parte della fazione HNA provengono da crescita batterica mentre quelli della fazione LNA da distacco di biofilm (Schleich et al., 2019).
Nell’ambito del monitoraggio della qualità delle acque potabili la FCM è spesso comparata con le HPC. Uno studio effettuato nel 2013 sulla valutazione della FCM come parametro per valutare l’attività microbiologica nei sistemi di distribuzione di acqua potabile, ha dimostrato che sebbene non via sia una correlazione diretta tra HPC e TCC, è utile includere la TCC nei sistemi di monitoraggio per valutare la qualità microbiologica e la stabilità dell’acqua potabile distribuita (Liu et al., 2013).
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Ci sono invece pochissimi studi che hanno cercato di identificare attraverso i citometri la presenza di patogeni nell’acqua. Il problema maggiore è che i fluorocromi finora conosciuti marcano differenti componenti cellulari, ma non sono in grado di legarsi a un solo ceppo batterico. Inoltre spesso la concentrazione in cui sono presenti i patogeni nell’acqua è inferiore ai limiti di rilevazione dei citometri (in genere intorno ai 100 UFC/ml) (Safford et al., 2019).
In conclusione, i principali vantaggi della FCM sono che l'analisi è veloce, accurata, sensibile e compatibile con una varietà di metodi di marcatura che forniscono ampie informazioni a livello di singola cellula (Hammes et al., 2010). In particolare la TCC rispetto alle HPC ha il vantaggio di essere più veloce e di contare tutte le cellule, a dispetto della coltivabilità (Hammes et al., 2008). La variazione di %HNA può essere inoltre interpretata come indice di crescita batterica e distacco di biofilm. Tra gli svantaggi invece c’è il fatto che essendo un metodo che identifica la singola cellula, non è l’ideale per l’analisi di agglomerati di particelle, come il biofilm. Un altro problema della FCM è la mancanza di una metodologia standard, infatti, l’utilizzo di marcatori diversi e una diversa strategia di gating, può portare a risultati diversi. Diverse marche di strumenti danno risultati diversi, così come le variazioni nelle caratteristiche dell’acqua, il tipo di cellule bersaglio e il metodo di marcatura (Hammes et al., 2010). Infine la mancanza di correlazione finora trovata tra i dati citometrici e le HPC rende l’utilizzo della citometria limitato, in quanto i risultati non sono correlabili con i limiti di legge o valori standard finora conosciuti.
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3 CASO DI STUDIO E OBIETTIVO DEL LAVORO
Nella sezione 3.1. è spiegato l’obiettivo del lavoro, mentre la sezione 3.2 fornisce una breve descrizione del contesto geografico e idraulico dell’area di studio.
3.1. Obiettivo del lavoro
Il presente lavoro di tesi è il risultato di una collaborazione tra il Dipartimento di Ingegneria Civile e Ambientale del Politecnico di Milano e la Società CAP Holding S.p.A..
L’obiettivo è la valutazione della funzionalità della citometria di flusso per il monitoraggio online della qualità microbiologica delle acque potabili, come supporto alla gestione della rete di distribuzione.
Per raggiungere tale obiettivo l’attività è stata strutturata in due fasi.
Scopo della prima fase è stato quello di valutare la funzionalità della sonda in campo, in particolare di osservare le dinamiche di variazione della qualità microbiologica dell’acqua in rete e di valutare l’uso della citometria di flusso come variabile proxy per le tendenze delle conte batteriche e per il rispetto dei limiti di legge. Per raggiungere tale obiettivo è stata condotta una campagna di monitoraggio di 5 mesi, installando una sonda, avente la citometria di flusso come principio di misura, in un punto della rete di distribuzione di un comune italiano (sezione 3.2). Nello specifico è stata utilizzata la sonda BactoSense® (SIGRIST-PHOTOMETER AG). I dati di monitoraggio raccolti sull’acqua di rete sono stati confrontati con le analisi microbiologiche di laboratorio effettuate su campioni prelevati in corrispondenza del punto di installazione della sonda. In particolare, le analisi microbiologiche sono consistite in: E. coli, enterococchi, P. aeruginosa, coliformi totali, carica batterica totale eterotrofa (THB) psicrofila (22°C) e mesofila (37°C). I campioni sono anche stati caratterizzati misurando pH e conducibilità.
