Stato dell’arte e obiett

L’obiettivo del presente lavoro consiste nello sviluppo di una metodica RP-HPLC finalizzata alla determinazione delle vitamine idrosolubili presenti in forma libera nel miele. Dai pochi dati attualmente disponibili in letteratura si evince infatti che esse siano le uniche presenti, ancorché in concentrazioni non certo elevate, in tale matrice. La loro origine pare essere di natura pollinica. Infatti le vitamine riscontrabili nel miele sono le stesse che, in concentrazioni ben più elevate, sono riscontrabili anche nei granuli pollinici. A testimonianza di ciò, alcuni studi hanno dimostrato che operazioni di filtrazione del miele determinano un corrispondente decremento del contenuto vitaminico118_{. Per}

quanto riguarda la determinazione analitica delle vitamine nel miele la letteratura scientifica offre realmente pochissimi spunti. In particolare possiamo affermare che a oggi le vitamine sono state determinate in tale alimento attraverso metodi microbiologici119_,

titrimetrici (per il solo acido ascorbico120_{), e cromatografici (per l’acido ascorbico}121,122 _e

117 _{Woolard D.C., Indyk H.E., J AOAC Int 85, 945-951, (2002)}

118 _{Haydak M.H., Palmer L.S., Tanquary C., Vivino E., Journal of Nutrition, 319-320, (1943)} 119 _{Kitzes G., Schuette A., Elvehjem A., Journal of Nutrition, 241-250, (1943)}

120 _{Matei N., Birghila S., Dobrinas S., Capota P., Acta Chim. Slov., 51, 169-175, (2004)}

121 _{Castro R.N., Azeredo L. C., Azeredo M.A.A., de Sampaio C.S.T., J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 24 (7), 1015-}

Marco Ciulu-Sviluppo e applicazione di metodi cromatografici per la determinazione quali-quantitativa di costituenti minoritari di prodotti d’alveare-Tesi di dottorato in Scienze e tecnologie chimiche-Università degli studi di Sassari

per la riboflavina123 _{). Non è al momento disponibile alcun contributo scientifico relativo}

alla determinazione simultanea delle vitamine in questa matrice. Il metodo proposto permette la quantificazione di sei diverse vitamine idrosolubili: acido ascorbico, tiamina, riboflavina, acido nicotinico, acido pantotenico e acido folico124_.

8.3.2 Campioni

Per lo studio da noi svolto, sono stati presi in esame 28 campioni di miele di diverse origini botaniche e geografiche. I campioni sardi sono stati ottenuti direttamente da apicoltori e sempre conservati, subito dopo l’invasettamento, in assenza di luce e ad una temperatura costante di 4°C; analogo destino hanno subito dopo l’acquisto, anche alcuni campioni commerciali (mieli di acacia) reperiti in negozi della zona. Prima di ciascuna determinazione analitica, tutti i campioni sono stati sottoposti ad omogeneizzazione mediante mixer Ultra-turrax T18. Le soluzioni sottoposte ad analisi cromatografica sono state preparate secondo la seguente procedura:

- si pesano accuratamente 10 g di miele e si solubilizzano in 5 mL di acqua ultrapura; - si aggiungono 1 mL di NaOH 2 M e 12.5 mL di tampone fosfato 1 M;

- si porta a volume a 25 mL con acqua ultrapura e si conserva al buio in un bagno acqua/ghiaccio.

122 _{Gheldof N., Wang X., Engeseth N. J., J. Agric. Food Chem., 50, 5870-5877, (2002)}

123 _{] Vinas P., Balsalobre N., Lopez-Erroz C., Hernandez-Cordoba M., J. Agric. Food Chem., 52, 1789-1794, (2004)} 124 _{Solinas S., Tesi di laurea specialistica in Chimica, Dipartimento di Chimica, Università degli studi di Sassari (A.A.}

8.3.3 Analisi RP-HPLC

Stante la pressoché totale assenza in letteratura di metodi analitici per la determinazione simultanea di vitamine libere in mieli, è stato inizialmente preso in considerazione un metodo cromatografico proposto per la determinazione di vitamine idrosolubili in integratori125_{. Si tratta di un metodo diretto, a fase inversa, con rivelazione UV che fa uso}

di una colonna C18. Il metodo prevede l’impiego di diverse lunghezze d’onda per

ottimizzare la risposta del detector in funzione delle diverse caratteristiche chimiche degli analiti. E’ stata quindi verificata l’applicabilità delle condizioni riportate dal lavoro di Heudi agli standard scelti per il nostro studio utilizzando la strumentazione da noi in possesso. Nelle condizioni operative suggerite in tale lavoro è stata constatata la separazione dei sei analiti da noi prescelti a livello della linea di base. La successiva procedura di ottimizzazione del metodo ha riguardato: a) la scelta delle lunghezze d’onda (254 nm per acido ascorbico, acido nicotinico e tiamina; 210 nm per acido pantotenico, acido folico e riboflavina), b) il flusso e c) la durata totale della corsa.

La seconda fase del lavoro ha riguardato il trasferimento del metodo a campioni reali di miele. Sono stati quindi acquisiti i cromatogrammi delle soluzioni di miele ottenute eseguendo iniezioni di soluzioni di miele ottenute con la procedura descritta nel paragrafo precedente, attraverso opportuni filtri in PVDF, e si è proceduto con l’identificazione delle sei vitamine tramite aggiunte di aliquote di soluzioni a concentrazione nota di standard. Il programma di eluizione è stato ottimizzato al fine di ottenere per ciascuna della vitamine un picco perfettamente risolto a livello della linea di base. Le condizioni operative finali sono riportate in Tabella 8.1.

Marco Ciulu-Sviluppo e applicazione di metodi cromatografici per la determinazione quali-quantitativa di costituenti minoritari di prodotti d’alveare-Tesi di dottorato in Scienze e tecnologie chimiche-Università degli studi di Sassari

Tabella 8.1 Condizioni operative finali

RP-HPLC

Strumento Perkin Elmer Series 200 Pump

Loop di Campionamento 20 µL

Colonna C18 Alltima C18 5 µm (4.6 mm x 20 mm)

Precolonna Alltima C₁₈ (4.6 mm x 20 mm)

Rivelatore UV-Vis

Perkin-Elmer Series 200 UV-Vis λ = 254 nm da 0 a 11 min λ = 210 nm da 11 a 22 min

Eluenti A = Acido trifluoroacetico, TFA, 0.025% (v/v) in Acqua B = Acetonitrile

Sistema di eluizione in gradiente

A/B = 100/0 per 5 min A/B = 75/25 in 6 min A/B = 55/45 in 8 min A/B = 60/40 per 1 min A/B = 100/0 in 2 min

Durata totale 22 min

Flusso 1 mL min-1

Le condizioni relative al metodo finale riportato in tabella, hanno permesso di ottenere picchi completamente risolti per tutte le vitamine da noi prese in considerazione e che è stato possibile quantificare. In figura 8.17 è riportato il cromatogramma di una miscela di standard a 50 ppm mentre in figura 8.18, è riportato il cromatogramma di un campione di miele di eucalipto analizzato con le condizioni del metodo finale.

Figura 8.17 Cromatogramma di un mix di standard a 50 ppm

Figura 8.18 Cromatogramma di un campione di miele di eucalipto

Il cromatogramma riportato in figura 8.18 evidenzia l’assenza del picco relativo alla tiamina: tale situazione è peraltro comune a tutti i campioni da noi analizzati nello studio.