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La seconda fase si è svolta in laboratorio, con lo scopo di valutare la risposta della sonda ad alcuni indicatori specifici. Per raggiungere tale obiettivo sono state preparate soluzioni di acqua microfiltrata con l’aggiunta di ceppi puri di E. coli,
Enterococcus faecalis e P. aeruginosa, e di acqua di rete con l’aggiunta di E. coli.
Le letture BactoSense® sono state quindi analizzate per accertare le differenze tra i diversi ceppi batterici e per identificare una relazione tra la conta su piastra di E.
coli e i risultati della sonda.
3.2. Area di studio
La sonda BactoSense® è stata installata in un comune italiano di circa 27.000 abitanti, all’interno di un’area metropolitana, caratterizzata da diverse attività agricole e industriali. Tutti i dati sulla rete e sulla qualità dell’acqua nell’area d’interesse sono stati forniti da Gruppo CAP. L’acqua immessa nella rete oggetto di studio proviene da tre pozzi che captano acqua da falda profonda (oltre 100 m). L’acqua di falda è naturalmente protetta e in genere di buona qualità, tuttavia possono essere presenti contaminanti tipici di un’area urbanizzata e industrializzata. In particolare, gli inquinanti rilevati nel 2018 e 2019 sono: solventi clorurati e composti organoalogenati (come tricloro, trifluoroetano, metilcloroformio, tetracloroetilene, cloroformio, bromoformio e tricloroetilene), pesticidi, erbicidi, fertilizzanti e il nitrato. Per garantire la qualità dell’acqua ci sono due impianti di potabilizzazione: uno alimentato da un solo pozzo di captazione, l’acqua è trattata con filtri a carbone attivo granulare (GAC) e in seguito disinfettata con radiazione UV; l’altro è alimentato dagli altri due pozzi e l’acqua è trattata da un dissabbiatore statico e con filtri GAC. In Tabella 3.1 sono riportati i valori medi annuali dei parametri chimici, fisici e biologici dell’acqua nella rete di distribuzione dell’area di studio.
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La rete di distribuzione si estende per 36,5 km, fornisce 1494 utenze, ed eroga in media circa 2·106 m3 d’acqua all’anno. L’acquedotto è caratterizzato da una dorsale principale dalla quale si diramano tubazioni secondarie, è strutturato a livello sovra-comunale mediante interconnessione con gli acquedotti di due città limitrofe. Il materiale delle tubature è per il 90% acciaio, mentre il restante 10% è costituito da ghisa, PEAD e fibrocemento. Gli impianti di potabilizzazione sono dotati di automazione locale che consente la modulazione della portata trattata in funzione dei consumi (il consumo pro-capite giornaliero è di 208 l). In questo modo e possibile evitare l’accumulo in serbatoi. In Tabella 3.2 è riportata la portata mensile dei pozzi descritti.
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Tabella 3.1 Parametri medi ponderati dell'acqua di rete dell'area d'interesse per l’anno 2018 e 2019.
Tabella 3.2 Portata mensile (in m3) dei pozzi nell'area d'interesse.
Parametri Limiti DL 31/01 Area di studio
pH 6,5 - 9,5 7,47 Conducibilità [µS/cm] 2500 620 Residuo secco a 180 °C [mg/l] 1500 448 Durezza totale [°f] 50 31 Bicarbonato (HCO3) [mg/l] - 323 Calcio (Ca) [mg/l] - 97 Magnesio (Mg) [mg/l] - 16 Sodio (Na) [mg/l] 200 12 Potassio (K) [mg/l] - 2 Cloruro (Cl) [mg/l] 250 29 Floruro (F) [mg/l] 1,5 < 0,3 Nitrato (NO3) [mg/l] 50 41 Solfato (SO4) [mg/l] 250 43 Ammonio (NH4) [mg/l] 0,5 < 0,1 Nitrito (NO2) [mg/l] 0,5 < 0,02 Arsenico (As) [µg/l] 10 < 1 Cromo (Cr) [µg/l] 50 < 5 Manganese (Mn) [µg/l] 50 < 5 Microinquinanto tot [µg/l] 0,5 < 0,02
Solventi clorurati tot [µg/l 30 3
Tricloro + Tetracloroetilene [µg/l] 10 2
E. coli [UFC/100ml] 0 0
Enterococchi [UFC/100ml] 0 0
Coliformi a 37 °C [UFC/100ml] 0 0
Impianto Gennaio Febbraio Marzo Aprile Maggio Giugno Luglio Agosto Settembre Ottobre Novembre Dicembre
1 - Pozzo 1 18180 17202 19262 18696 21911 21796 21670 21233 21310 22038 21324 7221
2 - Pozzo 1 49565 44508 47806 44481 15130 6960 7931 7854 7491 7946 7919 2864
2 - Pozzo 2 28709 25642 30070 26011 22258 23252 23171 20704 25161 28548 29714 10950
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MATERIALI E METODI
La sperimentazione è stata strutturata in due fasi: la prima è stata svolta in campo, monitorando attraverso la sonda BactoSense® l’attività cellulare dell’acqua di rete; la seconda in laboratorio, validando la risposta della sonda a tre indicatori, che sono
E. coli, E. faecalis e P. aeruginosa.
Nella sezione 4.1 del presente capitolo si descrive brevemente la sonda BactoSense® e la sua funzionalità. Nelle sezioni 4.2 e 4.3 sono presentate le modalità e le analisi svolte rispettivamente nella fase in campo e nella fase in laboratorio. Nella sezione 4.4 sono descritti i metodi di analisi dei parametri microbiologici e sono elencati i materiali e i prodotti utilizzati in laboratorio durante le due fasi sperimentali. Nella sezione 4.5 è descritta la metodologia di trattamento dei dati.
4.1. BactoSense®
BactoSense®, sonda sviluppata dall’azienda SIGRIST-PHOTOMETER AG, è un citometro di flusso automatico per il monitoraggio microbiologico dell’acqua potabile, che fornisce risultati dopo 30 minuti dalla raccolta del campione.
Come illustrato in Figura 4.1, la sonda contiene un dispositivo per la raccolta e la preparazione del campione, il citometro di flusso, lo strumento di lettura del segnale e una cartuccia contenente i reagenti, un liquido di pulizia e una cartuccia per la raccolta degli scarti. Una volta raccolto il campione, viene aggiunto il marcatore SYBR Green I, il tutto è miscelato e incubato per 10 minuti a 37 °C. Il campione è quindi inviato al citometro, infine la sonda viene pulita e gli scarti vengono raccolti nella cartuccia.
Nel dettaglio del citometro, la sorgente luminosa è costituita da un laser diode che emette una lunghezza d’onda di 488 nm. Le fluorescenze emesse lette dal sistema di rilevamento sono due: la prima, FL1, legge le lunghezze d’onda comprese tra 45
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e 525 nm, la seconda, FL2, legge le lunghezze d’onda superiori a 715 nm. Il sistema di rilevazione comprende anche la lettura della SSC, per lunghezze d’onda comprese tra 10 e 488 nm. Quindi per ogni cellula la sonda fornisce tre valori: FL1, FL2 e SSC.
In Tabella 4.1 sono riportate le condizioni d’esercizio della sonda e i limiti tecnici dello strumento.
Figura 4.1 Fotografia BactoSense® interna ed esterna (Sigrist-Photometer AG).
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BactoSense® è inoltre dotato di un display per la visualizzazione dei risultati e per regolare le impostazioni iniziali. I risultati possono essere inoltre trasmessi in forma analogica o digitale, tramite interfaccia web per il controllo remoto via Ethernet, o tramite USB.
La raccolta del campione può avvenire sia in maniera manuale che automatica, permettendo di avere analisi con un intervallo minimo di 30 minuti e un massimo di 6 ore. Una volta terminata l’analisi i dati citometrici sono rappresentati visivamente sul display attraverso tre tipi di grafici, rappresentati in Figura 4.2:
• grafico che mette in relazione le due fluorescenze, che rappresenta il fingerprint dell’acqua,
• grafico che mette in relazione la prima fluorescenza con la SSC,
• grafico che rappresenta la densità di FL1, che evidenzia i due raggruppamenti HNA e LNA.
Figura 4.2 Rappresentazione dei grafici BactoSense® che mettono in relazione FL1 e FL2 (a), FL1 e SSC (b) e l'istogramma di FL1 (c).
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4.2. Fase 1: monitoraggio in campo
La fase in campo è iniziata il 9 maggio 2019 e terminata il 30 settembre 2019. Durante questo periodo BactoSense® è stato installato lungo una rete di distribuzione in una casetta dell’acqua, dove è presente uno spillamento dalla rete con flussaggio continuo. Le analisi sono state svolte in automatico con frequenza bi-oraria. Durante il periodo di installazione sono stati esaminati 1423 campioni. Dal 5 giugno al 24 settembre 2019 è stato anche effettuato un monitoraggio che ha previsto la raccolta e l’analisi microbiologica di 98 campioni. Tali campioni sono stati prelevati contemporaneamente alle letture della sonda BactoSense® per permettere la confrontabilità delle misure.
Il prelievo dei campioni è stato effettuato con recipienti da 500 ml sterili. I campioni appena prelevati sono stati riposti in una borsa frigo e portati in laboratorio in modo che tra il momento del prelievo e l’esecuzione delle analisi microbiologiche non passassero più di 6 h. Nel caso dei prelievi delle 18:30 i tempi sono stati più lunghi, comunque mai superiori alle 24 h, e il campione è stato conservato in frigorifero a 4 °C. In laboratorio si sono svolte analisi per E. coli, enterococchi, P. aeruginosa, coliformi totali, HPC psicrofila e mesofila. Dopo il primo mese si è deciso di continuare solo con le due HPC e P. aeruginosa. Nei primi due mesi i campioni sono stati inoltre caratterizzati misurando pH e conducibilità.
Gli orari e i giorni di campionamento sono stati decisi in base ai risultati di un modello di rete sviluppato da Gruppo CAP. Tale modello fornisce misure di portata, pressione e sforzo di taglio, con intervallo di tre minuti, in tre punti in prossimità della casetta (Figura 4.3). Il modello è stato calibrato con i dati di input e output di portata e pressione degli impianti e delle interconnessioni, misurati nella settimana dal 18/3/19 al 25/3/19. Nella decisione finale si è tenuto conto inoltre degli orari di apertura del laboratorio e dei tempi di incubazione dei batteri, che si riflettono sui giorni di conta delle piastre.
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Figura 4.3 Rappresentazione della casetta e dei punti del modello di rete.
In base alle analisi dei dati forniti dal modello nel punto 2, rappresentati visivamente nei boxplot in Figura 4.4, si è deciso di campionare sia in giorni lavorativi che il sabato (si nota una maggiore variabilità nei valori di sforzo di taglio il sabato). Per quanto riguarda gli orari si sono scelti i seguenti orari:
• 8:30, orario corrispondente a un massimo nei valori di pressione;
• 10:30, orario corrispondente a un picco nei valori di portata e sforzo di taglio; • 12:30, orario rappresentativo delle condizioni pomeridiane.
Dal 5 agosto si è deciso di introdurre un nuovo orario di campionamento serale, le 18:30.
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Figura 4.4 Boxplot giornaliero (a,c,e) e orario (b,d,f) di pressione (a,b), portata (c,d) e sforzo di taglio (e,f) forniti dal modello di rete nel punto 2 di figura 4.3. In rosso si evidenzia l’anomalia nel valore di sforzo di taglio
del sabato, il picco di pressione delle 8:30 e i picchi di portata e sforzo di taglio delle 10:30.
4.3. Fase 2: Validazione in laboratorio
Il 10 ottobre la sonda BactoSense® è stata spostata presso il Centro Ricerche “Salazzurra” di CAP, per iniziare la fase di validazione in laboratorio.
Innanzitutto sono state effettuate e confrontate letture BactoSense® preliminari con sola acqua Milli-Q® (microfiltrata con membrana da 0,22 µm)e acqua Milli-Q® sterilizzata, da cui è emerso la non necessità di sterilizzazione, in quanto la differenza tra le TCC delle due letture era inferiore a 1000 cell/ml (limite di quantificazione della sonda), come mostrato in Figura 4.5.
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Figura 4.5 Fingerprint dell'acqua MilliQ® (a) e dell'acqua sterile (b).
Successivamente, l’acqua di rete è stata prelevata nello stesso punto di campionamento utilizzato in Fase 1. In particolare, sono stati raccolti quattro campioni (di 5 l ciascuno) in quattro giorni diversi (18, 19, 26 e 27 novembre), in modo che sia il fingerprint dell’acqua che le THB fossero differenti, come si può notare in Figura 4.6 e dai valori di THB riportati in Tabella 4.2.
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Tabella 4.2 THB dei quattro campioni di acqua di rete prelevati in Fase 2.
Questa fase della sperimentazione ha previsto l’utilizzo di tre differenti ceppi batterici: E. coli, E. faecalis e P. aeruginosa. Nel laboratorio erano presenti tre culture batteriche di tali ceppi, denominate “colture madre”. Tali colture erano state preparate con l’utilizzo di ceppi puri, acquistati dall’azienda Microbiologics®, in forma di pellets liofilizzati (LYFO DISK™). I ceppi utilizzati sono Escherichia coli (ATCC® 25922™), Enterococcus faecalis (ATCC® 29212™) e Pseudomonas
aeruginosa (ATCC® 27853™). Sia il ceppo di E. coli che quello di P. aeruginosa
contengono due tipi diversi di colonie che si differenziano per grandezza e forma. Il brodo colturale è stato preparato a partire dal terreno in polvere Nutrienth Broth, commercializzato da Biolife S.r.l.
Sono state confrontate le letture BactoSense® di acqua Milli-Q® addizionata con la stessa coltura batterica in giorni diversi, da cui si è deciso di coltivare un nuovo ceppo per ogni giorno di prova, in modo che la coltura batterica durante l’aggiunta fosse sempre nella fase di crescita stazionaria. Per ogni prova è stato quindi preparato un nuovo matraccio contenente il brodo colturale nel quale i batteri della coltura madre sono stati inoculati con un’ansa sterile. Ogni matraccio è stato posto in incubatore a 37 °C per 24 h per permettere la crescita batterica. Al termine delle 24 h il matraccio è stato raffreddato e utilizzato. Una volta terminata la prova, il brodo è stato disinfettato e smaltito. La concentrazione effettiva di E. coli, E. faecalis e P. aeruginosa in ogni brodocoltura è stata identificata tramite conte su piastra. L’acqua Milli-Q® è stata addizionata con ceppi batterici puri di E. coli, E. faecalis e
P. aeruginosa. L’acqua di rete è stata addizionata con solo E. coli.
THB 22 °C THB 37 °C THB 22 °C 7 d THB 37 °C 7 d Concentrazione ceppo
[UFC/ml] [UFC/ml] [UFC/ml] [UFC/ml] [106UFC/ml]
1° prova 2 6 26 11 430
2° prova 2 5 24 9 270
3° prova 32 7 131 12 380
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In Tabella 4.3 sono riportati il numero di prove, di repliche e di letture BactoSense® totali effettuate per ogni aggiunta, sia in acqua Milli-Q® che in acqua di rete. Le repliche sono avvenute a distanza di circa 7 h l’una dall’altra; durante questo tempo i campioni sono stati conservati in frigorifero. Inoltre, per ogni prova è stata effettuata una lettura aggiuntiva di sola acqua non addizionata, quindi di sola Milli-Q® o di sola acqua di rete.
Tabella 4.3 Numero di prove per ogni ceppo effettuate nella fase di laboratorio.
4.4. Metodi di analisi dei parametri microbiologici in laboratorio
Per la raccolta e l’analisi microbiologica dei campioni sono state seguite le procedure descritte nel volume terzo del manuale “Metodi Analitici per le Acque” (APAT, Rapporti 29/2003, ISBN 88-448-0083-7).
Ceppi utilizzati: E. faecalis P. aeruginosa E. Coli
N° di prove 2 2 5
N° di diluizioni per prova
(1:103, 1:104, 1:105 e 1:106) 4 4 4
N° di repliche per prova 2 2 2
Letture totali 16 16 40
Ceppi utilizzati: N° di prove N° di diluizioni per prova (1:103, 1:104, 1:105 e 1:106)
N° di repliche per prova Letture totali 2 32 Acqua MilliQ Acqua di rete E. Coli 4 4
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In Tabella 4.4 sono riportate le metodiche ufficiali e i materiali utilizzati in laboratorio per la rivelazione dei microorganismi.
La presenza dei microorganismi indicatori (E. Coli, enterococchi, coliformi totali e P.
aeruginosa), è stata rilevata tramite conta in piastra, con il metodo delle membrane
filtranti, che permette di contare le colonie, cresciute su una membrana, prodotte dai microrganismi presenti in un campione di acqua (Figura 4.7). La conta dei batteri eterotrofi (THB), sia psicrofila che mesofila, è stata effettuata tramite HPC, che permette di rilevare un gruppo eterogeneo di microrganismi aerobi che hanno differenti capacità metaboliche e richieste nutrizionali. Per ogni indicatore è stata effettuata solo una replica, mentre per ogni HPC sono state effettuate due repliche, la concentrazione finale è una media delle due.
Il numero di colonie ottenuto è riportato come “Unità Formante Colonia” su 100 ml d’acqua per E. coli, coliformi totali e enterococchi, su 250 ml per P. aeruginosa e su 1 ml di acqua per le THB.
Le misure di pH e conducibilità sono state effettuate rispettivamente con la metodica 2060 IRSA-CNR e 2030 IRSA-CNR.
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Tabella 4.4 Metodi, strumenti e prodotti utilizzati nelle conte batteriche in laboratorio.
4.5. Trattamento dei dati
4.5.1. Analisi dei dati citometriciI dati citometrici sono stati analizzati con il software RStudio e con Cytoflow.
Prima di iniziare le analisi è stato di fondamentale importanza stabilire i gate che isolassero le cellule da tutto ciò di non vivente che emette fluorescenza. Durante la prima fase della sperimentazione si è scelto di estrarre 10 letture casuali e identificare visivamente i limiti sui grafici della fluorescenza (grafico FL1-FL2 che identifica il fingerprint dell’acqua) con il miglior adattamento per le 10 situazioni
Volume d'acqua utilizzato Temperatura di incubazione Tempo di incubazione Terreno di
coltura Piastre Metodica
[ml] [°C] E. Coli 100 44 24 h Tryptone bile x-glucuronide agar (TBX) Petri sterili Ø 55 mm 6020B IRSA-CNR Coliformi totali 100 37 48 h m-LES Endo Agar Petri sterili Ø 55 mm 6020B IRSA-CNR Enterococchi 100 37 48 h Slanetz Bartley agar base (ISO) Petri sterili Ø 55 mm 6020B IRSA-CNR P. aeruginosa 250 37 48 h Pseudomona s Agar Base Petri sterili Ø 55 mm 6020B IRSA-CNR 72 h 7d 48 h 7 d Petri sterili Ø 90 mm 7050 IRSA-CNR 7050 IRSA-CNR HPC psicrofila 1 22
HPC mesofila 1 37 Plate Count Agar - PCA Plate Count Agar - PCA
Petri sterili Ø 90 mm
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(Props et al., 2016). In Figura 4.8 è rappresentata una delle 10 letture utilizzate con il gate scelto (chiamato GateTCC). Le coordinate dei quattro punti sono (FL1 e FL2):
• Punto 1: (3,9 ; 1) • Punto 2: (3,9 ; 3.4) • Punto 3: (6,8 ; 1) • Punto 4: (6,8 ; 6,5)
Figura 4.8 Rappresentazione del GateTCC sul grafico FL1-FL2.
Successivamente è stato deciso il limite che divide le cellule ad alto contenuto di acido nucleico da quelle a basso contenuto di acido nucleico (chiamato GateHNA/LNA). Anche in questo caso sono state scelte 10 misure casuali e sulla base del grafico che rappresenta la densità di FL1, si è cercato il minimo tra i due picchi (Figura 4.9a). La soglia finale è stata calcolata come la media dei dieci minimi. Tale soglia deve inoltre dividere chiaramente i due raggruppamenti che si creano sul grafico FL1-SSC (Figura 4.9b). Per verificare che il GateHNA/LNA si adattasse a tutti i mesi di sperimentazione si sono osservati i grafici di quattro misure casuali per ogni mese (Figura 4.10).
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Figura 4.9 Grafico della densità di FL1 (a) e grafico FL1-SSC (b).
Figura 4.10 Grafico delle densità di FL1 nei mesi di maggio (a), giugno (b), luglio (c), agosto (d), settembre (e).
Una volta stabiliti i due gate, è stato possibile estrarre i valori di TCC, %HNA, HNAC e SSC medio, sia per il gruppo LNA (SSC_LNA) che per il gruppo HNA (SSC_HNA). Nella fase 2 del lavoro è stato necessario definire tre tipi diversi di gate. Questi sono stati individuati nelle prove con acqua Milli-Q® addizionata con E. coli e sono stati poi utilizzati per l’analisi delle letture con acqua di rete addizionata di E. coli. Il primo,
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il GateTCC, che rappresenta la conta di cellule totali, includendo quindi sia le cellule vive che quelle morte o non attive eventualmente presenti nella coltura, è stato costruito visivamente sui grafici FL1-FL2 dell’acqua Milli-Q®, in modo da escludere il rumore di fondo dovuto a particolato o a frammenti di cellule (Figura 4.11).
Figura 4.11 Fingerprint di acqua MilliQ® con rappresentazione di GateTCC.
Gli altri due gate sono stati costruiti per isolare al meglio le cellule di E. coli, cercando quindi di delimitare l’area nel grafico FL1-FL2 nella quale si posizionano. Dai fingerprint delle prove con acqua Milli-Q® addizionata con E. coli, è stato possibile identificare due gate in base alla percentuale di cellule da racchiudere all’interno. Le due percentuali scelte sono state il 70% e il 30% (Figura 4.12), che identificano il Gate70 e il Gate30.
Una volta definiti i gate è stato possibile estrarre il numero di cellule al loro interno, ottenendo quindi tre conte per ogni prova. Nel caso di analisi con acqua microfiltrata a tali conte sono state sottratte quelle della sola acqua MilliQ®, in modo da togliere l’eventuale rumore di fondo.
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Figura 4.12 Fingerprint di acqua MilliQ® addizionata con E. coli con rappresentazione di GateTCC (il trapezio) Gate70 (a) e Gate30 (b).
4.5.2. Test statistici effettuati
L’analisi statistica dei dati è stata condotta utilizzando Microsoft® Excel e R studio. È stato effettuato il test di Shapiro per verificare la normalità in ogni campione di dati e il test di Levine per verificare l’omoschedasticità delle varianze. Nel caso di varianze omogenee è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis e a posteriori il test di Dunn sulle medie. Nel caso di varianze non omogenee è stato utilizzato il test di Welch e a posteriori il test di Conover sulle mediane. Il livello di significatività α è stato fissato al 5% per tutti i test. Nei test a post hoc per l’aggiustamento del p-value è stato utilizzato il metodo Bonferroni.
I coefficienti di determinazione (R2) riportati nel capitolo 5, sono tutti valori “aggiustati” (Adjusted R2). Nel caso in cui è riportato l’indice di Pearson, è stata calcolata anche la sua significatività statistica (con α=5%) tramite t-test.
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5 RISULTATI E DISCUSSIONE
Il capitolo è suddiviso in due sezioni corrispondenti alle due fasi della sperimentazione. Nella prima sezione (paragrafo 5.1) sono illustrati i risultati di laboratorio e i risultati forniti della sonda. Infine, è discusso il confronto tra le due metodologie. Nella seconda sezione (paragrafo 5.2) sono discussi i risultati della fase in laboratorio ed è analizzata la capacità della sonda di riconoscere gli indicatori patogeni.
5.1. Fase 1: monitoraggio in campo
5.1.1. Sotto-periodi stagionali e raggruppamenti orari
Per studiare la variabilità mensile delle conte batteriche e delle letture BactoSense® è stato necessario suddividere la durata della Fase 1 in sotto-periodi, come riportato in Tabella 5.1.
Tabella 5.1 Sotto-periodi della Fase 1, in relazione al prelievo di campioni per l’analisi di laboratorio e di operatività della sonda BactoSense®.
Per quanto riguarda la variabilità giornaliera è stato necessario trovare intervalli orari che rispecchiassero le diverse condizioni idrauliche durante la giornata. Basandosi sul modello di richiesta d’acqua giornaliero a Milano, proposto da Candelieri (2017), rappresentato in Figura 5.1, sono stati individuati 6 raggruppamenti orari significativi di diverse condizioni di portata nella rete:
Laboratorio BactoSense® Primavera - 9 maggio - 31 maggio
Inizio estate 5 giugno - 20 giugno 1 giugno - 24 giugno
Estate 25 giugno - 20 agosto 25 giugno - 20 agosto
37 • Prima mattina (06 - 09) • Mattina (09 - 11) • Orario di pranzo (11 - 14) • Pomeriggio (14 - 19) • Orario di cena (19 - 21) • Sera (21 - 23) • Notte (23 - 06)
Figura 5.1 Andamento medio giornaliero della richiesta d’acqua per le diverse stagioni (adattata da Candalieri, 2017). Le linee continue rappresentano gli andamenti nei giorni lavorativi, quelle tratteggiate nei giorni festivi.
Le linee rosse delimitano gli intervalli orari scelti per l’elaborazione dei dati raccolti in Fase 1.
5.1.2. Monitoraggio mediante analisi convenzionali (conta in piastra)
Nel primo mese non è stata riscontrata la presenza di enterococchi, E. coli e coliformi totali, risultato atteso nel monitoraggio delle acque potabili (si ricorda che per il D. Lgs 31/2001 tali valori devono essere pari a 0 nelle acque destinate al consumo umano). Si è quindi deciso di non proseguire con queste analisi.
Sebbene non se ne fosse riscontrata la presenza, si è deciso di continuare a monitorare P. Aeruginosa. Infatti, come riportato nel paragrafo 2.2, P. Aeruginosa è un batterio biofilm-formatore e quindi può essere indicatore del distacco di biofilm.
